Summary
Presentamos un protocolo para medir la dependencia del campo magnético del tiempo de relajación de la celosía de espín de 13compuestos enriquecidos con C, hiperpolarizados mediante polarización nuclear dinámica, utilizando relaxometría rápida de ciclo de campo. Específicamente, lo hemos demostrado con [1-13C]pyruvate, pero el protocolo podría extenderse a otros sustratos hiperpolarizados.
Abstract
El límite fundamental para las aplicaciones de imágenes in vivo de compuestos enriquecidos con 13C hiperpolarizados son sus tiempos de relajación finita de celosía de espía. Varios factores afectan las tasas de relajación, como la composición del tampón, el pH de la solución, la temperatura y el campo magnético. En este último aspecto, el tiempo de relajación de la celosía de espín se puede medir en las fortalezas clínicas del campo, pero en los campos más bajos, donde estos compuestos se dispensan desde el polarizador y se transportan a la RMN, la relajación es aún más rápida y difícil de medir. Para tener una mejor comprensión de la cantidad de magnetización perdida durante el transporte, utilizamos relajaometría rápida de ciclismo de campo, con detección de resonancia magnética de 13núcleos C a 0,75 T, para medir la dispersión de la resonancia magnética nuclear de la tiempo de relajación de la celosía de la hiperpolarización [1-13C]piruvato. La polarización nuclear dinámica de disolución se utilizó para producir muestras hiperpolarizadas de piruvato a una concentración de 80 mmol/L y pH fisiológico (7,8). Estas soluciones se transfirieron rápidamente a un relajantemetro de ciclo de campo rápido para que la relajación de la magnetización de la muestra pudiera medirse en función del tiempo utilizando un ángulo de volteo pequeño calibrado (3o-5o). Para mapear la dispersión T1 del C-1 de piruvato, registramos datos para diferentes campos de relajación que oscilan entre 0.237 mT y 0.705 T. Con esta información, determinamos una ecuación empírica para estimar la relajación de la celosía de espín del sustrato hiperpolarizado dentro del rango mencionado de campos magnéticos. Estos resultados se pueden utilizar para predecir la cantidad de magnetización perdida durante el transporte y para mejorar los diseños experimentales para minimizar la pérdida de señal.
Introduction
Las imágenes espectroscópicas de resonancia magnética (MRSI) pueden producir mapas espaciales de metabolitos detectados por imágenes espectroscópicas, pero su uso práctico a menudo está limitado por su sensibilidad relativamente baja. Esta baja sensibilidad de los métodos de espectroscopia y imágenes por resonancia magnética in vivo se deriva del pequeño grado de magnetización nuclear alcanzable a temperaturas corporales y a las intensidades razonables del campo magnético. Sin embargo, esta limitación puede superarse mediante el uso de polarización nuclear dinámica (DNP) para mejorar en gran medida la magnetización in vitro de sustratos líquidos, que posteriormente se inyectan en la sonda in vivo metabolismo utilizando MRSI1,2 , 3 , 4. DNP es capaz de mejorar la magnetización de la mayoría de los núcleos con espín nuclear no cero y se ha utilizado para aumentar la sensibilidad IN vivo MRSI de 13compuestos enriquecidos con C como el piruvato5,6, bicarbonato 7,8, fumarato9, lactato10, glutamina11, y otros por más de cuatro órdenes de magnitud12. Sus aplicaciones incluyen imágenes de enfermedad vascular13,14,15, perfusión de órganos13,16,17,18, cáncer detección1,19,20,21,22, estadificación tumoral23,24, y cuantificación de la respuesta terapéutica2 , 6 , 23 , 24 , 25 , 26.
La relajación lenta de la celosía de giro es esencial para la detección in vivo con MRSI. Los tiempos de relajación de la celosía de giro(T1s) en el orden de decenas de segundos son posibles para núcleos con relaciones giromagnéticas bajas dentro de moléculas pequeñas en solución. Varios factores físicos influyen en la transferencia de energía entre una transición de giro nuclear y su entorno (celosía) que conduce a la relajación, incluyendo la fuerza del campo magnético, la temperatura y la conformación molecular27. La relajación dipolar se reduce en moléculas para posiciones de carbono sin protones directamente unidos, y la deuteración de los medios de disolución puede reducir aún más la relajación dipolar intermolecular. Desafortunadamente, los disolventes deuterados tienen capacidades limitadas para extender la relajación in vivo. El aumento de la relajación de los carbonilos o ácidos carboxílicos (como el piruvato) puede ocurrir a altas fortalezas del campo magnético debido a la anisotropía de cambio químico. La presencia de impurezas paramagnéticas de la trayectoria del fluido durante la disolución después de la polarización puede causar una rápida relajación y debe evitarse o eliminarse con quelantes.
Existen muy pocos datos para la relajación de 13compuestos que contienen C en campos bajos, donde la relajación de la celosía de centrifugado podría ser significativamente más rápida. Sin embargo, es importante medir T1 en campos bajos para entender la relajación durante la preparación del agente utilizado para la toma de imágenes in vivo, ya que los agentes de contraste hiperpolarizados generalmente se dispensan del aparato DNP cerca o en la tierra de la Tierra Campo. Factores físicos adicionales como la concentración de sustrato enriquecido con 13C, el pH de la solución, los tampones y la temperatura también influyen en la relajación, y por lo tanto tienen un efecto en la formulación del agente. Todos estos factores son esenciales en la determinación de parámetros clave en la optimización del proceso de disolución dNP, y el cálculo de la magnitud de la pérdida de señal que se produce en el transporte de la muestra desde el aparato DNP al imán de imagen.
Las mediciones de dispersión de resonancia magnética nuclear (NMRD), es decir, las mediciones T1, en función del campo magnético, normalmente se adquieren utilizando un espectrómetro de RMN. Para adquirir estas mediciones, se podría utilizar un método de cierre donde la muestra se lanza por primera vez fuera del espectrómetro para relajarse en algún campo determinado por su posición en el campo marginal del imán28,29,30 y luego se transfirió rápidamente de nuevo al imán de RMN para medir su magnetización restante. Al repetir este proceso en el mismo punto en el campo magnético pero con períodos crecientes de relajación, se puede obtener una curva de relajación, que luego se puede analizar para estimar T1.
Utilizamos una técnica alternativa conocida como relaxometría rápida de ciclismo de campo31,32,33 para adquirir nuestros datos NMRD. Hemos modificado un relajantemetro comercial de ciclismo de campo (ver Tabla de Materiales),para mediciones T1 de soluciones que contienen núcleos hiperpolarizados de 13C. En comparación con el método de transporte, el ciclismo de campo permite a este relajante adquirir sistemáticamente datos De RMN en una gama más pequeña de campos magnéticos (0,25 mT a 1 T). Esto se logra cambiando rápidamente el campo magnético en sí, no la ubicación de la muestra en el campo magnético. Por lo tanto, una muestra puede ser magnetizada a una alta fuerza de campo, "relajada" a una fuerza de campo más baja, y luego medida por la adquisición de un decaimiento de inducción libre en un campo fijo (y la frecuencia Larmor) para maximizar la señal. Esto significa que la temperatura de la muestra se puede controlar durante la medición, y la sonda NMR no necesita ser sintonizada en cada campo de relajación promoviendo la adquisición automática en todo el rango de campo magnético.
Centrando nuestros esfuerzos en los efectos de la dispensación y el transporte de las soluciones hiperpolarizadas en campos magnéticos bajos, este trabajo presenta una metodología detallada para medir el tiempo de relajación de la celosía de espín de hiperpolarizado 13C-pyruvate usando rápido relaxometría de campo para campos magnéticos en el rango de 0,237 mT a 0,705 T. Los principales resultados del uso de esta metodología se han presentado previamente para [1-13C]piruvato34 y 13C-enriquecido sódico y bicarbonato de cesio35 donde otros factores como la concentración radical y el pH de disolución han también se han estudiado.
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Protocol
1. Preparación de muestras
NOTA: Los pasos 1.1-1.8 se realizan una sola vez
- Preparar 1 mL de stock 13Solución de ácido piruvico enriquecido con C, ampliamente utilizado para la investigación in vivo 1,2,5,6, que consiste en 15-mmol/L de triarylmethyl radical disuelto en [1- 13 C]ácido piruvico (ver Tabla de Materiales). Las alícuotas de esta solución de stock se utilizarán para las muestras que se polarizarán individualmente y posteriormente se someterán a relaxometría en diferentes campos magnéticos. En la Figura 1se muestra una representación de la molécula de ácido piruvico [1-13C].
- En la interfaz del software del polarizador nuclear dinámico (ver Tabla de materiales), haga clic en el botón Enfriamiento para bajar la temperatura del inserto de temperatura variable (VTI) a 1,4 K.
- Una vez que el DNP haya alcanzado la temperatura deseada, cargue 10 ml de la solución de stock en una taza de muestra, abra las puertas de la torreta e inserte la copa en el VTI utilizando una varita de inserción diseñada específicamente para esta tarea.
- Después de eso, extraiga rápidamente la varita y asegúrese de que la taza se libera. A continuación, cierre las puertas de la torreta y continúe con los siguientes pasos mientras la temperatura del VTI vuelve a 1,4 K.
- Prepare el DNP para ejecutar un barrido de microondas con el fin de encontrar la frecuencia de RF óptima para la hiperpolarización de la solución de stock.
- En el ordenador que controla el espectrómetro (parte del sistema DNP), establezca la comunicación entre el espectrómetro y el software de control DNP haciendo doble clic en el icono de HyperTerminal, previamente configurado con la comunicación en serie adecuada Parámetros.
- Una vez establecida la comunicación, inicie el software RINMR, escriba en su línea de comandos . HYPERSENSENMRy, a continuación, pulse Intro.
- Después de eso, se mostrará una nueva ventana en la pantalla y en ella escriba el número uno (1) en el campo Número de configuración. A continuación, haga clic en el botón Seleccionar configuración.
- Haga clic en el botón Hacer barrido de microondas. Se lanzará una pequeña ventana con un contador descendente de segundos que indica que el espectrómetro está listo y estará esperando señales de disparo periódicas, procedentes del software de control DNP, para muestrear la polarización.
- En el software de control DNP, seleccione la pestaña Calibrar y haga clic en el botón Generar.
- Usando la ventana de configuración de calibración, ingrese la siguiente información: Frecuencia de inicio a 94.117 GHz, Frecuencia de finalización a 94.137 GHz, Tamaño del paso 1 MHz, Duración del paso a 300 s, Potencia a 50 mW, Nivel de helio líquido a 65%, y Temperatura a 1,4 K.
- Haga clic en el botón Generar, que cerrará la ventana de configuración y volverá a la pestaña Calibrar que mostrará el número de pasos y el tiempo necesario para realizar el barrido de microondas deseado.
- Una vez alcanzada la temperatura VTI deseada, haga clic en el botón Habilitar y, a continuación, en Iniciar para inicializar el proceso de barrido de microondas.
- Al final del barrido de microondas, recupere la muestra y registre la frecuencia óptima donde se logra la polarización máxima. Esta frecuencia óptima se define como la frecuencia de polarización que proporciona la polarización máxima tal y como se muestra en del cuadro 2. Esta frecuencia se utilizará para hiperpolarizar todas las alícuotas obtenidas de esa solución específica de ácido piruvico.
- Preparar 250 ml de medio de disolución de stock utilizando una solución de base Tris de 40 mmol/L, 50 mmol/L de cloruro sódico y hidróxido sódico de 80 mmol/L en agua desionizada. Añadir ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) a una concentración de 100 mg/L para secuestrar cualquier contaminación de iones metálicos. Al igual que la solución de material de ácido piruvico, este medio de disolución se utilizará para todas las diferentes muestras que se polarizarán. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles más específicos sobre los productos químicos utilizados.
- Además, prepare 500 ml de solución de limpieza de material que consista en 100 mg/L EDTA disuelto en agua desionizada. Aproximadamente 10 ml de esta solución de limpieza se utiliza después de cada polarización para limpiar la trayectoria de disolución del DNP.
NOTA: Los pasos 1.9-1.27 se realizan para cada muestra individual. - Enfríe el aparato DNP a 1,4 K en preparación de hiperpolarizing una muestra de ácido [1-13C]piruvico pulsando el botón de enfriamiento en la ventana principal de DNP.
- Si el software utilizado para el espectrómetro ya está activo con la configuración 1 seleccionada, siga estos pasos. De lo contrario, realice los pasos 1.5.1 a 1.5.3 y, a continuación, continúe con los pasos siguientes.
- Después de verificar que la configuración 1 está seleccionada en la ventana que controla el espectrómetro del DNP, haga clic en el botón Solid Build Up.
- Escriba el nombre de archivo SSBuilupXXX, donde "XXX" es un número en la secuencia de archivos almacenados con datos de acumulación. Este número se incrementa automáticamente por el software. A continuación, haga clic en Aceptar. De forma similar a la caja de barrido de microondas, se lanzará una pequeña ventana con un contador descendente de segundos que indica que el espectrómetro está listo y estará esperando señales de disparo periódicas, procedentes del software de control DNP, para muestrear la polarización .
- Utilizando la solución de material de ácido piruvico - OX063 preparada en el paso 1.1, pesar 30 mg en una taza de muestra.
- Cuando se alcanza la temperatura VTI deseada (1,4 K), haga clic en Insertar muestra,luego seleccione Muestra normal y, a continuación, haga clic en Siguiente. Siguiendo las precauciones de seguridad mostradas en la pantalla, inserte la copa en el aparato DNP frío, utilizando una varita larga diseñada específicamente para esta tarea.
- Una vez insertada la copa, la varita se ha quitado y las puertas DNP se cierran, haga clic en Siguiente y, a continuación, en Finalizar. En ese momento, el sistema hiperpolarizador baja la copa de la muestra a la cámara de irradiación parcialmente llena (65%) con helio líquido.
- Espere hasta que la temperatura haya vuelto a 1.4K y luego haga clic en el botón Polarización de muestra.
- En la nueva ventana emergente, establezca el valor de frecuencia en el obtenido del barrido de microondas en el paso 1.6. En la misma ventana, también establezca la potencia en 50 mW y el tiempo de muestreo en 300 s. Haga clic en Siguiente, marque la casilla Habilitar supervisión de acumulación y, a continuación, haga clic en Finalizar.
NOTA: Una vez iniciada la polarización, el software de control DNP genera señales de disparo cada 300 s para indicar al espectrómetro que muestree la polarización utilizando un pequeño ángulo de punta. De esa manera, el software del espectrómetro añade un punto de muestra a una curva de magnetización de estado sólido, que ahora se muestra tanto en el software del espectrómetro como en el software de control DNP bajo la pestaña Polarization Build-Up. Después de la 4a muestra y cada muestra después de eso, el software del espectrómetro ajusta la curva a una función de crecimiento exponencial de la forma:
S - A *exp(-t/Tp) + y0
donde A es la amplitud de polarización, en unidades arbitrarias, t es el tiempo de muestreo, Tp es la constante de tiempo de polarización (ambos en segundos), y y0 es un desplazamiento. Sobre la base de los parámetros ajustados, el software también calcula el porcentaje de polarización alcanzado hasta ese momento en el tiempo, que también se muestra en la pestaña Estado de polarización del DNP. - Polarizar hasta que la acumulación de la magnetización de estado sólido alcance al menos el 95% del máximo (aproximadamente una hora).
- Mientras la muestra se está polarizando, prepare el Relajantemeter De campo rápido como se explica en la Sección 2 a continuación.
- Cuando se logra la polarización deseada, haga clic en Ejecutar disolución y en Método, seleccione Prueba de ácido pyruvo. A continuación, haga clic en Siguiente.
- Siguiendo las instrucciones de la pantalla, abra las puertas de la torreta DNP y cargue la cámara de calefacción y presurización en la parte superior del aparato con 4,55 ml del medio de disolución preparado en la sección 1.5 para producir una concentración de piruvato de 80 mmol/L sobre disolución a un pH de 7,75 euros y una temperatura de 37 oC.
- Coloque la varita de recuperación en la posición correcta, cierre las puertas de la torreta y, en el ordenador, haga clic en Siguiente y, a continuación, en Finalizar. En ese momento, los medios de disolución se sobrecalentarán hasta que la presión alcance los 10 bar.
- Una vez alcanzada la presión de 10 bar, el piruvato congelado e hiperpolarizado se levanta automáticamente del baño de helio líquido, se mezcla rápidamente y se descongela con el medio de disolución sobrecalentado y se expulsa a través de un tubo capilar en un matraz en forma de pera. Mientras se expulsa la mezcla hiperpolarizada de los medios de piruvato/disolución, gire constantemente el matraz para asegurar una mezcla homogénea.
- Cuando toda la mezcla haya sido expulsada, dibuje rápidamente 1,1 ml del líquido en una jeringa, transfiera a un tubo de RMN de 10 mm de diámetro precalentado (37 oC) y transporte rápidamente al relajantemetro de campo (consulte el paso 2.2.12).
- Dispensar la alícuota restante de cada disolución de piruvato en un espectrómetro de RMN de sobremesa de 0,55 T (ver Tabla de materiales)para comprobar posibles efectos experimentales sistemáticos.
- Limpie inmediatamente la trayectoria del fluido DNP utilizando un medio de disolución limpio seguido de etanol. Soplar gas helio a través de la trayectoria del fluido para eliminar los fluidos de limpieza restantes y purgar la trayectoria del oxígeno. Limpie toda la cristalería.
- Después de cada medición, registre el pH de las muestras tanto del espectrómetro superior del banco como del relajantemetro de ciclismo de campo.
NOTA: Cada medición T1 es una disolución hiperpolarizada separada del aparato DNP, por lo que se requiere cuidado para asegurar la reproducibilidad de medición a medida de la composición de la muestra. Esto se logra sopesando todos los agentes y disolventes con una precisión de 0,1 mg para asegurar una preparación precisa y reproducible de las soluciones hiperpolarizadas finales.
2. Relaxometría
NOTA Consulte la Tabla 1 para comprender mejor la selección y el uso de los diferentes parámetros descritos en los pasos siguientes. Antes de la disolución, se debe calcular el ángulo de volteo del relajanteyómetro y el relajanteómetro debe estar configurado y listo para la medición de la solución hiperpolarizada (ver más abajo).
- Calibración de ángulo de volteo
- Preparar 1 ml de ácido piruvico limpio [1-13C] en un tubo de RMN y añadir un agente de contraste de gadolinio para reducir el T1 de los núcleos de 13C a un valor de menos de 200 ms pero más de 50 ms.
- Selle el tubo de RMN para que pueda utilizarse varias veces como estándar de calibración.
- Usando el medidor de profundidad del relajanteómetro, ajuste la profundidad de inserción del tubo de RMN a la altura adecuada para asegurar que la muestra se ubicará en el centro de la bobina RF del relajanteómetro.
- Marque la profundidad de inserción del estándar de calibración de piruvato de 13C con cinta adhesiva para garantizar la repetibilidad.
- Coloque el tapón de profundidad en el tubo de RMN en la posición indicada por la cinta e inserte este estándar de calibración en el orificio del relajantemetro de ciclismo de campo. Utilice un peso para mantener el tubo de RMN en su posición.
- Abra la válvula de aire del instrumento y desde el panel frontal del relajar, ajuste el controlador de temperatura a 37 oC. Esto mantendrá la temperatura de la muestra a 37 oC (a 0,5 oC) utilizando aire caliente durante el experimento.
- Configure el hardware del relajantemeter de ciclismo de campo para adquirir señales de núcleos de 13C. Esto incluye la instalación y la energización de la bobina de la shim externa (consulte La tabla de materiales),ajustar y ajustar la bobina de RF a 8 MHz (0,75 T para los núcleos de 13C) y utilizar el cable de 4 o4 correspondiente.
- En el software del instrumento, realice los pasos siguientes:
- Seleccione la pestaña Par principal
- Haga clic en la celda junto a la etiqueta Experimento y desplácese hacia abajo en la ventana emergente para seleccionar la secuencia de pulsos "13CANGLE. FFC ".
- Establezca los siguientes parámetros de adquisición: RFA n.o 5; SWT a 0,005, RD a 0,5, BPOL a 30 MHz, TPOL a 0,5.
- Seleccione la pestaña Acq. par y, a continuación, seleccione la subpestaña Básico.
- Haga clic en la celda situada junto a la etiqueta Núcleo y desplácese hacia abajo en la ventana emergente para seleccionar 13C.
- A continuación, establezca los siguientes parámetros: SF a 8 MHz, SW a 1000000, BS a 652, FLTR a 100000, MS a 32.
- Seleccione la subpestaña Conf.
- Establezca los siguientes parámetros: RINH a 25, ACQD a 25.
- Seleccione la subpestaña nDim
- Fije NBLK a 32, BINI a 2, BEND a 62.
- Seleccione la pestaña Evaluación y, a continuación, la subpestaña Parámetros.
- Establezca los siguientes parámetros: EWIP a 10, EWEP a 128, EWIB a 1, EWEB a 32.
- A continuación, haga clic en el icono Iniciar adquisición para ejecutar la secuencia de pulsos.
- Una vez finalizada la adquisición, guarde los datos, seleccione el icono de diálogo Evaluación y, en el menú de análisis, seleccione Ventana WAM: Magnitud absoluta. A continuación, seleccione Hoja de informes, Gráficos y Exportar archivo y finalmente haga clic en Ejecutar.
- En la ventana Informe, busque el ancho de pulso RF que proporciona la amplitud máxima y ajuste el valor con la ayuda del cursor en el gráfico mostrado, que es similar a los trazados que se muestran en la fila inferior de la Figura 3. Este ancho de pulso se utilizará para el parámetro PW90 de los siguientes experimentos.
- Haga clic en el icono F1 para ajustar el cambio de frecuencia del relajanteómetro.
NOTA: Ventana WAM: Magnitud absoluta es un procedimiento para integrar la magnitud de una o una secuencia de adquisiciones de decaimiento de inducción libre (FID) desde el punto definido por EWIP hasta el punto especificado por EWEP y desde el bloque definido por EWIB al bloque especificado por EWEB.
- T1-Medidas
- Asegúrese de que la bobina de la caja externa esté instalada y energizada.
- En el software del instrumento realice los siguientes pasos:
- Seleccione la pestaña Par principal
- Haga clic en la celda situada junto a la etiqueta Experimento y desplácese hacia abajo en la ventana emergente para seleccionar la secuencia de pulsos HPUB/S,que se muestra en la Figura 4.
- Establezca los siguientes parámetros de adquisición: RFA a 25, T1MX a valores entre 3 y 5; SWT a 0,2, RD a 0, BRLX - Campo de relajación deseado en MHz (frecuencia de protones Larmor).
- Seleccione la pestaña Acq. par y, a continuación, seleccione la subpestaña Básico.
- Haga clic en la celda situada junto a la etiqueta Núcleo y desplácese hacia abajo en la ventana emergente para seleccionar 13C.
- A continuación, establezca los siguientes parámetros: SF a 8 MHz, SW a 1000000, BS a 652, FLTR a 50000.
- Seleccione la subpestaña Conf.
- Establezca los siguientes parámetros: PW90 igual al valor encontrado en el paso 2.1.10, RINH a 25, ACQD a 25.
- Seleccione la subpestaña Puls y establezca PW en 5.
- Seleccione la subpestaña nDim y establezca NBLK en 100.
- Espere y prepárese para recibir la solución hiperpolarizada para iniciar la adquisición de datos.
- Inmediatamente antes de insertar la muestra en el relajante, inicie manualmente la secuencia de pulsos desde la consola, para evitar insertar la muestra en un campo magnético nulo. Por esta razón, es importante ignorar la primera decaimiento de inducción libre (FID) durante el análisis de datos.
- Una vez realizada la adquisición, guarde los datos haciendo clic en el botón Guardar.
- Usando el software de análisis, integre la magnitud de cada señal FID para producir una serie de datos compuesta de magnetización de muestras en función del tiempo.
- Extraiga el tiempo de relajación de la celosía de giro de un modelo exponencial de tres parámetros utilizando un algoritmo de ajuste de mínimos cuadrados no lineal estándar implementado en un software analítico comercial (ver Tabla de materiales)asumiendo una ponderación uniforme para todos los datos:
donde A es la amplitud de señal inicial(y-intercept), T1 es el tiempo de relajación de la celosía de giro, TR es el tiempo de repetición, que es un valor conocido, y0 es la señal desplazamiento, y cos(n-1)()es una corrección para la pérdida de magnetización longitudinal en la mediciones nth para un ángulo de volteo, .
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Representative Results
La Figura 2 presenta un ejemplo de un barrido de microondas de rango completo de alta resolución para el ácido piruvico. Para el caso presentado, esa frecuencia óptima de microondas corresponde a 94.128 GHz, resaltado en el inserto de la figura. Nuestro sistema DNP normalmente puede funcionar en el rango de 93.750 GHz a 94.241 GHz con un tamaño de paso de 1 MHz, tiempo de polarización de hasta 600 s y potencia de hasta 100 mW. Una gama completa de frecuencias se investiga sólo para sustratos novedosos. Sin embargo, basándonos en la experiencia previa con ácido 13C-piruvico, esperamos que la frecuencia óptima sea alrededor de 94.127 GHz. Por lo tanto, un rango de escaneo entre 94.117 GHz a 94.137 GHz, con un tamaño de paso de 1 MHz y un tiempo de muestreo de 300 s con 50 mW de potencia, se utilizan típicamente.
La columna izquierda de la Figura 3 presenta los resultados para la calibración del ángulo de punta para [1-13C]ácido piruvico, que implica la adquisición de una serie de mediciones de señal en función de una duración de pulso RF que varía linealmente para determinar el pulso anchura correspondiente a un ángulo de volteo de 90o y 180o para núcleos de 13C. La anchura del pulso que proporciona la amplitud máxima corresponde a un ángulo de volteo de 90o y el cruce cero corresponde a un ángulo de volteo de 180o. La relación entre los dos anchos de pulso debe ser un factor de dos.
Los parámetros de adquisición para la calibración del ángulo de punta de 13C mostrada anteriormente pueden requerir algunos ajustes dependiendo de la potencia de transmisión del relajanteómetro de ciclo de campo, el T1 de la muestra y la característica de ruido del sistema. Es posible que también se necesiten algunos ensayos y errores para encontrar correctamente los 90o y 180o sin los efectos de los ecos estimulados, la saturación del amplificador y el SNR deficiente.
Este procedimiento, aunque preciso, normalmente consume mucho tiempo porque el pobre SNR de los compuestos de 13C polarizados térmicamente requiere muchos promedios. Un método alternativo y más rápido implica calibrar el ángulo de volteo con un fantasma de 1H dopado con gado de gado de gado y escalar la duración del pulso rf de 90o durante 13OC multiplicando la duración del pulso RF de 90o-1 H por la proporción del relaciones giromagnéticas de 1H/13C, que corresponde a un factor de 3.976. En este caso, los parámetros de adquisición estándar deben ser: EXP - ANGLE. FFC, NUC a 1H, TPOL a 0,1 s, BPOL a 30 MHz, SWT a 0,005, BINI a 0,1 s, BEND a 15,5 s, NBLK a 32, MS a 1, RFA a 25, RD a 0,1 s, BS a 652, SW a 1 MHz, FLTR a 100 KHz, SF a 8, RINH a 25, ACQD a 25, EWIP a 10, EWEP a 512, EWIB a 112, EWIB a 112, EWIP a 112, EWIB a 112, EWIP, , y EWEB 32. Los resultados de este método alternativo se muestran en la columna derecha de la Figura 3. Como comparación, para los casos presentados, el tiempo total de adquisición para la calibración del ángulo de punta para 13C fue de 13,5 minutos, mientras que para 1H fue de 7,1 segundos.
La Figura 5 ilustra la serie típica de FIDs en descomposición a medida que se muestrea la magnetización hiperpolarizada. Cada medida T1 a un BRLX determinado es una disolución hiperpolarizada separada del aparato DNP. Para este caso en particular, el campo de relajación (BRelax)fue de 0,2916 mT, con un tiempo de repetición de 3,4 s y un ángulo de volteo de 5o. Todas las temperaturas de la muestra se controlaron a 37 oC (0,5 oC).
La Figura 6 presenta la curva de relajación para el piruvato hiperpolarizado [1-13C]obtenido a partir de los datos de la figura anterior. Cada punto azul de la curva representa el área bajo un FID. El valor T1 (53,9 x 0,6s) se obtuvo mediante un ajuste no lineal de mínimos cuadrados de la ecuación de señal a los datos de la curva de decaimiento, que incluía los efectos del ángulo de volteo utilizado para la excitación. La bondad del ajuste se evaluó calculando el valor R2 (0.9995), suponiendo una ponderación uniforme de los puntos de datos. Los residuos de ajuste (ajuste de datos) se muestran como triángulos abiertos.
La Figura 7 presenta los resultados de T1 para las 26 mediciones en un rango de 0,237 mT y 0,705 T a 37 oC (0,5 oC). El T1 tenía una incertidumbre de ajuste promedio de 0,33 s para todos los resultados. El análisis de la dispersión de las mediciones repetidas en un campo de relajación particular produjo una reproducibilidad experimental varias veces mayor que la incertidumbre estadística citada anteriormente, con un T1 de 1,91 s. Se asignó de forma conservadora una incertidumbre de 2,24 s para todas las mediciones t1 calculadas como la suma de las dos incertidumbres citadas anteriormente. Los datos det1-dispersión están bien caracterizados por la fórmula empírica T1 o (3,74 x 0,52) x log10(BRelax) + (63,0 x 1,2) s; donde BRelax es el campo de relajación medido en Tesla. Las incertidumbres para los parámetros ajustados representan una desviación estándar. La línea sólida en la Figura 7 representa la fórmula junto con las líneas discontinuas que representan las bandas de confianza del 95%. los pHs de estas muestras oscilaron entre 7,63 y 7,93, con un pH medio de 7,75 y una desviación estándar de 0,09. El análisis de los resultados mostró que el tiempo de relajación para el núcleo C-1 es de 46,9 s en el campo magnético de la Tierra (0,05 mT) en comparación con 65 s a 3 T, lo que representa una disminución del 28%.
Figura 1 : [1-13C]molécula de ácido piruvico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Barrido de microondas de rango completo y sección de zoom que muestra la frecuencia de polarización óptima. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Calibración del ángulo de la punta para muestras de 13C (izquierda) y 1H (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Secuencia de pulsos de ciclo de campo (HPUB/S) para medir el tiempo de relajación T1de una muestra hiperpolarizada en un campo de relajación particular (BRLX). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Secuencia de FIDs obtenidos con la secuencia de pulsos HPUB/S. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Señal de relajación (puntos azules), ajuste de curva (línea roja) y error de ajuste (triángulos abiertos) obtenido de la secuencia de FIDs Figura 5. Esta cifra ha sido modificada con el permiso de Chattergoon et al. 201334. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Perfil NMRD de ácido hiperpolarizado [1-13C]piruvico en campos magnéticos bajos. Esta cifra ha sido modificada con el permiso de Chattergoon et al. 201334. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro | Descripción breve | Comentarios | Unidades |
| ACQD | Retraso en la adquisición | Retraso necesario para permitir que el campo magnético alcance el estado estable después de la transición y antes de la adquisición de datos | Μs |
| BACQ | Campo de adquisición | Especificado por medio de 1H de frecuencia Larmor | Mhz |
| Doblar | Valor final | Valor final del parámetro arrayed | |
| Bini | Valor inicial | Primer valor del parámetro arrayed | |
| BPOL | Campo de polarización | Especificado por medio de 1H de frecuencia Larmor | Mhz |
| BRLX | Campo de relajación | Especificado por medio de 1H de frecuencia Larmor | Mhz |
| Bs | Tamaño del bloque | Número de puntos de datos en un solo bloque | |
| EWEB | Bloque final | Cualquier número entero en el rango de Número de bloques (NBLK). 0 significa "todos" | |
| EWEP | Punto final | Cualquier número entero en el rango de Tamaño de bloque (BS). 0 significa "todos" | |
| EWIB | Bloque inicial | De 1 al número de bloques (NBLK) | |
| EWEP | Punto inicial | De 1 al tamaño de bloque (BS) | |
| Exp | Experimento | Nombre de la secuencia de pulsos que se utilizará | |
| FLTR | Observar filtro | Frecuencia de corte de los filtros de señal de audio | Hz |
| Sra | Máximo de escaneos | Número deseado de promedios | |
| NBLK | Número de bloques | Número de secciones para el parámetro de matriz. El parámetro arrayed es "PW90" para secuencias de pulsos "13CANGLE" y "ANGLE" y "T1MX" para la secuencia de pulsos "HPUB/S". PW90 cambia después de cada repetición, pero T1MX permanece constante. | |
| Nuc | Núcleo | Para este protocolo 13C o 1H | |
| Pw | Pulso rf principal | Angulo de punta | Grados (o) |
| PW90 | Pulso de 90 g | Duración del pulso de 90 grados | Μs |
| Rd | Retardo de reciclaje | Intervalo de enfriamiento del imán de preexploración | s |
| RFA | Atenuación de RF | Atenuación del receptor RF | Db |
| RINH | Inhibición del receptor | Retardo necesario para permitir la descomposición del anillo de bobina RF | Μs |
| Sf | Frecuencia del sistema | Frecuencia Larmor utilizada durante la adquisición | Mhz |
| Sw | Ancho de barrido | Ancho de ventana espectral (Frecuencia Nyquist) | Hz |
| Swt | Tiempo de conmutación | Tiempo global de conmutación de imanes | s |
| T1MX | Máximo T1 | Parámetro utilizado por la secuencia de pulsos HPUB/S para definir el tiempo de polarización durante cada repetición | s |
| TPOL | Tiempo de polarización | Parámetro utilizado por la secuencia de pulsos "ANGLE" y "13CANGLE" para definir el tiempo de polarización durante cada repetición | s |
Tabla 1: Descripción de los parámetros utilizados por el relajantemetro de ciclismo de campo.
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Discussion
El uso de DNP para mejorar la adquisición de señal es una solución técnica a la insuficiente señal de resonancia magnética disponible a partir de núcleos de 13C a concentraciones limitadas, como las utilizadas en inyecciones de animales, pero presenta otros desafíos experimentales. Cada medición de relajación que se muestra en la Figura 7 representa una medición de una muestra preparada de forma única porque no se puede repolarizar después de la disolución para la remedición. Esto conduce inevitablemente a una variabilidad experimental debido a pequeñas diferencias en la preparación de la muestra durante el pesaje de la muestra y los medios de disolución o variaciones en el propio proceso de disolución, como la extracción incompleta y la mezcla exhaustiva de la muestra con los medios de disolución. Esta variabilidad puede evaluarse parcialmente midiendo el pH de cada solución de piruvato después de la relaxometría. Independientemente del pesaje cuidadoso de la mezcla de piruvato/radical de stock y el medio de disolución antes de la inserción en el aparato DNP a mejor que un miligramo, en nuestros experimentos los pHs oscilaron entre 5,5 y 8,3. Hemos optado por rechazar cualquier dato T1 fuera del rango de pH 7.6 a 8.0.
Como se mencionó anteriormente, el nivel de polarización de estado sólido para cada muestra fue de al menos 95%, que se obtuvo en aproximadamente una hora. La polarización de estado líquido no se estimó para cada muestra; sin embargo, el aseguramiento periódico de la calidad del sistema DNP, utilizando la misma preparación de la muestra, dio lugar a niveles de polarización del estado líquido de alrededor del 15%.
Durante la preparación de la muestra, la contaminación por iones metálicos puede ocurrir por contacto entre el medio de disolución y la trayectoria del fluido de disolución DNP. Esta posibilidad requería la adición de ácido etilendiaminetetraacético disódico (EDTA) para secuestrar cualquiera de la contaminación de iones metálicos y preservar la relajación de la celosía de espín.
Comparando el método de cierre utilizado en la referencia28 y el ciclo de campo rápido presentado en este protocolo, podemos decir que el método de cierre sólo es posible cuando el tiempo de transporte es pequeño en comparación con el tiempo de relajación; de lo contrario, los campos magnéticos promedio experimentados durante el tiempo de cierre pueden tener un efecto significativo. Con el relajantemeter de ciclismo de campo rápido que utilizamos, el usuario está en control total del tiempo de conmutación, que puede ir tan bajo como 3 ms. Sin embargo, para sustratos hiperpolarizados, se requiere un tiempo de conmutación lento para mantener la adiabatiidad y no para destruir la polarización de la muestra durante las transiciones archivadas. En nuestra experiencia, para el ácido hiperpolarizado 13C-piruvico, un tiempo de conmutación tan bajo como 50 ms mantiene la polarización, pero observamos resultados más consistentes utilizando un tiempo de conmutación de 100 o 200 ms. Este pequeño tiempo de transición de la relajación a la relajación a la relajación adquisición y vuelta a los campos de relajación es insignificante en comparación con la T1 medida veces y no tiene ningún efecto sistemático en estas mediciones. Consideramos que se requieren más investigaciones para establecer los límites de la adiabatiidad de diferentes sustratos hiperpolarizados en diferentes campos magnéticos.
Otra diferencia importante entre los dos métodos es el rango de campos magnéticos, que es de 2 mT a 18,8 T para el método de cierre y de 0,237 mT a 0,705 T para el relajantemeter de ciclismo de campo. En este sentido, podemos ver los dos métodos como complementarios entre sí. Sin embargo, para estudios in vivo con compuestos hiperpolarizados, los campos magnéticos de hasta 3 T son más comunes.
En las intensidades de campo de menos de 1 mT, se observó que los campos magnéticos desviados de los objetos circundantes tenían un efecto sistemático en nuestras mediciones de relajación. Para eliminar estos campos, diseñamos y añadimos una cuña magnética personalizada alrededor del imán de ciclismo de campo. En comparación, el método de cierre utiliza blindaje cilíndrico de metal que produce un cambio abrupto del campo magnético de aproximadamente 2 mT a 0,2 mT.
El control de temperatura de la muestra fue importante debido a los tiempos de adquisición relativamente largos que requieren de 300 a 510 s para capturar toda la curva de descomposición. Precalentamos los tubos de RMN antes de dispensar la solución hiperpolarizada y luego mantuvimos la temperatura de la muestra soplando aire caliente, regulable a la temperatura (37 oC) sobre los tubos durante la relaxometría. Esta es una ventaja importante del relajanteómetro de ciclismo de campo sobre el método de cierre porque la temperatura de la muestra se puede controlar con precisión ya que la muestra es estacionaria durante las mediciones.
Además, no era práctico controlar la exposición de la muestra a la temperatura ambiente y al campo magnético durante el breve tiempo de transferencia entre el polarizador y el relajante. El T1 de las muestras se midió en campos magnéticos conocidos y la temperatura controlada por el relajar, por lo que el transporte tuvo una influencia limitada. Las condiciones durante el transporte solo pueden afectar la cantidad de hiperpolarización que sobrevive para la medición en el relajarse. Se desarrolló un imán de campo de sujeción portátil (10 mT) para transferir la solución hiperpolarizada al imán de imagen o relajantemetro; sin embargo, su uso no valió la pena en este experimento dado el breve tiempo de transferencia, pero puede ser útil para otros líquidos hiperpolarizados con mayor T1-dispersión en campos magnéticos inferiores. Un campo de retención de 0,01 T aumentaría la T1 de la solución de piruvato en casi un 18% durante el transporte; sin embargo, con nuestro tiempo de transferencia relativamente corto de 8 s, estas mediciones sugieren que sólo se observaría un aumento del 2,3% en la señal.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer, el Programa de Traducción de Imágenes y al Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá por financiar esta investigación. También nos gusta reconocer discusiones útiles con Albert Chen, GE Healthcare, Toronto, Canadá, Gianni Ferrante, Stelar s.r.l., Italia, y William Mander, Oxford Instruments, Reino Unido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-13C]Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 677175 | |
| 10mm NMR Tube | Norell, Inc., Morganton NC, USA | 1001-8 | |
| De-ionized water | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E5134 | |
| HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer | Oxford Instruments, Abingdon, UK | Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software | |
| MATLAB R2017b | MathWorks, Natick, MA | Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid. | |
| OX063 Triarylmethyl radical | Oxford Instruments, Abingdon, UK | ||
| pH meter - SympHony | VWR International, Mississauga, ON., Canada | SB70P | |
| ProHance | Bracco Diagnostics Inc. | Gadoteridol, Gd-HP-DO3A | |
| Pure Ethanol (100% pure) | Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada | P016EAAN | |
| Shim Coil | Developed in-house | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S8045 | |
| SpinMaster FFC2000 1T C/DC | Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy | Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper. | |
| Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7943 |
References
- Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Research. 66 (22), 10855-10860 (2006).
- Witney, T. H., Brindle, K. M. Imaging tumour cell metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Biochemical Society Transactions. 38 (5), 1220-1224 (2010).
- Kurhanewicz, J., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Golman, K., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magnetic Resonance in Medicine. 59 (5), 1005-1013 (2008).
- Golman, K., in 't Zandt, R., Thaning, M.
- Day, S. E., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magnetic Resonance in Medicine. 65 (2), 557-563 (2011).
- Gallagher, F. A., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
- Wilson, D. M., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. Journal of Magnetic Resonance. 205 (1), 141-147 (2010).
- Gallagher, F. A., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 19801-19806 (2009).
- Chen, A. P., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magnetic Resonance Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (2), 253-257 (2008).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Ishii, M., et al. Hyperpolarized 13C MRI of the pulmonary vasculature and parenchyma. Magnetic Resonance in Medicine. 57 (3), 459-463 (2007).
- Lau, A. Z., Chen, A. P., Cunningham, C. H. Integrated Bloch-Siegert B(1) mapping and multislice imaging of hyperpolarized (1)(3)C pyruvate and bicarbonate in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (1), 62-71 (2012).
- Lau, A. Z., et al. Rapid multislice imaging of hyperpolarized 13C pyruvate and bicarbonate in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 64 (5), 1323-1331 (2010).
- Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10435-10439 (2003).
- Johansson, E., et al. Cerebral perfusion assessment by bolus tracking using hyperpolarized 13C. Magnetic Resonance in Medicine. 51 (3), 464-472 (2004).
- Johansson, E., et al. Perfusion assessment with bolus differentiation: a technique applicable to hyperpolarized tracers. Magnetic Resonance in Medicine. 52 (5), 1043-1051 (2004).
- Albers, M. J., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Research. 68 (20), 8607-8615 (2008).
- Chen, A. P., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (6), 1099-1106 (2007).
- Lupo, J. M., et al. Analysis of hyperpolarized dynamic 13C lactate imaging in a transgenic mouse model of prostate cancer. Magnetic Resonance Imaging. 28 (2), 153-162 (2010).
- von Morze, C., et al. Imaging of blood flow using hyperpolarized [(13)C]urea in preclinical cancer models. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
- Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magnetic Resonance in Medicine. 66 (2), 505-519 (2011).
- Park, I., et al. Detection of early response to temozolomide treatment in brain tumors using hyperpolarized 13C MR metabolic imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33 (6), 1284-1290 (2011).
- Bohndiek, S. E., et al. Detection of tumor response to a vascular disrupting agent by hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3278-3288 (2010).
- Witney, T. H., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-13C]pyruvate and [1,4-13C2]fumarate. British Journal of Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
- Levitt, M. H. Spin dynamics: basics of nuclear magnetic resonance. , John Wiley & Sons. (2001).
- Mieville, P., Jannin, S., Bodenhausen, G. Relaxometry of insensitive nuclei: optimizing dissolution dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 210 (1), 137-140 (2011).
- Redfield, A. G. Shuttling device for high-resolution measurements of relaxation and related phenomena in solution at low field, using a shared commercial 500 MHz NMR instrument. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 753-768 (2003).
- Grosse, S., Gubaydullin, F., Scheelken, H., Vieth, H. -M., Yurkovskaya, A. V. Field cycling by fast NMR probe transfer: Design and application in field-dependent CIDNP experiments. Applied Magnetic Resonance. 17 (2), 211-225 (1999).
- Kimmich, R., Anoardo, E.
- Guðjónsdóttir, M., Belton, P., Webb, G. Magnetic Resonance in Food Science: Challenges in a Changing World. , The Royal Society of Chemistry. 65-72 (2009).
- Anoardo, E., Galli, G., Ferrante, G. Fast-field-cycling NMR: Applications and instrumentation. Applied Magnetic Resonance. 20 (3), 365-404 (2001).
- Chattergoon, N., Martinez-Santiesteban, F., Handler, W. B., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Scholl, T. J. Field dependence of T1 for hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Contrast Media & Molecular Imaging. 8 (1), 57-62 (2013).
- Martínez-Santiesteban, F. M., Dang, T. P., Lim, H., Chen, A. P., Scholl, T. J. T1 nuclear magnetic relaxation dispersion of hyperpolarized sodium and cesium hydrogencarbonate-13C. NMR in Biomedicine. 30 (9), 3749 (2017).
![Medición de la dependencia del campo magnético de relajación Spin-Lattice de hiperpolarizado [1-<sup>13</sup>C]pyruvate](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59399.jpg)
