Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Resumen

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Resumen

Cáncer de pulmón (LC) es la causa principal de muertes relacionadas con cáncer en todo el mundo. Similares a otras células de cáncer, una característica fundamental de las células del LC es la proliferación no regulada y la división celular. Inhibición de la proliferación por detener la progresión del ciclo celular ha demostrado ser un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer, incluyendo LC.

terapéutica de miRNA se han convertido en reguladores del gen postranscripcional importante y cada vez más están siendo estudiados para su uso en el tratamiento del cáncer. En trabajos recientes, se utilizaron dos miRNAs, miR-143 y miR-506, para regular la progresión del ciclo celular. Células de cáncer (CPCNP) de pulmón de células no pequeñas A549 fueron transfectadas, alteraciones de expresión del gene fueron analizados y finalmente se analizó la actividad apoptótica debido al tratamiento. Downregulation de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) fueron detectados (CDK1, CDK4 y CDK6), y ciclo celular se detiene en las transiciones de fase G1/S y G2/M. Análisis de la vía indican potencial actividad angiogénica del tratamiento, que dota el enfoque de actividad multifacética. Aquí se describe son las metodologías utilizadas para identificar la actividad del miRNA con respecto a la inhibición del ciclo celular, inducción de apoptosis y efectos del tratamiento sobre las células endoteliales por la inhibición de la angiogénesis. Se espera que los métodos presentados aquí apoyará investigaciones futuras sobre terapéutica de miRNA y la actividad correspondiente y que los datos representativos guiará a otros investigadores en análisis experimentales.

Introducción

El ciclo celular es una combinación de varios eventos regulatorios que permiten la duplicación del ADN y proliferación celular mediante el proceso mitótico¹. Quinasas Ciclina-Dependientes (CDKs) regularan y promoción el ciclo celular². Entre ellos, el CDK mitótica (CDK1) y la interfase CDKs (CDK2, CDK4 y CDK6) tienen un papel fundamental en el ciclo celular avance³. Proteína del retinoblastoma (Rb) es fosforilada por la CDK4/CDK6 complejos para permitir de la progresión del ciclo celular⁴y activación de CDK1 es esencial para la exitosa División de la célula⁵. Numerosos inhibidores de CDK se han desarrollado y evaluado en ensayos clínicos durante las últimas décadas, indicando el potencial de dirigirse las CDKs en tratamiento contra el cáncer. De hecho, tres inhibidores de CDK han sido aprobados para el tratamiento del cáncer de mama recientemente^6,7,8,9,10. Así, las CDKs, y en particular, CDK1 y CDK4/6, son de gran interés en la regulación de la progresión del cáncer de la célula.

miRNAs (miRs) son pequeños, no-codificación RNAs y reguladores postranscripcional de la expresión génica, regulación de aproximadamente 30% de todos los genes humanos¹¹. Su actividad se basa en la represión de translación o degradación del mensajero RNAs (mRNAs)¹². Ilustrativo de su significación biológica, se han identificado más de 5.000 miRNAs y una molécula de miRNA solo puede regular múltiples genes^11,13. Lo más importante, expresión de miRNA se ha asociado con diferentes enfermedades y Estados de enfermedad, incluyendo cáncer¹³. De hecho, miRNAs se han caracterizado como oncogénicos o supresores de tumor, siendo capaz de promover o suprimir el tumor y^14,15. La expresión relativa de miRNAs en los tejidos enfermos puede regular progresión de la enfermedad; así, el suministro exógeno de miRNAs tiene potencial terapéutico.

Cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer y más de 60% de todas las malignidades pulmonares son pequeñas células de pulmón cáncer^16,17, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 20%¹⁸. El uso de miR-143-3 p y p de miR-506-3 fue evaluado recientemente para apuntar los ciclos celulares de las células de cáncer de pulmón¹¹. miR-143 y miR-506 tienen secuencias complementariedad CDK1 y CDK4/CDK6, y se analizaron los efectos de estos dos miRs en células A549. Los datos experimentales se presentan y discuten en este documento. Expresión génica, la progresión del ciclo celular y la apoptosis fueron evaluadas utilizando diferentes diseños experimentales y los puntos de tiempo después de transfección. Se utilizaron los métodos PCR (RT-qPCR) cuantitativos en tiempo real junto con el análisis de microarrays para medir la expresión de genes específicos, y secuenciación de próxima generación RNA se utilizó para determinar gen global dysregulation¹¹. El último método identifica la abundancia relativa de transcripción de cada gen con alta sensibilidad y reproducibilidad, mientras que miles de genes pueden ser analizadas desde un único análisis experimental. Además, análisis de apoptosis por miRNA tratamiento fue realizada y se describen aquí. Bioinformática complementa el análisis de la vía. Presentados aquí son protocolos utilizados para análisis del terapéutico potencial de la combinatoria de miR-143 y miR-506.

El objetivo principal de este protocolo es identificar los efectos de los miRNAs en células, con un enfoque en el ciclo celular. La variedad de técnicas presentadas aquí útil de análisis de expresión génica novela y traducción antes (usando qPCR) para la elaboración de técnicas para el análisis del gene en el nivel de proteína, tales como análisis de microarrays. Se espera que este informe es útil para los investigadores interesados en trabajar con miRNAs. Además, se presenta una metodología para el análisis cytometric del flujo del ciclo celular y apoptosis de las células.

Protocolo

1. miR-143 y miR-506 transfección

PRECAUCIÓN: Use guantes de látex, gafas protectoras y una capa de laboratorio al realizar los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilizar el gabinete de seguridad de la biotecnología con el ventilador gabinete, sin bloqueo de las vías respiratorias o perturbar el flujo laminar. Siempre ponga la ventana protección de cristal a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.

1. Las células A549 NSCLC de semilla un T25 cm² frasco/6/96 bien placa en medio DMEM/F12K suplementado con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina (medios de cultivo) en una campana de cultivo de tejidos e incuban durante una noche a 37 ° C con 5% CO₂ en una incubadora de cultivo de tejidos.
2. Suspender imitadores de miR-143 y miR-506 o codificar siRNA con el agente de transferencia (2.4 μg de miR se mezclaron con 14 μl del agente transfectar; véase Tabla de materiales) en 500 μl de medio de transfección y 1,5 mL de suero y antibióticos medios DMEM/F12K en un concentración final miRNA de 100 nM. cantidad de miRNA puede requerir optimización de diversas células y concentraciones. Enfoques apropiados incluyen la transfección de las células con el aumento de las concentraciones de miRNA (es decir, 50-200 nM) y la evaluación de la desregulación de la expresión de los genes de interés.
3. Retire los medios de cultivo del frasco/de la placa y lavar una vez con PBS 1 x.
4. Añadir complejos agente miRNA/despegue en tiempo mínimo-transferencia e incubar a 37 ° C con 5% CO₂ para 6 h (tamaño de matraz define el volumen añadido de la incubación).
5. Sustituir los medios de comunicación con 4 mL de medio de cultivo e incubar las células para 24 h o 48 h.
6. Cosecha de células transfected por tripsinización, añadiendo 1 mL de tripsina-EDTA en cada frasco de² cm T25, incube durante 5-10 min a 37 ° C y añadir 3 mL de medio de cultivo para cosechar las células. Coloque el contenido de cada frasco en un tubo separado, marcado 15 mL. Trabajar en una campana de cultivo de tejidos.
7. Centrifugue a 751 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
   Nota: PRECAUCIÓN se requiere durante la extracción del sobrenadante, como agitación del tubo puede causar la pérdida de las células.
8. Añadir 2 mL de 1 x PBS y centrifugar durante 5 min en 751 x g.
9. Repita los pasos 7 y 8 una vez para eliminar cualquier rastro de los medios de comunicación y sobrenadante.
   Nota: En esta etapa, tubos de ensayo pueden ser almacenados a-80 ° C o se pueden utilizar inmediatamente.

2. extracción de RNA

1. Limpie el área de trabajo mediante pulverización con solución de descontaminación de RNasa y alcohol isopropílico al 70%.
2. Extracción de RNA debe realizarse con un RNA apropiado kit (véase Tabla de materiales).
3. Retirar los tubos de-80 ° C y que puedan descongelar. Añadir 300 μL de tampón de lisis y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana de la célula.
4. Añadir un volumen igual de etanol ultra puro 100%.
5. Mezclar bien y colocar en la columna de separación.
6. Centrifugar entre 11 y 16 x g durante 30 s y quitar el flujo a través.
7. Añadir 400 μL de buffer y centrifugadora para retirar el tampón de lavado.
8. Añadir 5 μl de DNasa I con 75 μl de la digestión del ADN del búfer en cada muestra e incube durante 15 minutos.
9. Lavar la muestra con 400 μL de tampón preparación de RNA.
10. Lavar 2 x con tampón de lavado de RNA.
11. Añadir agua libre de nucleasa a la columna, centrífuga, luego recoge el ARN.
12. Concentración de RNA total medida con un espectrofotómetro UV.

3. RT-qPCR

1. Antes de la RT-qPCR, sintetizar el cDNA. Con posterioridad a la cuantificación de la concentración de RNA, coloque 1 μg de RNA en un volumen final de 20 μl de reacción para preparar cDNA en un tubo PCR. Trabaje siempre sobre una mesa de trabajo limpia.
2. Todos los ingredientes necesarios están incluidos en la tabla 1.

Ingredientes	Cantidad (μL) muestra (20 μl)
5 X cDNA Master mix	4
dNTPs	2
Random hexamers	1
Reforzador de la RT	1
Mezcla de enzima verso	1
Agua libre de DNAsas y ARNasas	Cantidad requerida tras añadir RNA para hacer 20 μl

Tabla 1: Materiales para síntesis de cDNA de las muestras de RNA. Requiere cantidades de ingredientes respectivos para preparar una mezcla principal para una muestra para síntesis de cDNA.

3. Incubar en un termociclador con las siguientes condiciones de temperatura: 42 ° C por 30 min; 95 ° C por 2 min; 4 ° C hasta la recogida de muestras.
4. Utilizar inmediatamente de PCR o qPCR o almacenar cDNA a-20 ° C.
5. Preparar soluciones de primer avance y retroceso con DNasa/Rnasa-libre de agua a una concentración de 10 μm de la solución stock cartilla.
6. Preparar mezclas principales independientes para cada gen ser detectado, según el número de muestras. Para cada muestra de cDNA (qPCR bien), la cantidad de reacción se prepara según la tabla 2.

Ingredientes	Cantidad (μL) muestra (20 μl)
Mezcla maestra SYBR	10
Primer avance - 10 μM	2
Cartilla inversión - 10 μM	2
Agua libre de DNAsas y ARNasas	3
muestra de cDNA	3

Tabla 2: materiales para la PCR cuantitativa en tiempo real de las muestras de cDNA. Necesaria la cantidad de ingredientes para preparar una mezcla principal para una muestra para qPCR.

7. Colocar cada muestra en los pocillos respectivos.
8. Diseño el diseño de la muestra de la placa de 96 qPCR bien. Para cada muestra y cada gen analizado, realizar la reacción en triplicado, o al menos en duplicado.
9. Sello del 96 bien la placa con una cubierta adhesiva clara.
10. Rápido-hacer girar la placa para permitir que la mezcla de reacción alcanzar el fondo de cada pozo.
11. Ejecutar RT-qPCR según el gradiente térmico siguiente:
    1) 50 ° C por 2 min
    2) 95 ° C por 2 min
    3) 95 ° C por 15 s
    4) tomar lectura
    5) 60 ° C durante 1,5 min.
    6) Repita el paso 3 para 39 veces
12. Ejecute el siguiente gradiente térmico en la continuación de la anterior para determinar la curva de fusión indica la amplificación de solo producto.
    7) 65 ° C por minuto 0,31
    0,5 ° C/ciclo
    9) lectura de placa
    10) Repita el paso 8 para 60 veces hasta llegar a 95 ° C
    11) 72 ° C por 2 min

4. electroforesis en agarosa para confirmar una amplificación del gen

1. Preparar el gel de agarosa al 1% en buffer de x TBE 1.
2. Añadir bromuro de etidio (EtBr) en gel caliente (~ 50 ° C) hasta lograr una concentración final de aproximadamente 0.2-0.5 μg/mL. EtBR se une con el ADN y le permite ser visualizado bajo la luz de un formador de gel UV.
3. Vierta el gel caliente en una bandeja de gel provista de una caja del gel de electroforesis. Instale el peine siempre firmemente para pozos uniforme.
4. Permita que el gel al resto y dejar enfriar a temperatura ambiente (RT) ~ 30 min.
5. Cuando el gel se solidifica, coloque el gel y la bandeja en la caja de gel.
6. Llene la caja de gel con 1 x TBE buffer hasta cubre completamente el gel.
7. Medir la concentración de la DNA del proceso de amplificación de PCR usando un espectrómetro UV.
8. Tomar ~ 15 ng de ADN en un pequeño tubo PCR, añadir 5 μl de colorante y agregar la cantidad necesaria de agua libre de nucleasa para alcanzar un volumen total de 15 μl.
9. Coloque la escalera de ADN y muestras en los pozos.
10. Correr el gel a 100 V hasta la línea del tinte es aproximadamente 75-80% por el gel.
    Nota: Asegúrese de que el gel funciona de una negativa a la carga positiva.
11. Retirar el gel y colóquelo en el reproductor de imágenes de gel para visualizar el ADN.

5. análisis del ciclo de la célula

1. Semilla 5 x 10⁵ células cada muestra en un matraz de² cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
2. Después de 24 h y 48 h, luego recoger las células por tripsinización.
3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos estériles de 15 mL y etiquetarlos correctamente.
4. Centrifugar las muestras a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
6. Repetir el lavado con 1 x PBS para quitar los restos de medios.
7. Suspender y romper el precipitado mediante la adición de 200 μL de PBS 1 x helada por pipeteo.
8. Fijar las células añadiendo 2 mL de etanol al 70% helada gota a gota en el tubo mientras un vórtex suavemente.
9. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente y colocar los tubos a 4 º C durante 1 hora.
10. Retirar tubos de 4 ° C y centrifugar a 751 x g durante 5 minutos.
11. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
12. Añadir 500 μl de 1 x PBS con yoduro de propidio (50 μg/mL) y ribonucleasa (200 μg/mL)
13. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente mientras que la protección de las muestras de la luz.
14. Adquirir datos en citómetro de flujo. Utilice hacia adelante vs scatter (FSC y SSC) para seleccionar la población principal de las células, excepto residuos en la esquina inferior izquierda de los clusters de parcela y de la célula de densidad FSC vs SSC de lado en la parte superior hacia arriba-derecha de la parcela de la densidad FSC y SSC.
15. Analizar los datos para la identificación de poblaciones celulares por etapa del ciclo celular con el software apropiado.

6. Apoptosis ensayo

1. Semilla 5 x 10⁵ células cada muestra en un matraz de² cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
2. Después de 24 h y 48 h, recoger las células por tripsinización.
3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos estériles de 15 mL y etiquetarlos correctamente.
4. Centrifugue a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
6. Repetir el lavado con 1 x PBS para quitar los restos de medios.
7. Diluir 10 x tampón de Unión anexina V 1 x con helada dH₂O.
8. Añadir 1 mL de 1 x de tampón de unión de la anexina V a cada tubo de muestras y resuspender suavemente.
9. Suspensión de células de lugar 96 μl of en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
10. Añadir 1 μl de conjugado anexina V-FITC y 12,5 μl de yoduro de propidio (PI) para el tubo que contiene la suspensión de células.
11. Incubar la suspensión celular por 10 min en hielo en la oscuridad.
12. Añadir 250 μl helada 1 x de tampón de unión de anexina V a cada tubo de muestra para diluir.
13. Analizar inmediatamente las muestras con citómetro de flujo.

7. expresión de la proteína por ciclo celular microarrays de anticuerpos

1. Semilla 5 x 10⁵ células cada muestra en frascos de² cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
2. Después de 24 h y 48 h, recoger células por tripsinización.
3. Transferencia de suspensiones celulares para tubos de 15 mL y etiquetarlos en consecuencia.
4. Centrifugue a 751 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
5. Añadir 2 mL de PBS 1 x helada, vortex y centrifugar a 751 x g por 5 min descartar el sobrenadante.
6. Repetir el lavado con 1 x PBS.
7. Añadir 150 μL de tampón de lisis con inhibidores de la proteasa. Pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para alterar las membranas celulares.
8. Para evitar cualquier interferencia de buffer de lisis, realizar un intercambio de búfer para reemplazar el tampón de lisis con tampón etiquetado, utilizando columnas de intercambio solvente del fabricante.
9. Cuantificar las proteínas totales con un ensayo BCA.
10. 70 μg de muestra de la proteína y añadir tampón etiquetado para alcanzar un volumen final de 75 μl.
11. Añadir 100 μl de dimetilformamida (DMF) a 1 mg de reactivo de la biotina (biotin/DMF).
12. Agregar 3 μl de biotina/DMF a cada muestra de proteína (muestra de proteína biotinilada) e incubar por 2 h a TA.
13. Añadir 35 μl de reactivo de parada y mezclar con un vórtex.
14. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos.
15. Sacar los portaobjetos de microarray de la nevera para que caliente a RT para 1 h antes de su uso.
16. Realizar bloqueo de fijación no específica por incubar los portaobjetos con solución 3% leche en polvo (en bloqueo reactivo proporcionado por el fabricante) en una placa Petri con agitación continua por 45 min a TA.
17. Lavar los portaobjetos con ddH₂O agua (a menos que se especifique lo contrario, lavado ocurre con ddH₂O).
18. Repetir el lavado ~ 10 x para eliminar completamente la solución de bloqueo de las superficies de deslizamiento. Esto es importante para lograr un fondo uniforme y baja.
19. Eliminar el exceso de agua de las superficies de deslizamiento y proceder al siguiente paso sin dejar que las diapositivas en seco.
20. Preparar la solución de acoplamiento disolviendo 3% leche en polvo en un reactivo de acoplamiento.
21. Añadir 6 mL de la solución de acoplamiento y a la cantidad completa de la muestra de proteína biotinilada previamente preparado en el paso 7.12.
22. Lugar una diapositiva en un pozo de la cámara de acoplamiento suministrado por el proveedor y añadir ~ 6 mL de proteína mezcla de acoplamiento a él.
    Nota: Asegúrese de que la diapositiva esté totalmente sumergida en la proteína de acoplamiento solución de mezcla.
23. Cubrir la cámara de acoplamiento e incubar por 2 h a temperatura ambiente con agitación en un agitador orbital.
24. Transfiera los portaobjetos a un plato de Petri y añadir 30 mL de 1 x de tampón de lavado. Coloque el plato Petri en Agitador orbital, agitar durante 10 minutos y descartar la solución.
25. Repita el paso 7,24 2 x.
26. Enjuague los portaobjetos con ddH₂O agua extensivamente como se describe en los pasos 7.17 y 7.18 y proceder al siguiente paso inmediatamente para evitar que se sequen.
27. Añadir 30 μl de Cy3-estreptavidina (0.5 mg/mL) en 30 mL de tampón de detección.
28. Coloque el portaobjetos en una caja Petri y añadir 30 mL de tampón de detección que contiene Cy3-estreptavidina.
29. Incubar en un agitador orbital durante 20 min con agitación continua protegida de la luz.
    Nota: Cy-3 es un colorante fluorescente. Cubrir con papel de aluminio u operan bajo condiciones de oscuridad para mantener la intensidad de la fluorescencia.
30. Ejecutar los pasos 7.24 7.26 y permita que el portaobjetos secar utilizando una suave corriente de aire o colocar el portaobjetos en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 1300 x g durante 5-10 minutos.
31. Coloque el portaobjetos en portaobjetos y cubierta con papel de aluminio.
32. Analizar la diapositiva en un escáner de microarreglos con las correspondientes longitudes de onda de excitación y emisión. En el caso de Cy3, el pico de longitud de onda de excitación es en ~ 550 nm y emisión máxima a ~ 570 nm.
33. Analizar los datos (véase Tabla de materiales) para el software utilizado).

8. la secuencia de RNA

1. Semilla 5 x 10⁵ células cada muestra en frascos de² cm T25 y realizan una transfección según el protocolo descrito en la sección 1, pasos 1-5.
2. Después de 24 h y 48 h, recoger las células por tripsinización.
3. Las suspensiones de células de transferencia a tubos de 15 mL y etiquetarlos en consecuencia.
4. Acuerdo con la sección 2, pasos 1-6 Extracto de RNA.
5. Verificar calidad de RNA concentración con un bioanalyzer. Una integridad del RNA puntuación (RIN) por encima de ocho y su caso histogramas son necesarios para confirmar la calidad del RNA.
6. De ARN total, use ~ 2 μg de la muestra de RNA (RNA del Mensajero de ARN total) de la secuencia
7. Secuencia utilizando un secuenciador de última generación¹¹.
8. Ejecutar el ajuste de calidad y mapas con un genoma de referencia de FASTQ archivos generados a partir del ARN secuencia máquina¹¹.
9. Subir archivos FASTQ y crudo leer los datos de cuenta para Banco de germoplasma, siguiendo las instrucciones de la < página web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.
   Nota: Ver número SRP133420 de los resultados anteriores.

9. ensayo de formación de tubo de

1. Evaluar el potencial angiogénico de vena umbilical humana miRNA transfected las células endoteliales (HUVECs) 36 h después la transfección, como se describe en la sección 1, pasos 1-5, utilizando células HUVEC en lugar de células A549.
2. De hambre HUVECs con M199 medios de hambre durante 4 h a 37 ° C con 5% CO₂.
3. Quitar matriz de membrana basal reducido factor de crecimiento de-80 ° C y almacenar a 4 ° C durante la noche, permitiendo la descongelación gradual evitar la polimerización y la formación de burbujas.
4. Lentamente y con cuidado cubra los pocillos de una placa bien 96 con 0,04 mL de matriz de la membrana del sótano de reducido factor de crecimiento, evitando formación de burbujas. Realizar todo el procedimiento bajo una campana de flujo laminar.
5. Llenan de pozos adyacentes de la placa de la pozo 96 0,1 mL de PBS para mantener la humedad y preservar la temperatura.
6. Incube la placa bien 96 a 37 ° C por al menos 20 min para que se logra la polimerización del extracto de la membrana del sótano. No incubar más de 1 h.
7. Trypsinize transfected HUVECs de cada grupo y resuspender en medio M199 a una concentración de 1 x 10⁵ células/mL.
8. Añadir 0,1 mL de cada suspensión en los pocillos que contienen matriz polimerizada la membrana del sótano en la placa de la pozo 96.
9. Incube la placa bien 96 a 37 ° C con 5% CO₂ y preparación de los factores de crecimiento lleva a cabo. Preparación de factores de crecimiento también ocurre bajo la campana de flujo laminar.
10. Reconstituir los factores de crecimiento (VEGF) en 2 x la concentración final deseada (concentración de 4 ng/mL para la concentración final de 2 ng/mL) y añadir 0,1 mL de medio de inanición de M199 que contienen factor de crecimiento encima de la 0,1 mL de medio de hambre M199 con las células. Para pozos no tratadas de VEGF, Añadir 0,1 mL de medio de hambre M199 encima de la 0,1 mL de medio de hambre M199 con las células.
11. Incube la placa bien 96 por 6 h a 37 ° C con 5% CO₂.
12. Al final de la incubación, obtener imágenes de cada pocillo con 4 aumentos, utilizando un microscopio de campo luminoso conectado con una cámara digital.
13. Proceso de imágenes con software equipado con un plug-in "analizador de la angiogénesis"¹⁹. Utiliza tres parámetros, el número de nodos, el número de uniones y la longitud de brotes total, para comparar los efectos del tratamiento de miRNA en angiogénesis.

Resultados

Análisis de expresión génica utilizando RT-qPCR y gel electroforesis

Análisis de expresión génica diferencial utilizando RT-qPCR demostraron significativa desregulación de los genes específicos CDK1, CDK4 y CDK6. CDK1 y CDK4/6 fueron demostrados para ser instrumental para la G2/M y las transiciones de G1/S, respectivamente. El análisis realizado permitió comparación directa entre la actividad combinatoria miR y ...

Discusión

miRNAs pueden operar como terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer, reconociendo la desregulación de los niveles de expresión en enfermos vs los tejidos normales. Este estudio pretende determinar miRNAs que potencialmente detener la progresión del ciclo celular en varias etapas. Se identificó que el miR-143 y miR-506 detener el ciclo celular de las células cancerosas y los protocolos presentados se pretende comprender la actividad de este tratamiento de miRNA combinatoria.

Las metodol...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
-80 ° C Congelador	VWR	VWR40086A
placa de 96 pocillos	CELLTREAT Scientific	50-607-511
Placas de micropocillos de 96 pocillos	Thermo Scientific	12-556-008
A549 Células de cáncer de pulmón de células no pequeñas	ATCC	ATCC  CCL-185
Agarosa	VWR	0710-25G
Agilent 2100 Bioanalizador	Agilent Technologies	G2938c
Ambion Silenciador Control Negativo No. 1 siRNA	Ambion	AM4611
Solución Antibiótica-Antimicótica (100x)	Gibco	15240-062
Kit de ensayo de matriz de anticuerpos, 2 reacciones	Full Moon Bio	KAS02
Microscopio de campo brillante	Microscopía	IV-900
Microscopio de campo claro	de Star Environment LLC
, 2 portaobjetos	Full Moon Bio	ACC058
Cell Logic+ Biosecurity Cabinate	Labconco	342391100
Cellquest Pro	BD bioscience	Pasos 5.14; 6.13: Se utiliza para calcular la distribución de la población según la fase del ciclo celular y para calcular la distribución de la población para el análisis de apoptosis
Sistema en tiempo real CFX96	BioRad	CFX96 Módulo
Sistema de imagen táctil Chemidoc		BioRad	Chemidoc
Incubadora de CO2	Thermo Scientific	HERAcell 150i
Cultrex Factor de crecimiento reducido Matriz de membrana basal	Trevigen	3433-010-01
Cámara digital	AmScope	FMA050
DMEM 4,5 g/L de glucosa, sin piruvato de sodio, con L-glutamina	VWR	VWRL0100-0500
DNAse I	Zymo Research	E1010
Suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS)	BD Biosciences	356006
Eppendorf Pipeta Pick-A-Pack Sets	Eppendrof	05-403-152
Etanol, Absoluto (200 Pruebas), Molecular Grado en Biología,	Fisher BioReagents	BP2818500
Bromuro de etidio	Alfa acar	L07462
F-12K Mezcla de nutrientes (Kaighn's Mod.) con L-glutamina, Corning	Corning	45000-354
FACS Calibur Flowcytometer	Becton Dickinson
Suero fetal bovino - Premium	Antlanta Biologicals	S11150
Fetal Suero bovino (FBS)	Fisher Scientific	10438026
Fisherbrand Basix Microcentrífuga Tubos con tapones a presión estándar	Fisherbrand Basix	02-682-002
Forma Serie II Camisa de agua Incubadora de CO2	Thermo Scientific
heparina (5000 U/mL)	Hospira	NDC#63739-920-11
Sistema de electroforesis horixontal	de sobremesa sistema de laboratorio	BT102
has-miR-143-3p miRNA Mimic	ABM	MCH01315
has-miR-506-3p miRNA Mimic	ABM	MCH02824
Factor de crecimiento endotelial vascular recombinante humano (VEGF)	Thermo Scientific	PHC9394
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)	Donantes individuales	IRB# A15-3891
Solución salina tamponada de fosfato HyClone (PBS)	Análisis	SH30256FS
	Qiagen	Resultados: Utilizado para el análisis
Invitrogen UltraPure DNasa/Agua destilada sin RNasa	Invitrogen	10-977-015
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11-668-027
Tinte de carga 10X	ward's science+	470024-814
Medium M199 (con Earle′ s, L-glutamina y bicarbonato de sodio)	Sigma Aldrich	M4530
Microscopio Cámara Digital	AmScope	MU130
Modfit LT	Verity Software	Paso 5.15: Software alternativo para el análisis de las distribuciones de la población del ciclo celular
sybr green master mix	Applied Biosystems	A25780
Yoduro de propidio	MP Biochemicals LLC	IC19545825
Proscanarray HT Escáner de microarrays	Perkin elmer	ASCNPHRG. Utilizamos una longitud de onda láser de excitación a 543 nm.
q Cubierta adhesiva óptica para PCR	Applied Biosystems	4360954
Kits de ARN rápido	Zymo Research	R1055
Ribonucleasa A de páncreas bovino	Sigma	R6513-50MG
ScanArray Express	PerkinElmer	Paso 7.33: Software
	Shaker Thermo Scientific	2314
Termociclador SimpliAmp	Applied Biosystems
Tubos de centrífuga SpectraTube 15ml	VWR	470224-998
Tubos de centrífuga SpectraTube 50ml	VWR	470225-004
TBS Tampón, 20x líquido	VWR	10791-796
Temperatura controlada  centrífuga matchine	Thermo Scientific	ST16R
Microcentrífuga con control de temperatura matchine	Eppendrof	5415R
Thermo Scientific BioLite Matraces tratados para cultivo celular	Thermo Scientific	12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Thermo Scientific	PI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer	Thermo Scientific	PI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast Placas de faldón completo de 96 pocillos	Thermo Scientific	AB0800WL
Thermo Scientific Verso Kit de síntesis de ADNc (100 carreras)	Thermo Scientific	AB1453B
Escalera de ADN de rango ultra bajo	Invitrogen 10597012
VWR refrigerador de laboratorio de puerta sólida estándar	VWR