Summary
Een methode voor het vaststellen van afatinib-resistentie cellijnen van Long adenocarcinoom PC-9 cellen werd ontwikkeld, en resistente cellen werden gekarakteriseerd. De resistente cellen kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase remmer-resistentiemechanismen, toepasbaar voor patiënten met niet-kleincellige longkanker.
Abstract
Verworven resistentie tegen moleculaire doelwit remmers is een ernstig probleem in de kankertherapie. Longkanker blijft de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde dood in de meeste landen. De ontdekking van "oncogene bestuurders mutaties," zoals epidermale groeifactor receptor (EGFR)-activerende mutaties, en latere ontwikkeling van moleculaire doelstoffen van EGFR-tyrosine kinase remmers (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib) hebben de behandeling van longkanker in de afgelopen decennia drastisch veranderd. Deze geneesmiddelen zijn echter nog steeds niet effectief bij patiënten met niet-kleincellige longkanker (NSCLC) die EGFR-activerende mutaties uitvoeren. Na verworven resistentie blijft de systemische progressie van NSCLC een significant obstakel bij de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve NSCLC. Hier presenteren we een stapsgewijze dosisescalatie methode voor het instellen van drie onafhankelijke verworven afatinib-resistente cellijnen van NSCLC PC-9-cellen die harkotteren EGFR-activerende mutaties van 15-basepaar verwijderingen in EGFR Exon 19. Methoden voor het karakteriseren van de drie onafhankelijke afatinib-resistentie cellijnen worden kort gepresenteerd. De verworven resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Daarom moeten meerdere cellijnen met verworven resistentie tegen EGFR-TKIs worden onderzocht. Tien tot twaalf maanden zijn nodig om cellijnen met verworven resistentie te verkrijgen met behulp van deze stapsgewijze dosisescalatie aanpak. De ontdekking van nieuwe verworven resistentiemechanismen zal bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere en veilige therapeutische strategieën.
Introduction
Vijf tyrosinekinaseremmers, gericht op epidermale groeifactor receptor (EGFR), waaronder gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib, zijn momenteel beschikbaar voor de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve niet-kleincellige Long kanker (NSCLC). De afgelopen tien jaar hebben therapieën voor dergelijke patiënten een dramatische ontwikkeling ondergaan met de ontdekking van nieuwe mogelijke EGFR-TKIs. Bij patiënten met Long adenocarcinoom worden somatische mutaties in EGFR geïdentificeerd bij ongeveer 50% van de Aziatische en 15% van de blanke patiënten1. De meest voorkomende mutaties in EGFR zijn een L858R puntmutatie in EGFR Exon 21 en 15 base pair (BP) verwijderingen in EGFR Exon 192. Bij EGFR-mutatie-positieve patiënten met NSCLC verbeteren EGFR-TKIs de responspercentages en klinische uitkomsten in vergelijking met de vorige standaard van Platinum Doublet chemotherapie3.
Gefitinib en erlotinib waren de eerste goedgekeurde kleine molecuul remmers en worden in het algemeen aangeduid als eerste generatie EGFR-Tki's. Deze EGFR TKIs blok tyrosine kinase activiteit door te concurreren met ATP en omkeerbaar binding aan ATP binding sites4. Afatinib is een EGFR TKI van de tweede generatie die onherroepelijk en covalent bindt aan het tyrosine kinase domein van EGFR en wordt gekarakteriseerd als een pan-humane EGFR-familie remmer5.
Ondanks het dramatisch voordeel van deze therapieën bij patiënten met NSCLC, is verworven resistentie onvermijdelijk. Het meest voorkomende Resistentiemechanisme tegen de eerste en tweede generatie EGFR-tkis is de opkomst van de T790M-mutatie in EGFR Exon 20, die aanwezig is in 50-70% van de tumormonsters6,7,8. Andere weerstand mechanismen omvatten bypass-signalen (om te voldoen aan, IGF1R, en HER2), transformatie naar kleincellige longkanker, en inductie van de epitheliale-naar-mesenchymale overgang, die pre-klinisch en klinisch9optreden. De resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Door het identificeren van nieuwe resistentiemechanismen in preklinische studies, kan het mogelijk zijn om nieuwe therapieën te ontwikkelen om resistentie te overwinnen. Optimale sequentie therapieën die het klinisch voordeel voor patiënten maximaliseren, moeten rekening houden met de resistentiemechanismen en het therapeutische doel.
Het is noodzakelijk om de juiste ouderlijke cellijn te kiezen, omdat het de basis is van alle daaropvolgende experimenten. De selectie strategieën beginnen met klinische relevantie; het is noodzakelijk om te kiezen voor een chemotherapie en straling naïeve cellijn. Eerdere chemotherapeutische en/of radiatieve behandeling kan de verandering van resistentie trajecten en veranderingen van de expressie van resistentie markers voor geneesmiddelen induceren. In deze studie worden PC-9-cellen, die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 dragen, gebruikt voor de vaststelling van verworven resistentie tegen afatinib. Deze cellijn werd afgeleid van een Japanse NSCLC-patiënt, die geen eerdere chemotherapie en straling kreeg.
Omdat afatinib dagelijks oraal wordt toegediend, is een continue in vitro behandeling, waarbij de cellen voortdurend in aanwezigheid van afatinib worden gekweekt, klinisch relevant. De dosis geneesmiddelen die in de verschillende stappen van het experiment worden gebruikt, moet worden geoptimaliseerd voor de geselecteerde bovenliggende cellijn. Een cytotoxiciteits test kan worden gebruikt voor het bepalen van een geschikt geneesmiddelen bereik, dat vergelijkbaar moet zijn met de farmacokinetische informatie van het geneesmiddel.
Gedurende het hele selectieproces wordt de hele populatie cellen gehandhaafd als één groep; klonen of andere scheidingsmethoden worden niet gebruikt. De cellen worden eerst voortdurend blootgesteld aan een laag niveau van het geneesmiddel. Vervolgens, nadat de cellen zich aanpassen om te groeien in de aanwezigheid van het medicijn, wordt de dosis van het medicijn langzaam verhoogd tot de uiteindelijke optimale dosis van het geneesmiddel10,11. Als alternatief kan een Pulse Drug-Administration of mutagenese worden gebruikt voor het selecteren van resistentie cellen, die ook worden uitgevoerd voorafgaand aan medicamenteuze behandeling 12,13. Helaas worden gevallen waarin de resistentie tegen geneesmiddelen niet wordt ontwikkeld, meestal niet gerapporteerd. De selectie strategieën zijn ontwikkeld met als doel de voorwaarden van kankerpatiënten na te bootsen voor de wederopbouw van klinisch relevante resistentie. Soms, om moleculaire veranderingen in verband met mechanismen van de resistentie van de drug te identificeren, een hoge concentratie van het geneesmiddel wordt gebruikt. Dit model wordt minder klinisch relevant.
Hier beschrijven we een methode voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen van PC-9-cellen die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 en de initiële karakterisering van de afatinib-resistente cellijnen verharten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oprichting van drie onafhankelijke Afatinib-resistente PC-9 cellijnen
- Bepaling van de initiële blootstellingsconcentratie voor afatinib voor PC-9-cellen met behulp van de 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test
- Cultuur PC-9 cellen in groeimedium met foetaal runderserum (10%), penicillaire (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL) in een cel-cultuur behandeld 10 cm schaal in een incubator van 5% CO2 bij 37 °c.
- Respendeer PC-9 cellen bij 4 x 104 cellen/ml in het groeimedium en zaai vervolgens op 50 μL/goed in een 96-well microplaat. De uiteindelijke concentratie van cellen is 2,0 x 103 cellen/50 μL/goed. Incuberen 's nachts in een incubator van 5% CO2 bij 37 °c.
- Voeg 50 μL afatinib-oplossing toe in verschillende concentraties: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 en 20 μM tot de putjes met het groeimedium (50 μL). Het uiteindelijke volume en de concentraties van afatinib zijn respectievelijk 100 μL en 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 en 10 μM.
- Incuberen de 96-put plaat voor 96 h in een 5% CO2 incubator bij 37 °c.
- Voeg 15 μL van de kleurstofoplossing (Zie tabel van de materialen) toe aan elk goed en incuteer gedurende 4 uur in een incubator van 5% Co2 bij 37 °c en voeg vervolgens 100 μl solubilization/stop-oplossing (Zie tabel met materialen) toe aan elk goed en incuteer 's nachts in een 5% Co < C10 > 2 incubator bij 37 °c.
- Meet de extinctie op 570 nm (OD570) met behulp van een microplaat lezer (Zie tabel met materialen). Bereid 6-12 replicaten en herhaal de experimenten ten minste drie keer.
- Gebruik statistische software (Zie tabel met materialen) om deze gegevens grafisch uit te tekenen als een halfloggrafiek en de IC50 -waarde te berekenen, wat de geneesmiddelconcentratie is die de respons reduceert tot 50% van het maximum (Zie tabel met materialen ).
- Continue blootstelling van PC-9-cellen aan de onomkeerbare EGFR-TKI, afatinib, door stapsgewijze dosisescalatie in drie onafhankelijke gerechten van 10 cm
- Cultuur PC-9 cellen in P100 gerechten met 10 mL groeimedium. Wanneer de PC-9 cellen de subconfluente fase bereiken, breng 1 mL celsuspensie over in drie nieuwe P100 gerechten, met 9 mL groeimedium. De 1:10 verdunde PC-9 cellen worden subconfluent in 3-4 dagen, met een celnummer van ongeveer 4-5 x 105 cellen/ml.
- Voeg de volgende dag 1/10 van de IC50 waarde van afatinib toe aan elk van de drie P100 gerechten.
Opmerking: Afatinib wordt in DMSO gereconstitueerd bij een voorraad concentratie van 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM en 5 mM. 1 tot 10 μL afatinib-oplossing wordt toegevoegd aan 10 mL groeimedium in de kweek, volgens de vereiste eindconcentraties. - Wanneer de cellen in de afatinib-bevattende P100 gerechten subconfluent worden, meng dan goed door aspiratie met een 1 mL pipet en voeg 1 mL celsuspensie toe aan 9 mL vers groeimedium in een nieuw P100 schaaltje. Voeg vervolgens 10-20% hogere concentraties van afatinib toe aan de nieuwe cultuur.
- Verhoog de afatinib-concentratie van 0,1 nM tot 1 μM in het medium door de stapsgewijze dosisescalatie met de afatinib-concentratie met 10-20% bij elke stap over de periode van 10-12 maanden.
Opmerking: Wanneer de afatinib-concentratie de IC50 -waarde benadert, wordt de celgroei behoorlijk traag. Als de cellen zijn gesplitst 1:9, ze mogen niet groeien, als deze cellen worden gedood door hogere concentraties van afatinib. Daarom kunnen de cellen bij hogere afanitib concentraties worden gesplitst in een verhouding van 1:2. De meest resistente cellen werden gekweekt in afatinib-ingesloten medium voor 3-14 dagen, en het medium werd niet veranderd totdat de resistente cellen moesten worden gepasseerde. - Cultuur de afatinib resistente cellen voor 2-3 maanden in 1 μM afatinib-bevattende groeimedium. Bij een afatinib-concentratie van 1 μM zijn 10-12 maanden vereist voor het ontwikkelen van resistentie tegen afatinib in dit model. Voer de MTT-test uit om te bevestigen dat de cellen resistent zijn tegen afatinib. De drie onafhankelijk opgerichte afatinib-Verzets cellijnen werden AFR1, AFR2 en AFR3 genoemd.
2. karakterisering van drie onafhankelijke Afatinib-resistente cellen
- Bepaling van de groeicurve van ouder PC-9 cellen en de instelling van afatinib-resistente cellen
- Kweek de PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 cellen in groeimedium in een 5% CO2 incubator bij 37 °c.
- Respendeer de cellen op 5 x 103 cellen/ml met groeimedium, en zaai 100 μL/goed in een 96-well microplaat, zodanig dat de uiteindelijke concentratie van cellen 500 cellen/100 μL/goed is.
Opmerking: De MTT-test wordt uitgevoerd om de OD570 -waarden te meten op 0, 1, 2, 3, 5 en 7 dagen. 6 96-well micro plates zijn vereist voor elke dag. - Voer de MTT assay elke 24 h en vervolgens op de dagen 0, 1, 2, 3, 5 en 7. Meet de OD570 waarden en bereid 6-12 replicaten; Herhaal de experimenten ten minste drie keer en grafisch plot de resultaten met behulp van een statistische software (Zie tabel met materialen).
- Identificatie van de genomische DNA-veranderingen in EGFR door real-time PCR
Opmerking: Afatinib is een kleine molecuul remmer die zich richt op EGFR tyrosine kinase. De EGFR-uitdrukkings status wordt bepaald op DNA-en eiwit niveaus.- Genomisch DNA wordt geïsoleerd met behulp van een DNA-zuiverings pakket (Zie tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van het geïsoleerde genomische DNA met een spectrofotometer (Zie tabel met materialen) en pas alle GENOMISCHE DNA-monsters aan op 25 ng/μL.
- Versterk 50 ng van genomisch DNA, dat overeenkomt met 2 μL van de 25 ng/μL-voorraden, met behulp van een SYBR Green Master Mix (Zie tabel met materialen) en analyseer de resultaten met behulp van een op fluorescentie gebaseerd RT-PCR-detectiesysteem (Zie tabel met materialen).
Opmerking: PCR-fiets condities begonnen met een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 20 sec., gevolgd door 40 cycli van 95 °C denaturatie voor 3 s, 60 °C gloeien gedurende 30 sec. De specifieke primer sets zijn als volgt: EGFR F: 5 ′-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3 ′, R: 5 ′-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3 ′. Normalisering genlijn-1 F: 5 ′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3 ′, R: 5 ′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3 ′.
- Evaluatie van het effect van eiwit veranderingen op EGFR-niveau door Western Blot-analyse
- Behandel de cellen met afatinib continu voorafgaand aan experimenten voor 24 h. was PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 cellen tweemaal met PBS en zaai ze vervolgens in groeimedia zonder afatinib. Was PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 cellen tweemaal met 5 mL ijskoude PBS.
- Lyse de cellen in Ripa buffer met 1% proteaseremmer cocktail (Zie tabel van de materialen) en fosfatase inhibitor cocktail II en III (Zie tabel van de materialen) en incuberen deze oplossing bij 4 °c gedurende 30 min. Centrifugeer de eiwitlysaten gedurende 10 minuten bij 100 x g en 4 °c en verzamel de geclearde lysaten.
- Bepaal de eiwit concentraties met behulp van de bicinchoninïnezuurassay (Zie tabel met materialen), pas alle eiwit monsters aan 0,5 of 1 μg/μL met behulp van 4x-monster buffer (500 mm tris (pH 6,8), 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% broomfenolblauw) en Kook bij 96 °C gedurende 5 min. Bewaar deze proteïne monsters bij-80 °C tot de analyse van Western Blot wordt uitgevoerd.
- Scheid gelijke hoeveelheden eiwit monsters, bij voorkeur 20-30 μL, met 8% SDS-page en breng de eiwitten over in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.
Opmerking: Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) wordt vaak gebruikt in het lab voor de scheiding van eiwitten op basis van hun molecuulgewicht.- Reinig de glazen platen met ethanol en monteer de glasplaat en de afstandhouders. Bereid 8% poly-acrylamidegels met 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% bis-acrylamide, 10% SDS, 10% APS en TEMED. Polymerize gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Bereid vervolgens een stapel gel met 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrylamide, 10% SDS, 10% APS en TEMED. Voeg de stapelen gel oplossing, steek de kam, en polymeriseren de gel voor 20-30 min bij kamertemperatuur.
- Plaats de gels in het elektroforeseapparaat en vul de tank met een lopende buffer (0,25 M Tris, 1,92 M glycine en 1% SDS). Belasting gelijk hoeveelheid eiwit monsters (20-30 μL) en voer de gel op 180 V. stop elektroforese zodra de kleurstof voorzijde uit de gel stroomt, na ongeveer 60 min.
- Was de gel voor 1-2 min met TBST en breng de eiwitten vervolgens over naar een PVDF-membraan door semi-droge blotting (Zie tabel met materialen) voor 1,5 h bij een constante stroom van 300 Ma.
- Blokkeer de membranen met 5% van de niet-vet droge melk (Zie tabel van de materialen) verdund met TBST oplossing (Zie tabel van de materialen) voor 1 h bij kamertemperatuur, en vervolgens sonde de membranen met anti-EGFR, anti-fosho-EGFR (Y1068), anti-HER2, anti-HER3, anti-MET en anti-actin antilichamen (verdund 1:3000 in TBST) (Zie tabel van de materialen) bij 4 °c 's nachts.
- Was de membranen met TBST driemaal gedurende 10 min en stel de membranen vervolgens bloot aan het secundaire antilichaam (verdund 1:200 in TBST) gedurende 1-1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de membranen vijf keer met TBST gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, stel ze bloot aan de ECL-oplossing (Zie tabel met materialen) en visualiseer de signalen met films.
- Analyse van EGFR-mutaties door sequencing
- Amplify genomisch DNA met specifieke primers voor EGFR-exonen 19-21. De PCR-fiets condities beginnen met een initiële denaturatiestap bij 94 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 30 cycli denaturatie bij 98 °C gedurende 10 sec., gloeien bij 55 °C gedurende 30 sec. en verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut.
Opmerking: De specifieke primers voor EGFR Exon 19: F: 5 ′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3 ′ R: 5 ′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3 ′, exon 20: F: 5 ′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3 ′, R: 5 ′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3 ′, en Exon 21: F: 5 ′-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3 ′, R: 5 ′- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3 ′. - Reinig de versterkte PCR-producten met behulp van een PCR-zuiverings pakket (Zie tabel met materialen) en volg de amplicons.
- Amplify genomisch DNA met specifieke primers voor EGFR-exonen 19-21. De PCR-fiets condities beginnen met een initiële denaturatiestap bij 94 °C gedurende 1 minuut, gevolgd door 30 cycli denaturatie bij 98 °C gedurende 10 sec., gloeien bij 55 °C gedurende 30 sec. en verlenging bij 72 °C gedurende 1 minuut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schema voor het instellen van drie afatinib-resistentie cellijnen van PC-9-cellen met behulp van een stapsgewijze dosis-escalatieprocedure wordt weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 toont een afname van de celproliferatie van ouder PC-9-cellen naarmate de concentratie van afatinib toeneemt, wat aangeeft dat PC-9-cellen gevoelig zijn voor blootstelling aan afatinib. Figuur 3 toont de afatinib-resistentie van de drie cellijnen. Geen van de drie afatinib-resistente cellijnen, AFR1, AFR2 en AFR3 toonde de onderdrukking van celproliferatie onder blootstelling aan afatinib. Figuur 4 toont de celproliferatie CURVEN voor PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 cellen. De drie afatinib-resistente cellijnen vertoonden een significant tragere groei dan de ouder PC-9 cellen. Figuur 5 toont de uitdrukkings niveaus van EGFR gdna in PC-9 en de drie afatinib-resistente cellen, die aangeven dat afatinib-resistente cellen significant hogere niveaus van EGFR gdna hebben uitgedruct dan de ouder PC-9 cellen. Figuur 6 toont de eiwit expressie van EGFR in PC-9-en afatinib-resistente cellen. Bij vergelijkbare gDNA-uitdrukkings niveaus was EGFR-eiwit expressie hoger in resistente cellen dan in ouder PC-9-cellen. Afbeelding 7 toont aan dat de sequentiëren resultaten van EGFR exonen sequentie 19 en 20 in PC-9, AFR1, AFR2, en AFR3 cellen. PC-9 cellen toonden 15 BP verwijderingen in EGFR Exon 19 en wild-type EGFR in Exon 20. Echter, AFR1 en AFR2 cellen tentoongesteld versterking van wild-type EGFR Exon 19. AFR3 cellen bevatten 15 BP verwijderingen in EGFR Exon 19 zoals in PC-9 cellen, maar de puntmutatie T790M werd waargenomen in EGFR Exon 20.
Figuur 1 : Schema van het proces dat wordt gebruikt om drie afatinib-resistente cellijnen van PC-9 te vestigen. Ten eerste werden PC-9-cellen gescheiden in drie P100 gerechten en blootgesteld aan afatinib op 1/10 van de IC50 -waarde. Vervolgens werden de concentraties van afatinib in het groeimedium verhoogd met stapsgewijze dosisescalatie tot 1 μM. Na 10-12 maanden werden drie onafhankelijke, afatinib bestendige cellijnen opgericht en benoemd tot AFR1, AFR2 en AFR3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Ouderlijke PC-9 cellen zijn gevoelig voor de onomkeerbare EGFR TKI, afatinib. Cellen werden opgenomen in een 96-well microplaat bij 2 x 103 cellen/goed/50 μL groeimedium, en 's nachts vooraf geïnincubeerd. De cellen werden behandeld met de aangegeven concentraties van afatinib voor 96 h. Een MTT-test werd uitgevoerd, werden OD570 -waarden gemeten met behulp van een microplaat lezer (Zie tabel met materialen) en uitgedrukt als een percentage van de waarde die voor de controle cellen is verkregen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van waarden van 6-12 replicaatputten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Gevestigde cellen vertoonden weerstand tegen onomkeerbare EGFR TKI, afatinib. Cellen werden opgenomen in een 96-well microplaat bij 2 x 103 cellen/goed/50 μL groeimedium en 's nachts vooraf geïnincubeerd. De cellen werden behandeld met de aangegeven concentraties van afatinib voor 96 h. Een MTT-test werd uitgevoerd, werden OD570 -waarden gemeten met behulp van een microplaat lezer (Zie tabel met materialen) en uitgedrukt als een percentage van de waarde die voor de controle cellen is verkregen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van waarden van 6-12 replicaatputten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Afatinib-resistente cellijnen vertoonden een tragere proliferatie dan ouder PC-9-cellen. Cellen werden in 96-well microplaten in 5 x 102 cellen/100 μL/goed geseeid. De MTT-test werd uitgevoerd en de OD570 -waarden werden gemeten op de dagen 0, 1, 2, 3, 5 en 7 met behulp van een microplaat lezer (Zie tabel met materialen) en uitgedrukt als een percentage van de waarde die voor de controle cellen is verkregen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van waarden van 6-12 replicaatputten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Genkopie aantal EGFR werd verhoogd in afatinib-resistente cellen. De verhoging van het EGFR-gen-Kopieer nummer werd gemeten door kwantitatieve PCR van genomisch DNA geïsoleerd uit PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Het basale gehalte aan EGFR-eiwitten werd verhoogd in afatinib-resistente cellen. Western Blot analyse van fosho-EGFR, EGFR, HER2, HER3, en MET expressie in PC-9, AFR1, AFR2, en AFR3 cellen. β-actin werd gebruikt als ladings controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 : DNA sequentie leest in EGFR exonen sequentie 19 en 20. Genomisch DNA van PC-9, AFR1, AFR2 en AFR3 werd versterkt met specifieke primers voor EGFR Exon 19 en 21, en gezuiverd voor sequencing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een methode beschreven voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen en deze cellen gekarakteriseerd door vergelijking met ouder PC-9-cellen. Door stapsgewijze blootstelling aan de dosisescalatie hebben de ouder PC-9-cellen gedurende een periode van 10-12 maanden resistentie tegen afatinib verworven. Klinisch zijn de resistentiemechanismen voor EGFR-Tki's heterogeen, en daarom werden PC-9-cellen na de eerste behandeling met afatinib verdeeld in drie onafhankelijke P100 gerechten en verder blootgesteld aan afatinib. Aanvankelijk was de celgroei niet significant vertraagd, maar naarmate de geneesmiddelconcentratie de IC50 -waarde benaderde, werd de celproliferatie vertraagd. Dit is een cruciale stap voor het verkrijgen van cellen met verworven resistentie tegen remmers. De prolifererende cellen moeten worden gesplitst en overgebracht naar nieuwe P100 gerechten in een verhouding van 1:10 of 1:5. Wanneer PC-9 cellen werden gekweekt in een P100 gerecht, enige hechting werd waargenomen, maar de meeste cellen groeide in suspensie. Naarmate de concentratie van afatinib werd verhoogd, werden de cellen aan de onderkant van de weefselcultuur behandeld gerechten. Als de meeste cellen zijn aanhandig, kunnen ze worden losgemaakt met een celschraper. De uiteindelijke concentratie van afatinib was 1 μM, wat ongeveer 5 keer de maximale serumconcentratie (CMax)14is. Om duidelijke verschillen tussen ouder-en resistentie klonen te verkrijgen, was de uiteindelijke concentratie hoger dan CMax.
Een ernstige zorg tijdens de procedure is bacteriële besmetting, hoewel RPMI-1640 bevat penicillaire en streptomycine. Om dit te voorkomen, kunnen twee P100 gerechten met vers groeimedium worden bereid wanneer de cellen worden gesplitst. Wanneer de cellen de sub-confluente fase bereiken, kunnen de cellen in één P100-schotel verder worden gesplitst, terwijl de cellen in het andere P100 gerecht kunnen worden opgeslagen bij-80 °c in cryopreservatie medium (Zie tabel met materialen) als een back-up, zodat als één lijn is verontreinigd , kan de opgeslagen regel worden gebruikt.
Het zou moeilijk zijn om de overname van afatinib resistentie bij mensen met behulp van celkweek volledig te reproduceren. De opkomst van de T790M mutatie in EGFR Exon 20 werd gerapporteerd als de dominante oorzaak van resistentie tegen afatinib. In ons rapport bevatte één resistente kloon de T790M mutatie11. Bovendien is de toename van het wild type EGFR, zoals in AFR1 en AFR2 cellen, gemeld door ons en andere groepen15,16. Het verlies van de EGFR-mutatie en de toename van het wild type EGFR wordt ook gerapporteerd in klinische monsters van patiënten met verworven resistentie tegen EGFR-tkis 17,18. Daarom kunnen in vitro studies van ons huidige model de Moleculaire profielen van klinische specimens met verworven resistentie weerspiegelen.
Deze stapsgewijze dosisescalatie methode wordt beschouwd als de meest betrouwbare voor het verkrijgen van verworven resistente cellen lijnen. Echter, initiële hoge dosis afatinib blootstelling in gekweekte cellen zou waarschijnlijk beter weerspiegelen de effecten van de behandeling met afatinib bij patiënten met kanker, hoewel het vaststellen van resistente cellen moeilijker is. Niet alleen zwevende cellijnen, zoals PC-9 maar ook aanhangend cellijnen, zoals HCC827, 11-18 of HCC4006, kunnen voor deze methode worden gebruikt. Deze stapsgewijze dosisescalatie methode is ook nuttig voor het vaststellen van klonen die resistent zijn tegen andere remmers, met behulp van andere cellijnen, die andere soorten kanker vertegenwoordigen.
Blootstelling van ouder cellen aan mutagene agentia, zoals N-ethyl-N-nitrosoureumderivaat, gevolgd door selectie van cellen die resistent zijn voor behandeling met afatinib of osimertinib, is gemeld om een snelle verwerving van resistente klonen mogelijk te maken 19 ,20. Deze kunstmatige methode heeft echter de neiging om specifieke basis vervangingen te veroorzaken, zoals GC bij overgangen en bij TA-transversies. Bovendien is EGFR TKI geen mutageen middel bij patiënten met NSCLC. Daarom is de methode van stapsgewijze dosisescalatie meer representatief dan het gebruik van mutagene agentia.
Hoewel EGFR-TKIs in eerste instantie effectief zijn, ontwikkelen cellen uiteindelijk resistentie tegen dergelijke single-target medicijnen, waardoor het moeilijk is om kanker te genezen. Remmers die zich richten op meerdere moleculen zijn daarom essentieel om te ontwikkelen. Daartoe is het noodzakelijk om cellen te verkrijgen met verworven resistentie tegen multi-doel remmers en de mechanismen te evalueren die de onderliggende resistentie van de drug zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken het lid van het Advanced Cancer Translational Research Institute voor hun doordachte commentaren en Editage voor hun hulp bij het bewerken van Engelse taal. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidie nummer: 16K09590 tot T.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10 cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
References
- Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
- Mitsudomi, T., Yatabe, Y. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer. Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).
- Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy. International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).
- Marshall, J. Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors. Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).
- Hirsh, V. Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer. Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).
- Arcila, M. E., et al. Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay. Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Yang, J. C., et al. Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component. Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).
- Chong, C. R., Janne, P. A. The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).
- Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A. Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).
- Yamaoka, T., et al. Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation. Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).
- Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines. Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).
- Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes. British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).
- Murakami, H., et al. Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4). Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).
- Nukaga, S., et al. Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).
- Nakatani, K., et al. EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR. Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).
- Piotrowska, Z., et al. Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor. Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).
- Ortiz-Cuaran, S., et al. Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors. Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).
- Kobayashi, Y., et al. Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer. Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).
- Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment. Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).
