Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

El objetivo general de este método es desarrollar un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en una inyección intraductal de Ad-Cre en el ratón MG. El enfoque genético basado en la recombinación Cre/loxP se ha utilizado ampliamente para modelar el cáncer de mama humano en ratones. La primera generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP se generan mediante el uso de ratones transgénicos Con confirmación de Cre bajo el control de promotores específicos de MEC (por ejemplo, MMTV-Cre para MECs luminales y una parte de MECs basales, Wap-Cre y Blg-Cre para progenitores luminales y MECs luminales alveolales, K14-Cre para basal y una porción de MECs luminales^1,2,3,4,5)^{6, 7 , 8 , 9}. Sin embargo, si bien estas líneas transgénicas Cre permiten el control espacial de la expresión Cre (es decir, en diferentes subconjuntos de MEC), no permiten el control temporal de la expresión Cre y la manipulación genética mediada por Cre/loxP. La segunda generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP utilizan enfoques inducibles de actividad/expresión de Cre (por ejemplo, el uso de fusión de receptores Cre-estrógeno [CreER], que sólo puede inducir la recombinación de Cre/loxP tras la administración de tamoxifeno), y como resultado, estas herramientas genéticas permiten controles espaciales y temporales de la activación de eventos oncogénicos en MEC (por ejemplo, modelos basados en K8-CreER- y K5-CreER)^10,11,12 . En ambas generaciones de modelos de ratones con cáncer de mama, como promotores utilizados para impulsar la expresión Cre o CreER (por ejemplo, Krt8, Krt5) también pueden estar activos en células epiteliales de otros órganos (es decir, son específicos del tipo celular pero no específicos del órgano) o tienen una expresión de fuga en tipos celulares distintos de las células epiteliales (por ejemplo, MMTV, que tiene actividad con fugas en las células hematopoyéticas de la médula ósea), estos enfoques pueden conducir al desarrollo de cáncer(es) no deseado(s) en otros órganos. Si estos cánceres inesperados causan letalidad en los ratones afectados, el propósito original de modelar el cáncer de mama en estos ratones puede estar prohibido (por ejemplo, eventos oncogénicos impulsados por MMTV-Crepueden conducir a neoplasias malignas hematopoyéticas y muerte temprana de los ratones , debido a la fuga del promotor mmTV en células hematopoyéticas)⁴.

Aquí informamos de un enfoque de modelado de cáncer de mama en ratones que permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente. Este enfoque se basa en una inyección intraductal de Ad-Cre en los MG de ratón (y es, por lo tanto, específico del órgano). La expresión Cre se puede controlar utilizando diferentes promotores específicos de subpoblación MEC incrustados en el vector adenoviral (por ejemplo, Krt8 para MECs luminales, Krt5 para MECbasals, logrando así la especificidad de tipo celular). La inducción del cáncer en MG se puede controlar temporalmente mediante una inyección de Ad-Cre en ratones a diferentes edades, desde los 3-4 semanas de edad (pubertad) hasta la etapa adulta.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Brigham and Women's Hospital.

1. Generación y mantenimiento de ratones floxed

1. Obtener eliminatoria condicional escamariamente relevante para el cáncer de mama (por ejemplo, Trp53^tm1Brn [denominada Trp53^L/L], Brca1^tm1Aash [Brca1^L/L]) o líneas de ratón de knock-in condicionales (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sor^{tm1(Pik3ca*H1047R)Egan}) del repositorio the Jackson Laboratory (JAX) o NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Además, para facilitar la persecución de MECs que se someten a recombinación mediada por Cre, también se puede obtener una línea condicional DeX (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos [denominado R26Y]).
2. Criar ratones homocigotos Trp53^L/L con ratones reportero sorcigonos R26Y o con ratones homocigotos que lleven los alelos de reportero R26Y y cualquier alelos o alelos de knockout condicionales o knock-in adicionales para diferentes modelos de ratón, para obtener progenie heterocigota F1 masculina y femenina.
3. Intercross heterocigoto F1 macho y hembra ratones macho y hembra para obtener ratones hembra compuestos F2 que son homocigotos para cada alelo (como ratones experimentales), así como R26Y-sólo hembras homocigosas (como ratones de control). Ratones Genotipo F2 basados en las imprimaciones PCR y las condiciones de ciclismo enumeradas a continuación, mediante la configuración de dos reacciones pcR estándar de 20 l (utilizando Taq 5X Master Mix) en dos tubos PCR diferentes, uno con las imprimaciones R26Y y el otro con el Trp53^L imprimaciones. Use ratones adultos (normalmente alrededor de 2-4 meses de edad) para toda la cría.
   1. Para R26Y,realice la PCR a 94 oC durante 3 min, luego a 94 oC para 30 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 1 min durante 35 ciclos, seguido de 72 oC durante 3 min, y manteniendo a 14 oC. Utilizar imprimaciones (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
      NOTA: Una sola banda PCR de 250 bp indica un homocigoto R26Y, una sola banda pcR de 500 bp indica un tipo salvaje (WT), y dos bandas de PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indican un heterocigoto R26Y (Figura1A).
      Para Trp53^L,realice la PCR a 94 oC durante 3 min, luego a 94 oC para 30 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 1 min durante 35 ciclos, seguido de 72 oC durante 3 min, y manteniendo a 14 oC. Utilizar imprimaciones (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
      NOTA: Una sola banda PCR de 370 bp indica un homocigoto Trp53^L/L, una sola banda PCR de 288 bp indica un Trp53^+/+ WT, y dos bandas PCR (WT: 288 bp, Trp53^L: 370 bp) indican un Trp53^{L /+} heterocigota(Figura 1B).

2. Preparación preoperatoria

1. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas 1 día antes de la cirugía.
2. Preparar el 0,1% de azul bromofenol en solución salina con fosfato (PBS) y almacenarla a 4 oC. Diluir el Ad-Cre que se utilizará para la inyección intraductal en medio DMEM con 0,01 M CaCl₂ y azul bromofenol en una proporción de 1:10 (es decir, la mezcla de inyección).
   NOTA: El Ad-Cre utilizado aquí se obtuvo del Núcleo vectorial viral de la Universidad de Iowa, con un título viral de stock de 10¹⁰–10¹¹ pfu/ml.
3. Anestesiar al ratón hembra (generación F2 como se describe en el paso 1.2, edad que oscila entre 3 y 4 semanas de edad a adulto) usando una cámara de isoflurano y aplicar pomada para los ojos. Durante el procedimiento, anestesia el ratón continuamente asegurándose de que inhala entre 1% y 2,5% de isoflurano en oxígeno. Compruebe la profundidad de la anestesia al menos cada 15 minutos realizando un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo. Supervise cuidadosamente el ratón para cualquier cambio en la frecuencia respiratoria, ajustando el nivel de isoflurano en consecuencia, si es necesario.
4. Inyectar meloxicam como analgesia por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg, antes del procedimiento quirúrgico.
5. Exponer el sitio quirúrgico del pezón mediante la aplicación de varias gotas de crema para la depilación; eliminar la crema excesiva y el cabello suelto con toallas de papel suave.
   NOTA: Realice este paso en un área separada de donde se va a realizar la cirugía. No se recomienda afeitarse para evitar daños en los pezones. Tenga cuidado para eliminar el agente depilator químico de manera oportuna. Dejar el agente encendido durante demasiado tiempo puede provocar quemaduras químicas en la piel
6. Desinfectar el sitio quirúrgico con iodofors primero, seguido de 70% de alcohol, y terminar con una aplicación final de yodoforos exfoliantes. Haga esto en un movimiento circular desde el centro del área de trabajo hacia la periferia usando una esponja de gasa o un aplicador con punta de algodón. Repita el ciclo 3x–4x.

3. Inyección intraductal

1. Utilice técnicas asépticas durante todo el procedimiento quirúrgico.
2. Hacer un sitio de incisión en la piel a una longitud de 1 cm entre los dos cuartos GM inguinales (Figura2). Separe cuidadosamente el colgajo de la piel (con el MG) del peritoneo parietal para visualizar el árbol ducal mamario.
3. Sostenga cuidadosamente el pezón con fórceps de Watchmaker y retire el pezón exterior sin cortar ninguna piel cercana, usando una tijera de microdisección.
4. Cargue la mezcla de inyección de Ad-Cre de 3 a 5 l en una jeringa de Hamilton de 25 ml con una aguja de cubo metálico de 33 G colocada. Estimar el volumen de la mezcla de inyección en la jeringa en función del tinte azul incluido en la mezcla.
   NOTA: Utilice un volumen más pequeño (p. ej., 3 l) al inyectar en MM de 3-4 semanas de edad hembras y un volumen mayor (por ejemplo, 10 l) al inyectar en los GM de las hembras lactantes.
5. Sujete suavemente el borde de la solapa de la piel con una pinza curvada fina e inyecte lentamente la mezcla de inyección ad-cre en el pezón, mientras tanto monitoreando la propagación del tinte azul en el árbol ducal mamario. Mantenga la tasa de inyección lo más baja posible para evitar daños en el lumen ductal.
   NOTA: El líquido inyectado (como se ilustra en el tinte azul de bromofenol incluido) que se extiende por todo el árbol ductal sin fugas en el compartimento estroveral indica una inyección intraductal exitosa.
6. Retire suavemente la aguja del pezón para evitar cualquier fuga del líquido inyectado.
7. Examine el lado distal (es decir, lejos del pezón) de la MG o el área circundante del pezón inyectado. Tenga en cuenta que la hinchazón de tinte azul (es decir, tinte que se difunde en el estroma cercano) indica una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal exitosa.
8. Cierre las heridas quirúrgicas (del paso 3.2) en la piel con clips de heridas.

4. Cuidado postoperatorio

1. Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una almohadilla de calentamiento dentro de una jaula limpia para su recuperación.
2. Administrar meloxicam por vía subcutánea a 5 mg/kg de nuevo, 24 h después de la cirugía.
3. Controlar las condiciones generales del animal y buscar signos de infección en el lugar de la incisión durante 5 días.
4. Los clips de la herida se retiran de 7 a 10 días después de la cirugía.

5. Seguimiento del desarrollo del tumor mamario

1. Supervise a los ratones inyectados dos veces por semana por palpación para detectar cualquier signo de desarrollo del tumor mamario.
2. Una vez que el tumor es palpable, monitoree el ratón diariamente y mida el tamaño del tumor hasta que llegue a la variable experimental, según lo determine el tamaño (por ejemplo, alcanzando entre el 10% y el 15% del peso corporal del ratón) o la condición (por ejemplo, ulcerosa o necrótica) del tumor, o por el salud general del ratón (p. ej., comatosa, moribundo).
3. Eutanasia del ratón por asfixia por dióxido de carbono, seguido de un método secundario (por ejemplo, luxación cervical).
4. Aísle los tejidos tumorales mamarios y analícelos mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia o perfilado de expresión (por ejemplo, mediante secuenciación de ARN [RNAseq] o microarray), como se describió anteriormente¹².
5. Realizar análisis citométricos de flujo mediante un análisis para las células negativas del linaje (Lin^-: negativo para los marcadores de linaje CD45 [marcador de leucocitos], CD31 [marcador de células endoteliales] y TER119 [marcador de eritrocitos]), y analizar las células del tumor en función de su expresión de YFP, CD24 y CD29.

Los resultados representativos del genotipado de PCR para los alelos R26Y y Trp53L se muestran en la Figura1.

Aunque, en principio, los 10 MG pueden someterse al procedimiento de inyección intraductal, prácticamente, los dos cuartos GM inguinales se seleccionan típicamente para inyección, debido a su accesibilidad más fácil y tamaños mg más grandes (Figura2). Durante la cirugía, es importante mantener un área de trabajo desinfectada y despejada y realizar el procedimiento con herramientas estériles (Figura3). Durante la inyección intraductal, la inclusión de un tinte azul (por ejemplo, azul bromofenol) en la mezcla de inyección ayuda a la visualización de una inyección exitosa de Ad-Cre en todo el árbol ductal (Figura4). Los ratones hembra más jóvenes en los que la inyección intraductal (con un volumen menor de la mezcla de inyección) se puede realizar con éxito son aquellos a 3 semanas de edad (Figura4A),aunque para la mayoría de los experimentos de inducción de tumores mamarios, los ratones hembra adultos jóvenes (por ejemplo, 2 meses de edad) se utilizan normalmente (Figura4B). Además, la inyección intraductal (con un mayor volumen de la mezcla de inyección) también se puede realizar en ratones hembra según la primera/media gestación a las células alveolares objetivo (Figura4C).

En nuestra experiencia, en ratones con el reportero R26Y y Trp53L/L (con o sin alelos condicionales adicionales), la recombinación mediada por Cre interrumpió los alelos condicionales Trp53 (y cualquier alelos condicionales, si se utilizan) y, mientras tanto, encendió al reportero de YFP (del alelo R26Y, así como de cualquier alelo de knock-in condicional adicional, si se utiliza). Para apuntar a diferentes subpoblaciones MEC para la inducción de tumores mamarios, se utilizaron para la inyección de virus Ad-Cre bajo el control de diferentes promotores específicos de subconjuntos MEC (Figura5). Por ejemplo, Ad-Cre bajo el control del promotor de queratina 8 (Krt8) (Ad-K8-Cre) se utilizó para apuntar a MECs luminales. Anteriormente, informamos del uso de Ad-Cre bajo el control del promotor Dekeratin 14 (Krt14) (Ad-K14-Cre) para apuntar a MECs basales13. Sin embargo, como hemos informado, la inyección intraductal de Ad-K14-Cre no sólo se dirigió a MEC basales, sino también una porción de MECs luminales13. Recientemente probamos otro Ad-Cre bajo el control de Keratin 5 (Krt5) promotor (Ad-K5-Cre)14 y encontramos que puede apuntar más firmemente el linaje basal, lo que conduce a la marca genética de sólo MECs basales (Figura 5). Los porcentajes típicos de MEC marcados con YFP de ad-K8-Cre o Ad-K5-Cre inyección son de aproximadamente 0.1%-1%.

Para Trp53L/L; R26Y ratones hembra bajo el fondo genético FVB, la inyección intraductal de Ad-K8-Cre, que se dirige a sus MEC luminales, condujo al desarrollo de tumores mamarios varios meses después de la inyección (Figura6A). Los ratones con un fondo genético diferente (por ejemplo, C57/B6) pueden presentar una latencia más larga del desarrollo de tumores mamarios después de la inyección. Debido a la inclusión del reportero condicional R26Y, las células epiteliales tumorales fueron marcadas típicamente por YFP y podrían ser detectadas por citometría de flujo (Figura6B); podrían enriquecerse con la clasificación de flujo de células YFP+ para su posterior análisis.

Figura 1: Resultados representativos del genotipado de PCR para los alelos R26Y y Trp53L. WT - tipo salvaje; Homo- homocigoto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama esquemático de la inyección intraductal del virus Ad-Cre en una MG. (A) Sitio de incisión en la línea media entre las dos cuartas MG. (B) Inyección intraductal de Ad-Cre con un tinte azul (para una mejor visualización) en uno de los cuartos GM. (C) Cierre de la incisión en la piel por clips de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Descripción general de la configuración aséptica para la cirugía de roedores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Visualización de una inyección intraductal exitosa en todo el árbol ducal mamario. (A) Un ejemplo de la inyección intraductal de 3 l de mezcla inyectable (con azul bromofenol) en una MG de un ratón hembra de 3 semanas de edad. (B) Inyección intraductal de 5 ml de mezcla inyectable en una MG de un ratón hembra adulto joven. (C) Inyección intraductal de 10 ml de mezcla inyectable en una MG de un ratón hembra a principios/mediagestación. (D) Un ejemplo de una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal exitosa. Inyección intraductal de 5 ml de mezcla inyectable en una MG de un ratón hembra adulto joven. (a) El área de la piel que rodea el pezón inyectado; (b) El otro lado del colgajo de la piel que muestra la almohadilla de grasa mamaria; círculo amarillo indica tinte difundido en la almohadilla de grasa.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Gráficas representativas del análisis citométrico de flujo de células marcadas con YFP tras la inyección intraductal. YFP+ poblaciones de MG de R26Y hembras vírgenes 3 días después de una inyección intraductal de Ad-K8-Cre (izquierda, inyección a un mareado de 7 x 109 pfu/mL) o Ad-K5-Cre (derecha, inyección a un titer de 7.86 x 109 pfu/ mL) virus. Las gráficas se basan en un análisis de la tinción CD24 y CD29 en líneas negativas (Lin-; es decir, negativas para la expresión CD45, CD31 y TER119) YFP+ celdas. Lu - Lin-CD24altaPUERTA MEC luminalbaja; Ba - Lin-CD24bajoCD29puerta MEC basal alta; la estrategia de gating para MECs luminales y basales se basa en Shackleton et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Desarrollo del tumor en Trp53L/L; R26Y ratones hembra inyectados por vía intraductal con Ad-K8-Cre. (A) Un ratón representativo que muestra el crecimiento tumoral (flechas) varios meses después de una inyección con Ad-K8-Cre. (B) Alrededor del 8,8% de las células vivas (basadas en la tinción DAPI) de un tumor representativo fueron positivas para la expresión YFP, basadas en el análisis citométrico de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.