Microelectrodos de fibra de carbono modificados por nanopartículas de oro para una detección neuroquímica mejorada

Los microelectrodos de fibra de carbono (CFME)¹ se utilizan mejor como biosensores para detectar la oxidación de varios neurotransmisores cruciales^2,incluyendo la dopamina^3,la noradrenalina⁴, la serotonina^5,la adenosina⁶, histamina⁷, y otros⁸. La biocompatibilidad y el tamaño de las fibras de carbono las hacen óptimas para la implantación, ya que hay daños tisulares mitigados en comparación con los electrodos estándar más grandes. ⁹ Se sabe que las CFMEs poseen propiedades electroquímicas útiles y son capaces de realizar mediciones rápidas cuando se utilizan con técnicas electroquímicas rápidas, más comúnmente cyclicammetría de escaneo rápido (FSCV)^10,11. FSCV es una técnica que escanea el potencial aplicado rápidamente y proporciona una voltografía cíclica específica para analitos específicos^12,13. La gran corriente de carga producida por el escaneo rápido es estable en fibras de carbono y se puede restar en segundo plano para producir voltografías cíclicas específicas.

Debido a su óptima electroquímica y importancia neurobiológica, la dopamina ha sido ampliamente estudiada. La dopamina de la catecolamina es un mensajero químico esencial que desempeña un papel fundamental en el control del movimiento, memoria, cognición, y la emoción dentro del sistema nervioso. Un excedente o deficiencia de dopamina puede causar numerosas interferencias neurológicas y psicológicas; entre ellos se encuentran la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y el comportamiento adictivo. Hoy, Enfermedad de Parkinson sigue siendo un trastorno frecuente debido a la degeneración de las neuronas del cerebro medio implicadas en la síntesis de dopamina¹⁴. Los síntomas de la enfermedad de Parkinson incluyen temblor, lentitud del movimiento, rigidez y problemas para mantener el equilibrio. Por otro lado, estimulantes como la cocaína¹⁵ y la anfetamina^16,17 promueven el desbordamiento de dopamina. Abuso de drogas eventualmente sustituye el flujo regular de dopamina y condiciones del cerebro para requerir un excedente de dopamina, que finalmente conduce a comportamientos adictivos.

En los últimos años, ha habido un énfasis en la mejora de la funcionalidad del electrodo en la detección de neurotransmisores¹⁸. El método más extendido para mejorar la sensibilidad de los electrodos es recubrir la superficie de la fibra. Sorprendentemente, ha habido una investigación limitada sobre la electrodeposición de nanopartículas metálicas en fibras de carbono¹⁹. Las nanopartículas metálicas nobles, como el oro, pueden electrodepositarse en la superficie de la fibra con otros materiales funcionales^20. Por ejemplo, aumentar la superficie electroactiva para la adsorción de neurotransmisores a ocurrir. Las nanopartículas metálicas electrodepositadas se forman rápidamente, se pueden purificar y adherirse a la fibra de carbono. La electroquímica sigue siendo significativa tanto para la deposición de nanopartículas metálicas nobles como para la mejora de la superficie de las fibras de carbono, ya que permite el control de la nucleación y el crecimiento de estas nanopartículas. Por último, el aumento de las características catalíticas y conductoras, y la mejora del transporte de masas son otras ventajas de la utilización de nanopartículas metálicas para el electroanálisis.

El curso de secuencia de Laboratorio Avanzado de la Universidad Americana (Química Biológica Experimental I y II CHEM 471/671-472/672) es una combinación de laboratorios analíticos, físicos y bioquímicos. El primer semestre es una visión general de las técnicas de laboratorio. El segundo semestre es un proyecto de investigación dirigido por estudiantes y dirigido²¹. Para estos proyectos, los estudiantes han examinado previamente el mecanismo de biomolécula, proteína, péptido y síntesis facilitada por aminoácidos de nanopartículas de oro^22,23. El trabajo más reciente se ha centrado en la formación de la producción de nanopartículas de oro (AuNP) en superficies de electrodos y la evaluación de los efectos de los AuNP en la capacidad de las CFMEs para detectar neurotransmisores. En el presente trabajo, el laboratorio ha aplicado esta técnica para demostrar que la sensibilidad de las CFMEs en la detección de la oxidación de la dopamina se mejora a través de la electrodeposición de AuNP sobre la superficie de la fibra. Cada bare-CFME se caracteriza por variar la velocidad de exploración, estabilidad y concentración de dopamina al detectar corrientes oxidativas de dopamina para medir la oxidación de la dopamina en la superficie de la CFME. Au³⁺ fue entonces electroreducido a Au⁰ y simultáneamente electrodepositado en la superficie de fibra como nanopartículas, seguido de una serie de experimentos de caracterización. Después de una comparación directa, los AuNP-CCFEs fueron encontrados para poseer mayor sensibilidad de la detección de dopamina. El recubrimiento uniforme de AuNP sobre la superficie de la fibra a través de la electrodeposición hace que una superficie electroactiva más alta; por lo tanto, aumentar la adsorción de la dopamina en la superficie del electrodo modificado. Esto condujo a corrientes oxidativas de dopamina más altas. La separación potencial de los picos de oxidación y reducción de dopamina (E_p) de AuNP-CME también fue menor, lo que sugiere una cinética de transferencia de electrones más rápida. Los trabajos futuros de este estudio incluyen la prueba in vivo de las CFMEs desnudas y AuNP-CFMEs para la detección de dopamina.

1. Construcción de microelectrodos de fibra de carbono

1. Preparación de fibras de carbono
   1. Para crear microelectrodos de fibra de carbono, primero separe las fibras de carbono (fibra de carbono, 7 mm de diámetro) una por una usando manos, guantes y espátulas.
   2. Tire o tire de una fibra del hilo retorcido.
   3. Aspirar una fibra de carbono aislada en un capilar de vidrio (vidrio capilar de borosilicato de un solo barril sin microfilamento, diámetro exterior de 1,2 mm, diámetro interior de 0,68 mm).
   4. Cree un soporte de electrodos para los electrodos cortando un pedazo de cartón que tenga aproximadamente 10 cm de longitud por 25 cm de ancho.
2. Tire de los electrodos con un tirador capilar vertical.
3. Abra la puerta corredera del tirador capilar vertical.
4. Afloje y retire la varilla metálica del soporte, girando el taladro-chuck en sentido contrario a las agujas del reloj con suficiente espacio para insertar el capilar de vidrio.
5. Inserte el capilar de vidrio en el soporte del electrodo. Elevar el capilar de vidrio a la parte superior del capilar vertical manualmente a mano.
6. Apriete el capilar de vidrio con los taladros en el sentido de las agujas del reloj sin romper o romper los capilares de vidrio.
7. Ajuste los ajustes Calentador 1, Calentador 2 e Magnet o Magnet a los niveles sugeridos por el fabricante para tirar de los capilares de vidrio a un cónico fino para materiales de electrodos.
8. Pulse el botón de inicio rojo para calentar la bobina enrollada para tirar de los electrodos a través de la presión, la gravedad y el calentamiento.
9. Deje que la bobina enrollada se enfríe desde su estado rojo caliente. Corte la fibra de carbono con tijeras que conectan los dos electrodos tirados de arriba a abajo. Utilice el método de perforación-chuck para eliminar el capilar de vidrio del tirador capilar vertical girando en sentido contrario a las agujas del reloj.

2. Preparación de microelectrodos de fibra de carbono

1. Bajo un estereoscopio o microscopio, corte la fibra de carbono que sobresale de la superficie del capilar de vidrio con tijeras quirúrgicas o una cuchilla de afeitar afilada a aproximadamente 100 –150 m de longitud.
2. Preparar una solución de epoxi mezclando 10 g de epoxi con 0,2 ml de endurector en un vial de 25 ml utilizando un hisopo de algodón.
3. Sumerja sólo la punta de cada electrodo en la solución de epoxi y endurecedor durante aproximadamente 15 s.
4. Sumerja la parte superior antes mencionada del microelectrodo de fibra de carbono en acetona durante aproximadamente 3 s para lavar cualquier exceso de epoxi del barril del microelectrodo de fibra de carbono.

3. Electrodeposición

1. Coloque el electrodo de trabajo (microelectrodo de fibra de carbono) en la solución de 0,5 mM HAuCl₄ además del electrodo de referencia, cloruro de plata y plata (Ag/AgCl) utilizando el micromanipulador.
2. Conecte el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia al potenciostato y al escenario.
3. Abra el software UNC HDCV. Cambie la configuración del software para aplicar la forma de onda. Introduzca la siguiente forma de onda en la configuración del ordenador: escanear de 0,2 V a 1,0 V en una solución de KCl de 0,1 M que contiene 0,5 mM HAuCl₄ a una velocidad de escaneo de 50 mV/s durante 10 ciclos. Presione la flecha verde para aplicar la forma de onda. A continuación, pulse el botón de inicio para iniciar la grabación de las mediciones.

4. Microscopía electrónica de barrido

NOTA: Microelectrodos de fibra de carbono modificados por nanopartículas de imagen y oro utilizando el instrumento de microscopía electrónica de barrido (SEM). Cargue la muestra en cinta conductora negra y siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante.

1. Encendido del instrumento
   1. Gire la tecla a START y suelte.
   2. Abra el software InTouchScope haciendo doble clic en él.
   3. Suelte la llave. Debería aterrizar en el símbolo I por sí solo.
   4. Espere a que el botón EVAC deje de parpadear.
   5. Una vez que el botón EVAC deje de parpadear, pulse el botón VENT.
   6. Espere a que el botón VENT deje de parpadear.
   7. Asegúrese de que la distancia de trabajo (WD) sea de 20 mm – 30 mm.
   8. Mientras espera, prepare la(s) muestra(s).
2. Escaneo
   1. Una vez que el botón VENT deje de parpadear, cargue la(s) muestra(s) en el instrumento.
   2. Asegúrese de que la parte curva del portamuestras esté apuntando hacia el instrumento al cargar las muestras.
   3. Pulse el botón EVAC una vez que se carguen las muestras.
   4. Ajuste la distancia de trabajo a 10 mm.
   5. Una vez que el botón EVAC deje de parpadear, encienda el ordenador.
   6. Haga clic en el software In Touch Scope, ubicado en el escritorio. Hay dos software In Touch Scope, haga clic en el que no tiene el círculo verde y amarillo.
   7. Una vez que el software se abre, haga clic en OBSERVE (arriba a la derecha de la pantalla), para encender la viga. Asegúrese de que el botón EVAC ha dejado de parpadear antes de hacer clic en OBSERVE.
   8. Comience a analizar la(s) muestra(s).
   9. Asegúrese de que los ajustes de voltaje, distancia de trabajo (WD) y corriente de sonda (PC) sean aceptables.
   10. Alejar (50X) para un ajuste más alto y acercar para un ajuste más bajo.
   11. Ajuste la distancia de trabajo a 10 mm.
   12. Antes de tomar una foto de la(s) muestra(s), asegúrese de que la imagen se guardará en la carpeta de destino deseada.
   13. Para elegir la carpeta deseada, haga clic en la configuración (arriba a la izquierda de la pantalla).
   14. Exporte las imágenes desde el ordenador a través de una unidad flash.
3. Apagar
   1. Haga clic en OBSERVE para apagar la viga.
   2. Pulse el botón VENT y espere a que deje de parpadear.
   3. Mientras espera a que el botón VENT deje de parpadear, ajuste la distancia de trabajo de nuevo a 20 mm – 30 mm.
   4. Una vez que el botón VENT deje de parpadear, descargue las muestras del instrumento.
   5. Pulse el botón EVAC y espere a que deje de parpadear.
   6. Una vez que el botón EVAC deje de parpadear, salga del software y apague el ordenador.
   7. Gire la tecla al símbolo O para apagar completamente el instrumento.

5. Pruebas de voltammetría cíclica de exploración rápida

1. Conecte el microelectrodo de fibra de carbono al potenciostato y al escenario de la cabeza junto con el electrodo de referencia Ag/AgCl.
2. Con el micromanipulador, baje el microelectrodo de fibra de carbono en el pozo de la célula de flujo ajustando manualmente las perillas de medición X, Y y Z.
3. Preparar la solución tampón en agua DI (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂y 2,0 mM Na₂SO₄ con el pH ajustado a 7,4).
4. Llene la celda de flujo con el búfer de solución salina tamponada de fosfato (PBS) (pH a 7,4).
5. Con una jeringa tampón de 60 ml llena, inyecte el búfer pbS en la celda de flujo a aproximadamente 1 ml/min.
6. Coloque el electrodo en la celda de flujo y aplique la forma de onda pulsando el botón verde. Observe el osciloscopio y corte el electrodo o ajuste la ganancia para evitar sobrecargas. Permita aproximadamente 10 minutos de equilibrio entre cada carrera de electrodo.
7. Establezca la forma de onda predeterminada en la forma de onda de dopamina. Escanee de – 0,4 V a 1,3 V a 10 Hz y 400 V/s.
8. Preparar la solución de stock de 10 mM de dopamina, serotonina, noradrenalina, y otros en ácido perclórico. Diluir los neuroquímicos a una concentración final de 1 m en tampón mediante la pipeta de 1 M de la solución de stock de dopamina en 10 ml de tampón de PBS utilizando una pipeta.
9. Para comenzar las mediciones, pulse el botón de grabación. Después de 10 s, inyectar 0,2 ml de dopamina de 1 M en la célula de flujo o cualquier otra concentración de neurotransmisor. Ajuste la concentración, la velocidad de escaneo, la forma de onda (potencial de retención o potencial de conmutación) en consecuencia. Establezca el tiempo de ejecución total para 30 s.
10. Analice la ejecución utilizando el software de análisis HDCV. Cambie los parámetros según sea necesario.
11. Una vez completado el experimento, limpie la celda de flujo inyectando 3 ml de agua y luego aire en el búfer y los puertos de inyección de la célula de flujo tres veces cada uno.
12. Apague la forma de onda y el instrumento.

Para la Figura1, mostramos un esquema donde se utilizan pruebas FSCV para medir la concentración de neurotransmisores in vitro. La Figura 1 muestra la forma de onda de dopamina aplicada. La forma de onda triangular escanea de -0,4 V a 1,3 V a 400 V/s. En la segunda parte de la figura a la izquierda, muestra la oxidación de la dopamina a la dopamina-orto-quinona (DOQ), un proceso de transferencia de dos electrones se produce desde la superficie del analito a la superficie del electrodo. Por último, un trazado actual frente al tiempo se superpone con un trazado de color. La gráfica actual frente al tiempo es una representación de la oxidación de la dopamina. Es plana cuando no hay oxidación de dopamina, y se eleva verticalmente cuando la dopamina se oxida a dopamina-ortoquinona y se reduce de nuevo a la dopamina como los adsorbes de analito, y posteriormente, desorbes de la superficie del electrodo. La gráfica de color es una gráfica tridimensional de la corriente. La corriente amarilla es la corriente de fondo (cerca de cero), mientras que la gráfica verde es la corriente de oxidación positiva (oxidación de dopamina a la ortoquinona de dopamina), y la gráfica azul es la corriente de reducción negativa (reducción de la ortoquinona de la dopamina a la dopamina).

SEM se utilizó para imágenes de las características superficiales de los electrodos de carbono desnudos y modificados. En la Figura2, vemos una diferencia única en las características de la superficie entre tres tipos diferentes de materiales de electrodos. En la Figura 2a,se muestra un microelectrodo de fibra de carbono desnudo. La fibra es de aproximadamente 7 m de diámetro con crestas cilíndricas a lo largo del exterior. La Figura 2b muestra nanopartículas de oro electrodepositadas en la superficie de la fibra de carbono durante aproximadamente 20 minutos con una gran cresta afilada de oro que sobresale de la superficie de la fibra de carbono. La presencia de oro se verificó aún más con mediciones EDS/EDX. Luego redujimos el tiempo de electrodeposición a 5 min donde observamos un oro de recubrimiento uniforme delgado como se muestra en la Figura 2c.

Comparación de sensibilidad y transferencia de electrones

La Figura 3a muestra una comparación de sensibilidad y transferencia de electrones. Como se muestra con los voltammogramas cíclicos superpuestos, los microelectrodos de fibra de carbono modificados en oro tienencorrientes oxidativas pico significativamente más altas (Figura3b)y cinética de transferencia de electrones más rápida (EP). La significancia se midió con una prueba t no emparejada (P a .004 y .0016, respectivamente). Las barras de error son un error estándar de la media.

Estabilidad

El desnudo(Figura 4a)y la nanopartícula de oro modificada (Figura4b) CFMEs se colocaron en la célula de flujo durante 4 h. Se tomaron medidas para la detección de 1 M de dopamina cada hora durante 4 horas. Ambos electrodos tenían una respuesta estable con respecto a la dopamina. Una respuesta estable a la dopamina (sin oxidación del agua) es de vital importancia para realizar mediciones en el tejido biológico. Las barras de error son un error estándar de la media.

Tasa de escaneo

La velocidad de escaneo fue variada de 100 V/s a 1.000 V/s. Tanto los electrodos desnudos (Figura5a)como las nanopartículas de oro (Figura5b)mostraron una respuesta lineal con respecto a la detección de dopamina, lo que indica el control de adsorción a la superficie de la nanopartícula desnuda y dorada modificada microelectrodo. Las barras de error son un error estándar de la media.

Concentración

La concentración fue variada de 100 nM a 100 m de dopamina para desnudas (Figura6a)y nanopartículas de oro modificadas (Figura 6b)microelectrodos de fibra de carbono. El rango lineal fue de 100 nM a 10 m. Después de 10 m, observamos una curva asintótica que denota que la dopamina está sobresaturada en la superficie del microelectrodo de fibra de carbono. La respuesta lineal para la corriente de oxidación máxima de la dopamina con respecto a la concentración de dopamina denota control de adsorción a la superficie del electrodo. Las concentraciones fisiológicamente relevantes de dopamina en el cerebro están dentro de este rango y varían entre las regiones del cerebro.

Figura 1. Un esquema de oxidación de dopamina. Superposición de microelectrodo de fibra de carbono oxidante de dopamina. Transferencia de carga se muestra desde la superficie como la dopamina se oxida a la dopamina-ortoquinona y de vuelta a la dopamina como se aplica la forma de onda de dopamina triángulo (-0.4 V a 1.3 V a 400 V / s). Las gráficas actuales frente a la hora y el color se muestran que denotan la oxidación de la dopamina (verde) y la reducción de la dopamina (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Imágenes SEM de (a) microelectrodos de fibra de carbono desnudos, (b) microelectrodos de fibra de carbono modificados de nanopartículas de oro con un tiempo de deposición de electrodos de 20 minutos y (c) microelectrodos modificados con nanopartículas de oro con un tiempo de deposición de electrodos de 5 minutos. Esto proporciona una prueba de los principales resultados de que el tamaño y el grosor de los recubrimientos de nanopartículas de oro pueden ser controlados por el tiempo de electrodeposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Comparación de sensibilidad de electrodos desnudos y dorados modificados. (A) Superposición de voltografías cíclicas de microelectrodos modificados con nanopartículas desnudas y doradas. (B). Gráfico de barras que denota las diferencias en la corriente oxidativa pico de microelectrodos modificados con nanopartículas desnudas y doradas. (C). Gráfico de barras que muestra la diferencia enel EP entre los microelectrodos modificados con nanopartículas desnudas y doradas. Las barras de error son un error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Experimento de estabilidad. (A) Los microelectrodos modificados con nanopartículas de oro y (B) se colocaron en una celda de flujo para un total de al menos 4 horas. Su sensibilidad hacia la dopamina de 1 M se midió a lo largo de 4 h. Ambos tuvieron una respuesta uniforme a la dopamina sobre 4 h. Barras de error son error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Experimento de velocidad de escaneo. (A) Losmicroelectrodos modificados con nanopartículas de oro y sin oro se colocaron en una celda de flujo, y la velocidad de escaneo varió de 100 V/s a 1.000 V/s. Tanto los microelectrodos modificados por nanopartículas desnudas como las de oro tenían una respuesta lineal con respecto a la velocidad de escaneo, denotando así el control de adsorción de la dopamina a la superficie del microelectrodo de fibra de carbono modificado por nanopartículas desnudas y doradas. Las barras de error son un error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Experimento de concentración. (A) Microelectrodos modificados con nanopartículas de oro y (B) fueron expuestos a varias concentraciones de dopamina 100 nM – 100 m. Tanto los microelectrodos modificados por nanopartículas desnudas como las de oro tenían una respuesta lineal con respecto a la dopamina de hasta 10 m, lo que denotaba el control de adsorción a la superficie del electrodo. A concentraciones superiores a 10 m, observamos una curva asintótica, que es indicativa de saturación de dopamina en la superficie del electrodo ocupando todos los sitios de adsorción y resultando en un mayor control de difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.