Este protocolo demuestra metodologías para un modelo de ratón de lesión cerebral traumática de cráneo abierto y trasplante de células pluripotentes derivadas de células madre inducidas por el ser humano cultivadas en el sitio de la lesión. Las pruebas conductuales y histológicas de los resultados de estos procedimientos también se describen brevemente.
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Artículo de método
Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre
En este artículo
Resumen
Resumen
La lesión cerebral traumática es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La patología de la enfermedad debido a tAT progresa desde el insulto mecánico primario hasta los procesos de lesiones secundarias, incluyendo la apoptosis y la inflamación. El modelado animal ha sido valioso en la búsqueda para desentrañar los mecanismos de lesión y evaluar posibles terapias neuroprotectoras. Este protocolo describe el modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal y de cabeza abierta. Específicamente, se describen los parámetros para producir una lesión cortical unilateral leve. Las consecuencias conductuales de CCI se analizan utilizando la prueba de eliminación de cinta adhesiva de la integración sensorimotor bilateral. En cuanto a la terapia experimental para la patología TBI, este protocolo también ilustra un proceso para trasplantar células cultivadas en el cerebro. Los cultivos celulares neuronales derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) fueron elegidos por su potencial para mostrar una restauración funcional superior en pacientes tBI humanos. La supervivencia crónica de los hiPSC en el tejido cerebral del ratón huésped se detecta mediante un proceso inmunohistoquímico DAB modificado.
Introducción
Lesión cerebral traumática (TBI) es un término general para la lesión adquirida en el cerebro debido a fuerzas mecánicas indirectas (aceleración/desaceleración rotacional o contragolpe) de golpes en la cabeza o daño directo de objetos o ondas explosivas. Se ha estimado que el TBI es la causa de aproximadamente el 9% de las muertes en todo el mundo y se ha observado en unos 50 millones de casos por año1,2. Un informe de 2017 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades estimó que en 2013 hubo un total de 2,8 millones de visitas hospitalarias y muertes debidas a TBI en los Estados Unidos
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Protocolo
Todos los experimentos descritos en este protocolo fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Servicios Uniformados.
1. Craniectomía e impacto cortical controlado
- Preparación del dispositivo de impacto cortical controlado y suministros quirúrgicos.
- Cargue una jeringa de punta deslizante de 1 ml con 0,5 ml de solución salina estéril para el riego de heridas. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa para controlar el riego.
- Preparar una solución diluida de CsA en DMSO a la concentración final de 1 mg/ml. Cargue una segunda jeringa de punta deslizante de 1 ml con 0,5....
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Resultados
La cirugía de craneectomía facilita la lesión cerebral experimental y el trasplante de células terapéuticas: el modelo de impacto cortical controlado de la lesión cerebral y la posterior terapia de trasplante celular requieren una extracción cuidadosa del cráneo que pasa. La craniectomía se puede realizar en cualquier superficie dorsal del cráneo para permitir manipulaciones en la región cerebral de interés. El diagrama de la Figura 1 muestra un esquema de craneectomía de 5 .......
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Discusión
Mild CCI como sistema modelo para probar la terapia regenerativa experimental
El modelo CCI es una herramienta valiosa para investigar los mecanismos de disfunción tisular después de una lesión mecánica en la corteza. La adenabilidad de los parámetros de lesión es una característica atractiva de este modelo. Alterar la profundidad Z del impacto, la velocidad o el tiempo de permanencia puede aumentar o disminuir la gravedad de la lesión según lo deseado por el investigador10
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Centro de Neurociencia y Medicina Regenerativa (CNRM, número de subvención G170244014). Agradecemos la asistencia de Mahima Dewan y Clara Selbrede en estudios piloto de eliminación de adhesivos. Kryslaine Radomski realizó cirugías preliminares de lesión cerebral y trasplante de células. Amanda Fu y Laura Tucker del laboratorio central de USU CNRM Preclinical Studies proporcionaron valiosos consejos sobre cirugías de animales y pruebas de comportamiento, respectivamente.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringas de 1 ml | Becton Dickinson (BD) | ||
| tubos de ensayo abatibles de 1,7 ml | Denville | C2170 | |
| jeringa de 10 microlitros | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide jeringas | Becton Dickinson (BD) | ||
| 70% de etanol | Producto de elección; varía según la región | ||
| acetaminofén suspensión oral | Tylenol (Niños) | Diluido a 1 mg/ml en agua | |
| vaporizador anestésico | Vetland | 521-11-22 | |
| paño | de manipulación animal Compra en tienda departamental | ||
| Productos Betadine | Purdue | NDC-67618-151-32 | |
| oxígeno | Producto de elección; varía según la región | ||
| ciclosporina A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| kit de tinción DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| anticuerpo IgG anti-ratón de burro, HRP conjugado | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| cinta aislante | 3M Corporation | Compra en | |
| almacenes pinzas finas Pinzas | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pinzas | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| pipetas capilares de vidrio, 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| Kit de micromotor rotativo de alta velocidad | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Juego de rebabas ideal de micro taladro de 5 | puntos de celda Scientific | 60-1000 | |
| Impacto Un impactador estereotáxico para CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurano | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| temporizadores de banco | de laboratorio Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Extractor de micropipetas | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Cualquier tirador será suficiente |
| Cubreobjetos de microscopio | Fisherbrand | 12-545-E Medio | |
| portaobjetos de microscopio | Producto de elección | ||
| espejo Compra en grandes almacenes | |||
| ratón anticuerpo anti-antígeno nuclear | humano Millipore MAB1281 | ||
| Ratón en ratón kit de bloqueo | Vector Laboratorios | BMK-2202 | |
| portaagujas hemostático | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ungüento oftálmico | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| tijeras de resorte oftálmico | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| caja | de plástico Compra en grandes almacenes | ||
| cilindro | Compra en grandes almacenes | ||
| QSI bomba de jeringa motorizada | Stoelting | 53311 | |
| Racor de compresión de aguja extraíble | Hamilton | 55750-01 | |
| pequeño roedor marco estereotáxico | Stoelting | 51925 | |
| tijeras pequeñas | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | ||
| Almohadillas estériles para la preparación con alcohol | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| bastoncillos de algodón estériles/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Solución salina estéril | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Cronómetros (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus Gold | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| suturas - seda 5.0 con aguja curva | Oasis | MV-682 |
Referencias
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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Reimpresiones y permisos
