Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética. los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.
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Artículo de método
Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética
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En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de tejido humano primario y células es ideal para la investigación de procesos biológicos y fisiológicos como el proceso regenerativo del músculo esquelético. Existen desafíos reconocidos para trabajar con células madre adultas primarias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPC) derivadas de biopsias del músculo esquelético, incluyendo bajo rendimiento celular del tejido recogido y un gran grado de heterogeneidad de los donantes de parámetros de crecimiento y muerte entre las culturas. Si bien la incorporación de la heterogeneidad en el diseño experimental requiere un tamaño de muestra mayor para detectar efectos significativos, también nos permite identificar mecanismos que subyacen a la variabilidad en la capacidad de expansión de hMPC, y por lo tanto nos permite entender mejor heterogeneidad en la regeneración muscular esquelética. Nuevos mecanismos que distinguen la capacidad de expansión de los cultivos tienen el potencial de conducir al desarrollo de terapias para mejorar la regeneración muscular esquelética.
Introducción
El músculo esquelético es el sistema de órganos más grande del cuerpo humano, representando entre el 30 y el 40 % de la masa corporal entera1. Además de su papel bien reconocido en la locomoción, el músculo esquelético mantiene la temperatura corporal y la postura, y juega un papel central en la homeostasis de nutrientes de todo el cuerpo. La investigación en la que participan participantes humanos, animales y modelos de cultivo celular son valiosos para abordar cuestiones relacionadas con la biología y la regeneración del músculo esquelético. El aislamiento y el cultivo de células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) proporcionan u....
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Cornell. Todos los participantes fueron examinados para detectar las condiciones de salud subyacentes y se les dio su consentimiento informado.
1. Obtención de tejido muscular humano a través de la biopsia muscular esquelética
- Identificar el músculo vastus lateralis a través de la palpación, puntos de referencia anatómicas, y la contracción activa del músculo.
- Palpate el vastus lateralis haciendo que el participante apriete su músculo del cuádriceps y encuentre el vientre del músculo, alrededor de 1/3 del camino de la rótula a la cade....
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Resultados
Los resultados representativos de la citometría de flujo del aislamiento hMPC del tejido muscular humano se pueden ver en la Figura1. los hMPCs se pueden identificar mediante los primeros eventos de gating basados en dispersión lateral y dispersión hacia adelante para eliminar células muertas o escombros, seguidos de seleccionar sólo las celdas que son negativas para 7-AAD y por lo tanto son viables. La selección de celdas positivas para los marcadores de sup.......
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Discusión
Los hMPC primarios son un modelo de investigación importante utilizado para entender la biología muscular esquelética y el proceso regenerativo. Además, los hMPCs tienen el potencial de ser utilizados para la terapia. Sin embargo, hay desafíos reconocidos en el uso de hMPCprimarios primarios para la investigación y la terapia, incluyendo la comprensión limitada de las células derivadas de los seres humanos10. También hay un gran grado de variación en la capacidad de expansión entre los cultivos de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad de Cornell, Biotechnology Resource Center Imaging Facility por su ayuda con la clasificación celular activada por fluorescencia. También agradecemos a Molly Gheller por su ayuda con el reclutamiento de participantes y Erica Bender por llevar a cabo las biopsias del músculo esquelético. Por último, agradecemos a los participantes su tiempo y participación en el estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R01AG058630 (a B.D.C. y A.E.T.), por una Glenn Foundation for Medical Research y American Federation for Aging Research Grant f....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25 % de tripsina, EDTA 2,21 mM | Corning | 25-053-Cl | Tripsina utilizada para eliminar las hMPC adherentes de los recipientes de cultivo celular Placa de |
| 10 cm | VWR | 664160 | Placas utilizadas para el cultivo de hMPCs |
| Tubo Falcon de 15 mL Tubos | Falcon | 352196 | 15 mL utilizados en los protocolos de aislamiento y cultivo hMPC |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Grenier Bio-One | 662 160 | placas utilizadas para el cultivo hMPCs |
| Solución de tinción de viabilidad 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | Tinción de viabilidad para identificar células vivas durante la clasificación de FACS |
| Alexa Fluor 488 anti-humano CD29, Clon: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Anticuerpo conjugado para FACS |
| Placa de cultivo celular negra de 96 pocillos | Grenier Bio-One | 655079 | placa de cultivo celular de 96 pocillos ideal para la obtención de imágenes fluorescentes con el Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Citómetro de imágenes utilizado para el seguimiento de cultivos hMPC | |
| Filtro de células | VWR | 352350 | Filtro de células para eliminar grandes trozos de residuos durante el procesamiento de la biopsia muscular |
| Colágeno Tipo I (Rata Cola) | Corning | 354236 | Colágeno para el recubrimiento de placas de cultivo celular |
| Colagenasa D | Roche | 11 088 882 001 | Se utiliza para la degradación del colágeno y otros tejidos conectivos en el tejido de la biopsia del músculo esquelético |
| Dimetilsulfóxido | VWR | WN182 | Se utiliza para la criopreservación de hMPCs |
| Dispasa II | Sigma Life Sciences | D4693 | Una proteasa utilizada para la digestión enzimática del tejido |
| de la biopsia del músculo esqueléticoDulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucosa en polvo | Gibco | 31600-034 | DMEM bajo en glucosa para el procesamiento de biopsias musculares |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Gibco | 21600-010 | PBS para el procesamiento de biopsias musculares |
| EDTA Sal disódica dihidratada | J.T. Baker | 4040-01 | Necesario para el búfer FACS |
| Suero fetal bovino | VWR | 89510-186 | Suero fetal bovino utilizado para medios de crecimiento hMPC |
| Medios de base para | hMPCs | ||
| Suero equino inactivado por calor | Gibco | 26-050-070 | Suero de caballo utilizado para hacer medios de diferenciación hMPC |
| Hemocitómetro | iNCyto | DHC-N0105 | Utilizado para contar células |
| Hibernar Un | Gibco | A1247501 | medios para preservar la biopsia del músculo esquelético tejido |
| Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidrato | Life Technologies | Tinción de ADN H21492 | para la identificación de todas las células utilizando el Celigo |
| S Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Se utiliza para la congelación a velocidad controlada de hMPCs |
| Tampón Moxi | Orflo | MXA006 | Tampón para contador de células automatizado |
| Casetes Moxi | Orflo | MXC002 | Cassesttes para contador de células automatizado |
| Moxi z Mini Contador de células automatizado | Orflo | Contador de células automatizado | |
| Mr. Frosty Contenedor de congelación | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 Contenedor de | congelación de células de tasa controlada disponible comercialmente |
| Suero de cabra normal (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Suero de cabra utilizado en el tampón |
| FACSPE-Cy7 Ratón Anti-humano CD56 , Clon: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Anticuerpo conjugado para FACS |
| Penicilina/estreptomicina 100x Solución | Corning | 30-002-CI | Antibióticos añadidos a los medios |
| de cultivo Yoduro de propidio | Thermo Fisher Scientific | Tinción de ADN P3566 | para la identificación de células muertas utilizando el |
| factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante | Promega | G5071 | Suplemento en medios de crecimiento hMPC para evitar la diferenciación espontánea |
| Medio de congelación de cultivo celular de recuperación | Gibco | 12648-010 | Medios utilizados para la crioperseve de biopsias musculares |
| Whisky de sodio Bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | S233-3 | añadido a los tubos estériles de 5 ml de fondo redondo F12 de jamón |
| VWR | 60818-565 | Tubos utilizados para FACS | |
| UltraComp | eBeads eBioscience | 01-2222-42 | Perlas de compensación para calibrar el flujo Ajustes de FACS |
Referencias
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
