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Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

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DOI:

10.3791/59621

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1 de junio de 2019

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1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos dos enfoques para caracterizar los eventos de polarización celular en linfocitos B durante la formación de un IS. El primero, implica la cuantificación del reclutamiento de orgánulos y reordenamientos del citoesqueleto en la membrana sináptica. El segundo es un enfoque bioquímico, para caracterizar los cambios en la composición del centrosoma, que se somete a polarización a la sinapsis inmune.

Resumen

El reconocimiento de los antígenos de superficie por el receptor de células B (BCR) desencadena la formación de una sinapsis inmune (IS), donde se coordinan tanto la señalización como la admisión de antígenos. La formación de IS implica una remodelación dinámica de actina acompañada del reclutamiento polarizado a la membrana sináptica del centrosoma y los orgánulos intracelulares asociados, como los lisosomas y el aparato Golgi. Las etapas iniciales de la remodelación de actina permiten que las células B aumenten su superficie celular y maximicen la cantidad de complejos de antígeno-BCR reunidos en la sinapsis. Bajo ciertas condiciones, cuando las células B reconocen antígenos asociados a superficies rígidas, este proceso se acopla al reclutamiento local y la secreción de lisosomas, lo que puede facilitar la extracción de antígenos. Los antígenos recogidos se internalizan en compartimentos de endo-lisososoma sórdico especializados para su procesamiento en péptidos, que se cargan en moléculas principales del complejo de histocompatibilidad II (MHC-II) para su posterior presentación a las células auxiliares de T. Por lo tanto, el estudio de la dinámica de los órganos asociados con la formación de un IS es crucial para entender cómo se activan las células B. En el presente artículo discutiremos tanto la imagen como una técnica bioquímica utilizada para estudiar los cambios en el posicionamiento de los organosílamos intracelulares y los reordenamientos del citoesqueleto que están asociados con la formación de un IS en células B.

Introducción

Los linfocitos B son una parte esencial del sistema inmunitario adaptativo responsable de producir anticuerpos contra diferentes amenazas y patógenos invasores. La eficiencia de la producción de anticuerpos está determinada por la capacidad de las células B paraadquirir, procesar y presentar antígenos que se encuentran en una forma soluble o de superficie 1,2. El reconocimiento de antígenos unidos a la superficie de una célula presentadora, por elBCR, conduce a la formación de un contacto intercelular cercano llamado IS 3,4. Dentro de esta plataforma dinámica se lleva a cabo tanto la señalización aguas abajo dependiente sofocan bCR como la internalización de antígenos en compartimentos endo-lisososoma. Los antígenos recogidos se procesan y ensamblan en moléculas MHC-II y posteriormente se presentan a los linfocitos T. Las interacciones productivas B-T, llamadas cooperación con células B-T, permiten que los linfocitos Breciban las señales adecuadas, que promueven su diferenciación en células plasmáticas productoras de anticuerpos o células de memoria 8.

Dos mecanismos han participado en la extracción de antígenos por células B. El primero se basa en la secreción de proteasas procedentes de los lisomasque se someten a reclutamiento y fusión en la hendidura sináptica 5,6. El segundo, depende de las fuerzas de tracción mediadas por Myosin IIA que desencadena la invaginación de las membranas que contienen antígeno que se internalizan en fosas recubiertas de clathrin7. El modo de extracción de antígenos se basa en las propiedades físicas de la membrana en la que se encuentran los antígenos. Sin embargo, en ambos casos, las células B se someten a dos eventos de remodelación importantes: la reorganización del citoesqueleto de actina y la polarización de los orgánulos al EI. La remodelación del citoesqueleto de Actin implica una etapa inicial de propagación, donde las protuberancias dependientes de la actina en la membrana sináptica aumentan la superficie en contacto con el antígeno. Esto es seguido por una fase de contracción, donde los BCR junto con antígenos se concentran en el centro del Is por la acción concertada de los motores moleculares y la remodelación del citoesqueleto de actina8,9,10, 11. La polarización de los orgánulos también se basa en la remodelación del citoesqueleto de actina. Por ejemplo, el centrosoma se desacopla del núcleo, por despolimerización local de laactina asociada, lo que permite el reposicionamiento de este orgánulo al IS 5,12. En las células B, el reposicionamiento del centrosoma a un polo celular (IS) guía el reclutamiento de lisosoma a la membrana sináptica, que tras la secreción puede facilitar la extracción y/o procesamiento de antígenos de superficie6. Los lysosomes contratados en el IS se enriquecen con MHC-II, que favorece la formación de complejos péptido-MHC-II en compartimentos endosómicos que se presentarán a las células T13. Además, el aparato Golgi también se ha observado que está estrechamente reclutado para el IS14, lo que sugiere que las vesículas derivadas de Golgi de la vía secretora podrían estar involucradas en la extracción y / o procesamiento de antígenos.

En conjunto, los reordenamientos intracelulares del orgánulo y del citoesqueleto en las células B durante la formación de la sinapsis son los pasos clave que permiten la adquisición y el procesamiento eficientes del antígeno para su posterior activación. En este trabajo introducimos protocolos detallados sobre cómo realizar imágenes y análisis bioquímicos en células B para estudiar la remodelación intracelular de orgánulos asociados con la formación de un IS. Estas técnicas incluyen: (i) Inmunofluorescencia y análisis de imagen de células B activadas con cuentas recubiertas de antígeno y en cubiertas recubiertas de antígenos, lo que permite la visualización y cuantificación de componentes intracelulares que se movilizan al IS y (ii ) aislamiento de fracciones enriquecidas con centrosomas en células B por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa, lo que permite la identificación de proteínas asociadas con el centrosoma, potencialmente implicado en la regulación de la polaridad celular.

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Protocolo

NOTA: Los siguientes pasos se realizaron utilizando células IIA1.6 B.

1. Activación de la célula B con perlas recubiertas de antígeno

  1. Preparación de perlas recubiertas de antígeno
    1. Para activar las células B, utilice NH2-perlas recubiertos covalentemente con antígeno (abalorios recubiertos de Ag), que se preparan con 50 sL (20 x 106 perlas) de 3 ám NH 2-perlas con antígenos activadores (BCR-ligand+) o no activadores (BCR-ligand-).
    2. Para las células IIA1.6 B utilice el fragmento anti-IgG-F(ab')2 como BCR-ligand+ y anti-IgM-F(ab')2 o albúmina sérica bovina (BSA) como BCR-ligand-. Para activar las células B primarias o la línea celular IgM+ B, utilice anti-IgM-F(ab')2 como BCR-ligand+ y BSA como BCR-ligand-.
      NOTA: Para evitar la unión de ligandos al receptor Fc, utilice fragmentos de anticuerpos F(ab') o F(ab')2 en lugar de anticuerpos de longitud completa.
    3. Para proceder con la preparación de perlas recubiertas de Ag, coloque las perlas en tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas para maximizar la recuperación de perlas durante la manipulación de la muestra. Añadir 1 ml de 1 x solución salina con fosfato (PBS) para lavar las perlas y la centrífuga a 16.000 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
    4. Resuspenda las perlas con 500 ml de glúteo 8% para activar los grupos NH2 y girar durante 4 h a temperatura ambiente (RT).
      ADVERTENCIA: La solución de material de glutaraldehído sólo debe utilizarse en una campana de humo químico. Siga las instrucciones de la ficha de datos de seguridad del material (MSDS).
    5. Centrifugar perlas a 16.000 x g durante 5 min, eliminar el glutaraldehído y lavar las perlas tres veces más con 1 mL de 1x PBS.
      ADVERTENCIA: La solución de glutaraldehído debe desecharse como residuo químico peligroso.
    6. Resuspenda las perlas activadas en 100 oL de 1pbS. La muestra se puede dividir en dos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas: 50 l para el BCR-ligand+ y 50 l para BCR-ligand-.
    7. Para preparar la solución de antígeno, utilice dos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 2 ml que contengan 100 g/ml de solución de antígeno en 150 ml de PBS: Un tubo con BCR-ligand+ y otro con BCR-ligand-.
    8. Añadir 50 l de solución de perlas activadas a cada tubo que contenga 150 ml de solución de antígeno, vórtice y gire durante la noche a 4 oC.
    9. Añadir 500 sL de 10 mg/ml de BSA para bloquear los grupos NH2 reactivos restantes en las perlas y girar durante 1 h a 4 oC.
    10. Centrifugar las perlas a 16.000 x g durante 5 min a 4 oC y retirar el sobrenadante. Lave las perlas con 1PBS frío tres veces más.
    11. Resuspenda las perlas activadas en 70 oL de 1pbS.
    12. Para determinar la concentración final de cuentas recubiertas de Ag, diluir un pequeño volumen de cuentas en PBS (1:200) y contar usando un hemocitómetro. A continuación, conservar a 4oC hasta su uso.
      NOTA: Las perlas recubiertas con ag no deben almacenarse durante más de 1 mes.
  2. Preparación de cubiertas de poli-L-lisina
    1. Antes del ensayo de activación de células B con perlas recubiertas de Ag, prepare los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina (PLL-coverslips). Utilice un tubo de 50 ml que contenga 40 ml de 0,01% p/v de solución PLL y sumerja los cubreobjetos de 12 mm de diámetro en la solución. Gire durante la noche en RT.
    2. Lave los cubreobjetos con 1 PBS y deje secar en una tapa de placa de 24 pocillos cubierta con película de parafina. Continúe con la activación de la célula B.
  3. Activación de la célula B
    1. Para iniciar la activación de células B con perlas, primero diluir la línea celular IIA1.6 B a 1,5 x 106 células/ml en medio CLICK (RPMI-1640 complementado con 2 mM de L-alanina-L-glutamina + 55 m beta-mercaptoetanol + 1 mM de piruvato + 100 U/ml de penicilina + 100 g/mL estreptomicina) + 5% suero bovino fetal inactivado por calor [FBS]).
    2. Combine 100 l (150.000 células) de células IIA1.6 B con perlas recubiertas de Ag en una proporción de 1:1 en tubos de 0,6 ml. Mezcle suavemente con un vórtice y una semilla en PLL-coverslips. Incubar para diferentes puntos de tiempo en una incubadora de cultivo celular (37 oC / 5% CO2). Los puntos de tiempo de activación típicos son 0, 30, 60 y 120 min. Durante el tiempo 0, coloque los pellos de PLL en la tapa de la placa de 24 pocillos sobre hielo. Agregue las células-mezcla de perlas recubiertas de Ag e incubar durante 5 minutos sobre hielo.
      NOTA: Es importante mezclar por vórtice en lugar de pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que esto podría reducir el número de perlas en la muestra, debido a su acumulación en la punta de plástico de la pipeta. Utilice perlas recubiertas con BCR-ligand- como un control negativo para cada ensayo. Recomendamos activar primero el tiempo de incubación más largo y luego los siguientes puntos de tiempo. Calcule los intervalos de activación de las muestras de modo que estén listas para la fijación al mismo tiempo.
    3. Añadir 100 sl de PBS 1x frío a cada cubreobjetos para detener la activación y continuar con el protocolo de inmunofluorescencia. Consulte la sección 3 del protocolo.

2. Activación de la célula B en cubreobjetos recubiertos de antígeno

  1. Preparación de cubres recubiertas de antígeno
    1. Antes de la activación, prepare la solución de antígeno (1x PBS que contiene 10 g/ml BCR-ligand+ y 0,5 g/ml de rata antiratón CD45R/B220).
      NOTA: Considere la posibilidad de preparar las cubiertas el día anterior al ensayo. B220 mejora la adhesión de la célula B, sin embargo, el BCR-Ligand+ es suficiente para generar la respuesta de propagación.
    2. Colocar el cubreobjetos de 12 mm sobre una tapa de placa de 24 pocillos cubierta con película de parafina, añadir 40 ml de solución de antígeno en cada cubreobjeto e incubar a 4 oC durante la noche. Sellar la placa para evitar la evaporación de la solución de antígeno.
    3. Lave los labios de las cubiertas con 1 PBS y seque al aire.
  2. Activación de la célula B
    1. Para iniciar la activación, diluir las células IIA1.6 B a 1,5 x 106 celdas/ml en medio CLICK + 5% FBS.
    2. Añadir 100 l de células en un cubreobjetos recubierto de antígeno (Ag-coverslip) y activar para diferentes puntos de tiempo en una incubadora de células a 37 oC / 5% de CO2. Los puntos de tiempo de activación típicos son 0, 30 y 60 min.
      NOTA: Al igual que en la sección 1, recomendamos comenzar con el punto de tiempo de activación más largo para corregir todas las muestras al mismo tiempo.
    3. Para el tiempo 0, coloque la tapa de la placa de 24 pocillos que contiene el Ag-coverslip en el hielo y agregue las células. Incubar durante 5 minutos sobre hielo.
    4. Aspirar cuidadosamente los medios en cada Ag-coverslip y luego añadir 100 éL de frío 1x PBS para detener la activación. Continúe con el protocolo de inmunofluorescencia. Ver sección 3.

3. Inmunofluorescencia

NOTA: Para evitar la reactividad cruzada del anticuerpo secundario con el BCR de las células IIA 1.6 B, no utilice anticuerpos primarios derivados del ratón.

  1. Retire el 1x PBS y proceda con la fijación de cada cubreobjetos.
    NOTA: Para decidir qué medio de fijación utilizar, compruebe la hoja de datos de anticuerpos/teñidos. Por ejemplo, para el etiquetado de actina por faloideicida utilizar medio de fijación de paraformaldehído (PFA), y para el etiquetado centrosoma por pericentrina utilizar fijación de metanol.
    1. Añadir 50 éL de 1x PBS complementado con 4% pfa e incubar durante 10 minutos a RT.
      ADVERTENCIA: El formaldehído es tóxico. Por favor, lea el MSDS antes de trabajar con este producto químico. Las soluciones de PFA solo deben hacerse bajo una campana de humos químicos con guantes y gafas de seguridad. La solución de PFA debe desecharse como residuo sproducto químico peligroso.
    2. Alternativamente, añadir 50 l de metanol frío e incubar durante 20 min.
  2. Lávese tres veces con 1 pbS.
    NOTA: Coverslips se pueden almacenar a 4oC en este punto durante un máximo de tres días en 1pbS.
  3. Retire 1x PBS y agregue 50 s de tampón de bloqueo (2% BSA + 0.3 M de glicina en 1x PBS) a cada cubreobjetos. Incubar a RT durante 10 min.
  4. Aspirar suavemente y añadir 50 l de tampón de permeabilización (PB) (0,2% De BSA + 0,05% saponina en 1x PBS). Incubar a RT durante 20 min.
  5. Preparar los anticuerpos o dedos en PB (utilizar 30 ml por cubreobjetos) e incubar a RT durante 1 h o durante la noche a 4 oC. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.
    1. Para etiquetar el centro organizador del microtúbulo (MTOC) o centrosome utilice los siguientes anticuerpos: anti-tubulina (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-a-tubulina (1:500), antipericentrina (1:1000).
      NOTA: Para el etiquetado centroso, las células B pueden ser transinfectadas con un plásmido de expresión centrin-GFP.
    2. Para el etiquetado del aparato Golgi utilice anti-Rab6a (1:500).
      NOTA: También se pueden utilizar otros anticuerpos o tendeders.
    3. Para el etiquetado de los sosomas, utilice anti-Lamp1 (1:200).
      NOTA: Anti-H2-DM y anti-MHC-II también se pueden utilizar para etiquetar los compartimentos de procesamiento de antígenos15,16.
    4. Para el etiquetado retículo endoplasmático utilice anti-Sec61a (1:500).
    5. Para el citoesqueleto de actina considere lo siguiente: la actina polimerizada puede ser visualizada por Phalloidin conjugada con colorantes fluorescentes.
      NOTA: Las células B transptadas con un plásmido de expresión LifeAct-GFP/RFP también se pueden utilizar para etiquetar actina.
  6. Lave los labios de las cubiertas tres veces con PBS.
  7. Diluir el anticuerpo secundario o colorantes en PBS (utilizar 30 ml por cubreobjetos) e incubar 1 h a RT.
    NOTA: Evite exponer las muestras a la luz directa para preservar la calidad de la señal de fluorescencia.
  8. Lave los labios de las cubiertas tres veces con PBS.
  9. Retire la solución PBS de coverslips.
  10. Añadir 4 l de reactivo de montaje a una diapositiva del microscopio. Monte el cubreobjetos en la corredera con el lado de la celda hacia abajo. Deje que los portaobjetos se sequen durante 30 minutos a 37 oC o a RT durante la noche.
    NOTA: Considere la posibilidad de utilizar un reactivo de montaje "anti-fade" (consulte la Tabla de materiales).
  11. Adquiera imágenes de fluorescencia en un microscopio confocal o epifluorescencia con un objetivo de inmersión de aceite de 60x o 100x. Para cada adquisición considere la luz transmitida o el campo brillante para identificar fácilmente las células B que interactúan con las cuentas.
    NOTA: Tome imágenes tridimensionales (3D), cubriendo toda la celda utilizando pilas z. Recomendamos tomar pilas de 0,5 m de espesor, sin embargo, esto depende del microscopio.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Se describen los siguientes algoritmos para el software ImageJ. Sin embargo, esto se puede realizar utilizando un software equivalente. Además, tenga en cuenta que para todas las mediciones de intensidad de fluorescencia utilizamos la densidad de fluorescencia integrada ("RawIntDen" en ImageJ), ya que este parámetro considera la cantidad total de fluorescencia en cada píxel de la imagen, teniendo en cuenta el área.

  1. Análisis de la distribución de orgánulos en células B activadas con perlas recubiertas de Ag
    NOTA: Para cuantificar la polarización de los componentes de la célula al IS, definimos un valor arbitrario como una medida de proximidad al IS. El índice oscila entre -1 (antipolarizado) y 1 (completamente polarizado, objeto en el cordón), como fue presentado anteriormente por Reversat et al.12.
    1. Estimar el índice de polaridad para el aparato centrosome y Golgi (Figura1B).
      NOTA: Este algoritmo se puede utilizar para orgánulos que están confinados a un punto.
      1. En primer lugar, defina las áreas de cordón y celda que se van a analizar utilizando la selección de la herramienta de círculo para delimitar los límites de ambas y, a continuación, guárdelas como regiones de interés (ROI). Vea la Figura 1, figura 2, figura 3y figura 4.
      2. Determinar el centro de la célula (CC) y el centro de cuentas (BC) ejecutando Analizar ? Mida en las áreas de celda y cuentas respectivamente. Los valores X e Y obtenidos en la ventana Resultados determinan las coordenadas centrales.
      3. Determinar manualmente el centro del aparato centrosome o Golgi(Organelle) utilizando la selección de la herramienta de puntos en ImageJ y ejecutar Analizar . Medir. Los valores X e Y obtenidos de la ventana Resultados determinan las coordenadas.
      4. A continuación, dibuje un ángulode CC a Organelle ( a ) y CC a BC (b) utilizando la selección de la herramienta de ángulo y ejecute Analizar . Medir. El valor de ángulo en la ventana de resultados muestra el ángulo ()entre ambos vectores (a y b).
      5. Calcule el índice de polaridad utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-1
    2. Estimar el índice de polaridad para los sisómas (Figura1F).
      NOTA: Utilizamos este algoritmo para analizar la polaridad de los orgánulos que muestran una distribución más dispersa, como los lisosomas.
      1. Defina las áreas de cordón y celda que desea analizar, utilizando la selección de la herramienta de círculo para delimitar los límites de ambas y guárdelas como ROI. Una vez que se hayan determinado las áreas del cordón y de la célula, establezca el canal de fluorescencia y proyecte la imagen en una pila z (Imagen ? Pilas ? Z-Project [Sumar sectores]) y, a continuación, ejecutar Analizar . Mida y extraiga las coordenadas del centro de masa (MC) (MX y MY) de las ventanas de resultados.
      2. Aplique el mismo algoritmo mencionado antes de cambiar Organelle para MC. Por lo tanto, el ángulo ( )se define mediante CC-MC ( a ) y CC-BC (b).
      3. Calcule la polaridad utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-2
    3. Estimar el reclutamiento lisosoma en el área sináptica (Figura2B).
      NOTA: Este algoritmo se utiliza para cuantificar un orgánulo adyacente al IS.
      1. Una vez que se hayan determinado las áreas del cordón y de la celda, determine el ángulo del vector entre el CC y el BC y luego gire la imagen para lograr un ángulo de 0o.
      2. Establezca el canal fluorescente y proyecte la imagen en una pila z (Imagen ? Pilas ? Z-Project [Sum slices]), elimina toda la fluorescencia que cae fuera de la célula y el área del cordón juntos (ejecutar edit á claro fuera en ImageJ).
      3. Con la selección de la herramienta rectángulo, dibuje un rectángulo adyacente al cordón y mida la fluorescencia del área sináptica (SAF). Este rectángulo es un cuarto del ancho de la celda.
      4. Seleccione toda la imagen y ejecute Analizar . Medida para obtener toda la fluorescencia celular (WCF).
      5. Calcule el porcentaje de fluorescencia de los orgásmimos adyacentes al IS utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-3
    4. Cuantificar el reclutamiento de componentes celulares para el centrosoma.
      NOTA: Este algoritmo, adaptado de Obino et al.5, se utiliza para cuantificar el enriquecimiento de los orgánulos en el área centrosome. Brevemente, consideramos el área centrosoma como el dominio en el que la fluorescencia de los orgásmos ogásmos asociada al centroso permanece constante o por encima del 70% en la gráfica de fluorescencia/radio. Es esencial establecer este parámetro en condiciones de reposo porque este radio podría cambiar al activarse.
      1. Una vez que se hayan determinado las áreas de perlas y celdas, defina la localización del centrosoma utilizando la selección de la herramienta de puntos (Figura3B).
      2. En primer lugar, determinar el área máxima alrededor del centrosoma que es posible cuantificar, dibujando un círculo de radio de 3 m que rodea el centrosoma.
      3. Utilice el complemento ImageJ Perfilradial, que mide la fluorescencia en círculos concéntricos y muestra una gráfica de fluorescencia/radio.
      4. Identifique el radio máximo dentro del cual se mantiene al menos el 70% de la intensidad de la fluorescencia.
      5. Calcule la relación de densidad de fluorescencia utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        NOTA: La relación de densidad de fluorescencia indica la concentración de un orgánulo en el centrosoma en comparación con su distribución en toda la célula.
  2. Análisis de la propagación celular y distribución de orgánulos en células B activadas en Ag-coverslips
    1. Estimación de la distribución de los orgánulos en el IS (Figura4B).
      NOTA: Este algoritmo permite la cuantificación de la distribución XY de los orgánulos y su concentración en el centro del IS. Definimos una relación de densidad de fluorescencia entre el área central y la total sináptica. Los valores obtenidos pueden variar de negativo a positivo, lo que indica una distribución periférica o central del orgánulo, respectivamente.
      1. Determine la rebanada en la que la celda está en contacto con la cubierta.
        NOTA: Para delimitar los límites celulares se puede etiquetar la membrana plasmática o la actina que se enriquece en la periferia del IS.
      2. Cambie el tipo de la rebanada a 8 bits y, a continuación, binarize (Proceso ? Binario ? Hacer binario) y conectar los puntos de aforo más cercanos Proceso de puntos de exterior Binario ? Contorno. Delimite los límites del área de celda (CA) utilizando la selección de la herramienta poligonal.
        NOTA: Este paso es útil para aumentar el contraste de los límites de la celda y facilitar la identificación. Además, en este punto, es posible aplicar el plugin Analizar partículas de ImageJ para determinar la CA automáticamente. Sin embargo, otras celdas en el mismo campo pueden interferir con los resultados.
      3. Tome los parámetros de CA (altura y anchura) y delimite un área redondeada central, que está separada de los límites por un cuarto de los valores de altura y anchura, considere esta área como el área de centro de celda (CCA).
      4. Calcule la distribución de la densidad de fluorescencia en el centro del IS utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-6
    2. Medir la distribución de los orgásulos en planos Z (Figura 4C).
      NOTA: Este análisis determina la distribución general de la fluorescencia de los órganos del órgano del ginés a través de los planos Z de las células B activadas en los labios de las cubiertas de Ag, mostrando el porcentaje de fluorescencia por fracción Z.
      1. Para cuantificar la distribución de fluorescencia en Z, primero determine el plano del IS donde la célula está en contacto con el Ag-coverslip y luego el plano correspondiente al límite superior de la célula.
      2. Dibuje una línea a través del centro de la celda.
      3. Recortar la imagen en Z (Imagen ? Pilas ? Reslice), para obtener una imagen XZ.
      4. Mida la altura y divida la imagen XZ en 10 rectángulos consecutivos de la misma altura (fracción Z) desde la parte inferior (interfaz IS) hasta la parte superior (lado superior de la celda) y cuantifique la señal de fluorescencia en cada uno.
      5. Normalizar la intensidad de fluorescencia de cada fracción Z por la suma de la fluorescencia total de las 10 fracciones.
      6. Trazar el porcentaje de intensidad de fluorescencia por fracción Z de la célula.

5. Aislamiento de la fracción enriquecida con centrosomas de las células B en reposo y activadas

NOTA: Mantenga todas las soluciones a 4 oC durante el experimento para evitar la degradación de las proteínas. Este protocolo fue adaptado de los trabajos anteriores17,18.

  1. Active 2 celdas de 107 B con perlas recubiertas de Ag en 2 ml de medio CLICK + 2% FBS inactivado por calor (relación 1:1). Considere las células B no activadas como células B en reposo.
  2. Añadir citochalasina D (2 m) y nocodazole (0,2 oM) e incubar durante 1 h a 37 oC.
    NOTA: Estos medicamentos se utilizan para separar suavemente el centrosoma del núcleo, despolimerizando el citoesqueleto de actina y los microtúbulos, respectivamente, para evitar la contaminación nuclear.
  3. Lavar cada muestra con 5 ml de frío 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl) y luego con 1 mL de 0,1 tbS suplementado con 8% de sacarosa.
  4. Resuspender las células con 150 l de tampón de lisis centrosoma (1 mM HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2, 0.1% beta-Mercaptoethanol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilonil (PMSF) o cóctel inhibidor de proteasa) y pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta la viscosidad hasta la viscosidad disminuye, lo que indica que la lisis celular se identifica en la muestra. Coloque la muestra en un tubo de 1,5 ml.
  5. Centrífuga a 10.000 x g durante 10 min a 4oC, para separar los orgánulos del núcleo.
  6. Recupere cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo encima de un tubo de 1,5 ml con 300 ml de tampón de gradiente (GB) (10 mM PIPES pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% beta-mercaptoetanol) que contiene 60% de sacarosa.
  7. Centrífuga a 10.000 x g durante 30 min a 4oC para concentrar los centrosomas en la fracción de sacarosa del 60%.
  8. Mientras tanto, prepare un gradiente discontinuo en tubos ultracentrífugos de 2 ml superponiendo 450 sl de gb + 70% de sacarosa con 270 s l de GB + 50% de sacarosa y luego 270 ml de GB + 40% de sacarosa.
  9. Después de la primera centrifugación (fracción centrosomecida-concentrada), deseche la fracción superior (porción menos densa) hasta llegar a la interfaz y vórtice la muestra restante en el tubo. A continuación, superponga encima del gradiente discontinuo previamente preparado con la muestra enriquecida centrosoma.
    NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir el gradiente, todos los procedimientos de pipeteo deben realizarse cuidadosamente.
  10. Centrífuga a 40.000 x g durante 1 h a 4oC con una aceleración mínima y con el freno centrífugo apagada, para evitar interrumpir el gradiente.
  11. Recoger 12 fracciones de 100 l en tubos separados a partir de la parte superior.
  12. Identifique las fracciones enriquecidas en centrosomas por inmunoblot utilizando la tubulina como marcador centrososoma.
    NOTA: Normalmente encontramos extractos enriquecidos con centrosomas entre las fracciones 6 y 8.

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Resultados

El presente artículo muestra cómo las células B se pueden activar usando antígeno inmovilizado en perlas o cubrelips para inducir la formación de un IS. Proporcionamos información sobre cómo identificar y cuantificar la polarización de diferentes orgánulos por inmunofluorescencia y cómo caracterizar proteínas que sufren cambios dinámicos en su asociación al centrosoma, que se polariza al IS, utilizando un enfoque bioquímico.

La ...

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Discusión

Describimos un método integral para estudiar cómo los linfocitos B reorganizan su arquitectura intracelular para promover la formación de un IS. Este estudio incluye el uso de técnicas de imagen para cuantificar la distribución intracelular de orgánulos, como centrosoma, aparato Golgi y lisosomas durante la activación de la célula B, y cómo se polarizan al IS. Además, describimos un enfoque bioquímico para estudiar los cambios en la composición centrosomesoma sobre la activación de la célula B.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

M.-I.Y. cuenta con el apoyo de una beca de investigación de la #1180900 FONDECYT. J.I., D.F. y J.L. contaron con el apoyo de becas de la Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio de la Pontificia Universidad Católica de Chile por la grabación y edición de vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IIA1.6 (variante A20) células de linfoma B del ratónATCCTIB-208Linfoma de células B murino de origen Balb/c que expresa un BCR que contiene IgG en su superficie sin FcγIIR
Metanol al 100%Fisher ScientificA412-4
Cristales circulares de vidrio de cobertura de 10 mm de diámetro, espesor No. 1Marienfield-Superior111500
2-mercaptoetanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- asno anti-conejo IgG LifeTech A21206Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse
Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo IgGThermo Fisher ScientificA-11071Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse
Alexa Fluor 647-conjugado de ftaloidinaThermo Fisher ScientificA21238Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse
Kit Amaxa Nucleofección VLonzaVCA-1003Siga las instrucciones del fabricante para mezclar los reactivos de transfección con el ADN
Modelo Amaxa Nucleofector 2bLonzaAAB-1001Se utilizó el programa L-013
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
Anti-pericentrinaAbcamab4448Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse
Anti-rab6Abcamab95954Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse
Anti-sec61Abcamab15575Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse
BSAWinklerBM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
Plato de cultivo T25BD353014
Software FijiFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
GlutaminaThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehídoSigmaG7651
GlicinaWinklerBM-0820
Anticuerpo anti-ratón IgG de cabraJackson ImmunoResearch315-005-003Ligando positivo IIA1.6
Anticuerpo anti-IgM de ratón de cabraThermo Fisher Scientific31186Ligando negativo IIA1.6
Suero fetal bovino HyCloneThermo Fisher ScientificSH30071.03Inactivar por calor a 56 oC durante 30 min
KClWinklerPO-1260
Microscopio Leica SP8 TCSLeica
NaClWinklerSO-1455
Microscopio epifluorescente Nikon Eclipse Ti-ENikon
ParafilmMP1150-2
ParaformaldehídoMerck30525-89-4Diluir al 4% con PBS en un gabinete de seguridad, usar al momento
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Líquido
Microesferas de amino polibead de 3,00μmPolyscience17145-5
Poli-L-lisinaSigmaP8920Diluir con agua estéril
Anticuerpo anti-alfa tubulina de conejoAbcamab6160Se recomienda una dilución de 1:1000, pero debe optimizarse
Anticuerpo anti-lamp1 de conejo anti-ratónCell signaling3243Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse
Anti-cep55 de conejoAbcamab170414Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse
Anticuerpo anti-Tubulina gamma de conejoAbcamab165041:1000 para Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
SaponinaMerck558255
Pirveta de sodioThermo Fisher Scientific11360070
SacarosaWinklerSA-1390
Tritón X-100Merck9036-19-5
Tubo 50 mlCorning353043

Referencias

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Activaci n de c lulas Breclutamiento del centrosomasecreci n lisosomalremodelaci n de la actinatinci n por inmunofluorescenciamicroscop a confocalan lisis por Western blotcentrifugaci n en gradiente de sacarosa

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