Aquí, presentamos un protocolo para editar genéticamente las células CAR-T a través de un sistema CRISPR/Cas9.
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Artículo de método
Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T
En este artículo
Resumen
Resumen
La terapia celular del receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) es una nueva opción de tratamiento para el cáncer de vanguardia y potencialmente revolucionaria. Sin embargo, hay limitaciones significativas a su uso generalizado en el tratamiento del cáncer. Estas limitaciones incluyen el desarrollo de toxicidades únicas como el síndrome de liberación de citoquinas (SCR) y neurotoxicidad (NT) y la expansión limitada, las funciones del efector y la actividad antitumoral en tumores sólidos. Una estrategia para mejorar la eficacia CAR-T y / o controlar las toxicidades de las células CAR-T es editar el genoma de las células CAR-T sí mismos durante la fabricación de células CAR-T. Aquí, describimos el uso de la edición de genes CRISPR/Cas9 en células CAR-T a través de la transducción con una construcción lentiviral que contiene un ARN guía al factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) y Cas9. Como ejemplo, describimos el nocaut mediado por CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Hemos demostrado que estas células GM-CSFk/o CAR-T producen efectivamente menos GM-CSF mientras mantienen la función crítica de las células T y dan lugar a una mayor actividad antitumoral in vivo en comparación con las células CAR-T de tipo salvaje.
Introducción
La terapia celular del receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) exhibe una gran promesa en el tratamiento del cáncer. 1 , 2 Dos terapias de células CAR-T dirigidas a CD19 (CART19) fueron aprobadas recientemente en los Estados Unidos y en Europa para su uso en neoplasias malignas de células B después de demostrar resultados sorprendentes en ensayos clínicos multicéntricos. 3 , 4 , 5 Las barreras para un uso más generalizado de las células CAR-T son la actividad limitada en tumores sólidos y toxicidades asociadas, como ....
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Protocolo
Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional (IRB) y del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de Mayo Clinic.
1. Producción celular CART19
- Aislamiento de células T, estimulación y cultivo ex-vivo
- Llevar a cabo todo el trabajo de cultivo celular en una campana de cultivo celular utilizando el equipo de protección personal adecuado. Cosechar células mononucleares de sangre periférica (PPBM) de conos de sangre de donante normales no identificados recogidos durante la aféresis, ya que se sabe que son una fuente viable de PPBCM.13.
- Para aislar los PACL, añada 15....
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Resultados
La Figura 1 muestra la reducción de GM-CSF en células GM-CSFk/o CART19. Para verificar que el genoma de las células T fue alterado para noquear GM-CSF, se utilizó la secuenciación TIDE en las células GM-CSFk/o CART19 (Figura1A). La tinción de la superficie de la célula CAR-T verifica que las células T expresen con éxito el receptor de superficie CAR in vitro mediante la medición en células CD3+ vivas (Figura.......
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Discusión
En este informe, describimos una metodología para utilizar la tecnología CRISPR/Cas9 para inducir modificaciones secundarias en células CAR-T. Específicamente, esto se demuestra utilizando la transducción lentiviral con un vector viral que contiene gRNA dirigido al gen de interés y Cas9 para generar células GM-CSFk/o CART19. Anteriormente habíamos demostrado que la neutralización GM-CSF mejora el CRS y NT en un modelo de xenoinjerto. 12 Como se ha descrito anteriormente, las células GM-.......
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Divulgaciones
SSK es un inventor de patentes en el campo de la terapia de células T CAR que tienen licencia para Novartis (bajo un acuerdo entre Mayo Clinic, Universidad de Pensilvania y Novartis). Estos estudios fueron financiados en parte por una subvención de Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS y SSK son inventores de patentes relacionadas con este trabajo. El laboratorio (SSK) recibe fondos de Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys y Actinium.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado a través de subvenciones de K12CA090628 (SSK), la Red Nacional Integral contra el Cáncer (SSK), el Centro Clínica Mayo para Medicina Individualizada (SSK), la Fundación Predolin (SSK), la Oficina de Traducción a la Práctica de Mayo Clinic (SSK) y el Programa de Capacitación de Científicos Médicos de Mayo Clinic Robert L. Howell Physician-Scientist (RMS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticuerpo monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Sistema CytoFLEX B4-R2-V2 | Citómetro de flujo | Beckman Coulter | C10343 |
| sulfóxido de dimetilo | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Concentrador de partículas magnéticas) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit de aislamiento de células T humanas | STEMCELL Technologies | 17951 | perlas magnéticas de selección negativa; 17951RF incluye puntas y tampón |
| Suero fetal bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Medio de fijación (medio A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Constructo: Nombre: CSF2 ARN guía CRISPR 1; Especie: Humano, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistencia: Ampicilina; Número de copia: Alto; Preparación de plásmidos: Entrega estándar: 4 μ g (Gratis de cargo) | GenScript | N/A | personalizado |
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Suero AB Humano de Desktop Genetics | ||
| ; donantes masculinos; tipo AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Anticuerpo monoclonal (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua fijable, para excitación de 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Solución de Monensina, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Ratón Anti-Humano CD28 Clon CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Ratón Anti-Humano CD49d Clon 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Ratón Anti-Humano MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Contenedor de congelación | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clon G5 | ATCC | CRL-3273 | línea celular de leucemia linfoblástica aguda |
| Agua libre de nucleasa | Promega | P119C | |
| Sistemas de filtro al vacío Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, estéril | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido con membrana CN 0,45 uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Suero reducido Medio (1X), Líquido | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Ratón Anti-Humano IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido | Gibco | 10378-016 | |
| Medio de permeabilización (Medio B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Dihidrocloruro de puromicina | MP Biomedicals, Inc. | ||
| Kit de extracción de gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Rata Anti-Humana GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Separador de células totalmente automatizado |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Azida de sodio, 5% (c/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero | Lonza | 04-418Q |
Referencias
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
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Reimpresiones y permisos
