Una plataforma microfluídica multicapa para la conducción de la expresión génica sin células prolongada

Summary

Se describe el proceso de fabricación de un dispositivo microfluídico multicapa basado en PDMS que permite realizar reacciones de transcripción y traducción in vitro (IVTT) durante períodos prolongados. Además, se proporciona una visión general completa del hardware y el software necesarios para automatizar y mantener estas reacciones durante duraciones prolongadas.

Abstract

Las limitaciones de la biología sintética basada en células son cada vez más evidentes a medida que los investigadores tienen como objetivo desarrollar circuitos reguladores genéticos sintéticos más grandes y complejos. El análisis de las redes reguladoras genéticas sintéticas in vivo consume mucho tiempo y sufre de una falta de control ambiental, con componentes sintéticos exógenos que interactúan con los procesos del huésped dando como resultado un comportamiento no deseado. Para superar estos problemas, la caracterización sin células de los circuitos novedosos es cada vez más frecuente. Las mezclas de transcripción y traducción in vitro (IVTT) permiten la regulación del entorno experimental y se pueden optimizar para cada sistema único. Los protocolos presentados aquí detallan la fabricación de un dispositivo microfluídico multicapa que se puede utilizar para sostener reacciones IVTT durante duraciones prolongadas. A diferencia de las reacciones por lotes, donde los recursos se agotan con el tiempo y (por) se acumulan productos, el uso de dispositivos microfluídicos permite la reposición de recursos, así como la eliminación de productos de reacción. De esta manera, el entorno celular se emula manteniendo un entorno fuera de equilibrio en el que el comportamiento dinámico de los circuitos genéticos puede ser investigado durante largos períodos de tiempo. Para explotar al máximo el dispositivo microfluídico multicapa, el hardware y el software se han integrado para automatizar las reacciones IVTT. Mediante la combinación de reacciones IVTT con la plataforma microfluídica presentada aquí, se hace posible analizar exhaustivamente comportamientos complejos de la red, promoviendo nuestra comprensión de los mecanismos que regulan los procesos celulares.

Introduction

Las células son capaces de detectar y responder a su entorno utilizando complejas redes reguladoras dinámicas^1,2. El campo de la biología sintética utiliza nuestro conocimiento de los componentes naturales que componen estas redes para diseñar sistemas biológicos que puedan ampliar la funcionalidad de las células^3,4. Por el contrario, también es posible profundizar en nuestra comprensión de las redes naturales que rigen la vida mediante el diseño de análogos sintéticos simplificados de los circuitos existentes o mediante sistemas biológicos de ingeniería directa que exhiben comportamientos naturales. La ingeniería de novo de estos sistemas biológicos se realiza de abajo hacia arriba donde nuevos circuitos genéticos o vías de señalización se diseñan de manera racional, utilizando partes bien definidas^5,6. La combinación del diseño racional de las redes con el diseño de sistemas biológicamente relevantes permite la caracterización y el estudio en profundidad de los sistemas reguladores biológicos con varios niveles de abstracción^7.

Las obras pioneras de Elowitz y Leibler⁸ y Gardner et al.⁹ fueron las primeras en demostrar la exitosa introducción de redes genéticas sintéticas en los huéspedes celulares. En la década siguiente, numerosos investigadores han continuado construyendo sobre estos éxitos iniciales a pesar de la aparición de varias limitaciones con respecto a la introducción de circuitos sintéticos en las células^{7,10,11 ,12}. Idealmente, la introducción de circuitos sintéticos en los hosts celulares debe ocurrir de una manera modular. Desafortunadamente, la complejidad del entorno celular hace que esto sea particularmente difícil, con la función de muchas partes y redes altamente dependientes del contexto^12,13,14. Como resultado, las redes a menudo experimentan interacciones no deseadas con componentes host nativos que pueden afectar a la función del circuito sintético. Del mismo modo, los componentes de la red exógena pueden inhibir los procesos de host, competir por recursos compartidos dentro del host e influir en la cinética de crecimiento^15,16,17. En consecuencia, con el fin de diseñar y predecir racionalmente el comportamiento de las redes sintéticas en un entorno in vivo, se requiere un modelo integral de todas las dinámicas específicas del host y del circuito¹⁸.

Una alternativa viable al uso de hosts celulares para la caracterización de redes sintéticas es la aplicación de tecnologías de transcripción y traducción in vitro (IVTT). Actuando como banco de pruebas para redes sintéticas, las reacciones se realizan en soluciones que comprenden todos los componentes necesarios para permitir la expresión génica^19,20,21. De esta manera, se crea un entorno biológicamente relevante, aunque artificial, en el que se pueden probar las redes sintéticas^{22,23,24,25,26, 27,28}. Una ventaja importante del uso de soluciones IVTT es la capacidad de realizar reacciones en condiciones especificadas por el usuario, con investigadores capaces de ajustar la composición precisa de cada reacción^2. Además, el enfoque sin células permite realizar pruebas de alto rendimiento de redes sintéticas, ya que elimina la necesidad de realizar pasos de clonación celular que consumen mucho tiempo. Como resultado, la duración del diseño sucesivo - construcción - ciclos de prueba se reduce significativamente^29,30,31,32. El ciclo de diseño se puede acelerar aún más mediante la utilización de técnicas de clonación sin células como el ensamblaje De Gibson para diseñar rápidamente redes novedosas, y mediante la construcción de redes a partir de plantillas de ADN lineales que - a diferencia de los plásmidos necesarios para las pruebas in vivo - se puede amplificar a través de reacciones en cadena de polimerasa (PCR)^33,34.

Las reacciones por lotes son el método más simple mediante el cual se pueden realizar reacciones IVTT, que requieren un único recipiente de reacción en el que todos los componentes de reacción se combinan^35. Tales reacciones son suficientes para la expresión de proteínas y las pruebas de circuitos básicos, pero resultan insuficientes al intentar estudiar el comportamiento dinámico a largo plazo de una red. En el transcurso de una reacción por lotes, los reactivos se agotan o se degradan, lo que resulta en una disminución continua de las tasas de transcripción y traducción. Además, a medida que avanzan los subproductos de las reacciones, se acumulan que pueden interferir con - o inhibir por completo - el correcto funcionamiento de la red. En última instancia, el uso de reactores por lotes limita el comportamiento dinámico que se puede observar, con una regulación negativa particularmente difícil de implementar^5,36.

La versatilidad de los sistemas IVTT permite múltiples métodos alternativos mediante los cuales se pueden realizar reacciones IVTT prolongadas, que van desde el flujo continuo hasta los métodos basados en gotas, así como enfoques de diálisis más simples^{2,30, 37,38,39,40}. La aplicación de dispositivos microfluídicos ofrece a los usuarios un mayor control sobre sus reacciones al tiempo que aumenta el rendimiento y minimiza los costes^35,41,42, con cada enfoque específico ventajas propias. El uso de flujo continuo se puede optimizar fácilmente para aumentar los rendimientos de expresión, sin embargo, la incapacidad para eliminar eficazmente productos de reacción específicos hace que el estudio del comportamiento dinámico no sea trivial³⁹. Mientras que el empleo de sistemas microfluídicos basados en gotas permite el cribado de alto rendimiento de redes novedosas, la dificultad de suministrar nuevos reactivos a la reacción resulta en las gotas que se asemejan a reacciones por lotes de pequeño volumen⁴³. Los reactores basados en diálisis permiten la introducción de reactivos frescos, así como la eliminación de algunos productos de reacción, sin embargo, las moléculas de ARN y proteínas más grandes se acumulan dentro del reactor, siendo demasiado grandes para difundir a través de los poros de membrana. Además, se requieren grandes volúmenes de reactivos para sostener estas reacciones durante períodos prolongados^30,44. En 2013, Maerkl y otros presentaron un dispositivo microfluídico multicapa diseñado específicamente para la realización de reacciones IVTT prolongadas^36,45. El uso de dispositivos microfluídicos multicapa permite el control directo sobre el flujo de fluidos, lo que permite la redirección del flujo, así como el aislamiento de fluido en regiones específicas del dispositivo^46,47. Estas regiones aisladas pueden funcionar como cámaras de reacción independientes a escala de nanolitros en las que se pueden realizar reacciones IVTT. En el transcurso de una sola reacción IVTT, se utilizan inyecciones periódicas de reactivos frescos en el reactor para reponer componentes de IVTT y plantillas de ADN. Simultáneamente, se desplaza un volumen igual de la solución de reacción antigua, eliminando los productos de reacción. De esta manera, se mantiene un entorno fuera de equilibrio donde las tasas de transcripción y traducción basales permanecen en estado estacionario, prolongando la vida útil de las reacciones IVTT y permitiendo que se produzcan comportamientos dinámicos enriquecidos. Mediante la aplicación de este enfoque, los investigadores son capaces de investigar las tasas cinéticas de los procesos individuales que ocurren dentro de un circuito específico, ayudando en la ingeniería directa de nuevas redes genéticas. Por ejemplo, Niederholtmeyer y otros implementaron este enfoque para caracterizar varios elementos de un oscilador de anillo genético, determinando las tasas cinéticas del^{mismo 36}. En estudios posteriores, Yelleswarapu y otros mostraron que las tasas cinéticas del factor de sigma 28₍₂₈) determinadas en condiciones de lote eran insuficientes para describir el comportamiento de un oscilador basado en el número_28,y que la adición de datos basados en flujo predicciones de modelo mejoradas del comportamiento de la red²².

El objetivo de este manuscrito es presentar un protocolo completo para la fabricación de dispositivos microfluídicos multicapa capaces de realizar reacciones IVTT a largo plazo. Además, este manuscrito describirá todo el hardware y software necesarios para realizar reacciones IVTT prolongadas. El accionamiento del dispositivo microfluídico - necesario para controlar el flujo de fluidos en él - se logra mediante una serie de válvulas neumáticas que se conectan directamente a los dispositivos microfluídicos a través de longitudes de tubería. A su vez, las válvulas neumáticas se controlan a través de una interfaz de control virtual personalizada. El flujo de fluido dentro de los dispositivos microfluídicos se logra mediante presión continua que es proporcionada por un sistema de regulación de presión disponible comercialmente. Las reacciones IVTT se realizan típicamente entre 29 oC y 37 oC y se utiliza una incubadora de microscopio para regular la temperatura durante las reacciones. Sin embargo, la funcionalidad de la mezcla IVTT se degrada gradualmente cuando se almacena por encima de 4 oC. Como tal, este manuscrito se expandirá en el sistema de enfriamiento fuera de chip utilizado para enfriar la mezcla de IVTT antes de la inyección en el dispositivo microfluídico. En conclusión, este manuscrito proporciona una visión general completa de los procedimientos necesarios para realizar con éxito reacciones IVTT prolongadas utilizando un reactor de flujo microfluídico, de modo que otros investigadores podrán replicar esta tecnología con aflojar.

Protocol

1. Preparación de obleas

NOTA: Nuestros protocolos son específicos para el fotorresistente positivo 40 XT y el fotorresistente negativo SU8 3050 utilizado durante esta investigación. Se pueden utilizar fotorresistentes alternativos, sin embargo, las velocidades de giro específicas, las temperaturas de horneado y los tiempos de horneado variarán. El diseño del dispositivo microfluídico proporcionado por Niederholtmeyer et al.³⁶ está vinculado en la Tabla de Materiales.

1. Coloque dos obleas de silicio limpias (100 mm de diámetro, <1-0-0> orientadas, 525 m de espesor) en un horno precalentado ajustado a 250 oC y deje que las obleas se deshidraten durante la noche (16 h).
   NOTA: También es posible preparar las obleas utilizando la deposición de vapor HMDS; sin embargo, esto no es necesario si las obleas están suficientemente deshidratadas.
2. Retire una oblea de silicio del horno y déjela enfriar a temperatura ambiente antes de proceder con el recubrimiento de espín. Aplicar 3-4 mL del fotorresistente 40 XT en el centro de la oblea.
3. Para obtener una altura de funcionamiento de 25 m aplique el siguiente protocolo de giro: girar durante 20 s a 500 rpm (110 rpm/s), aumentar la velocidad de giro a 3100 rpm (300 rpm/s) y mantener aquí durante 30 s, y desacelerar la oblea a 0 con una desaceleración de 200 rpm/s. tejido de microfibra cuidadosamente eliminar cualquier cordón de borde que pueda haber ocurrido durante el recubrimiento de espín.
4. Hornee suave mente dos placas calientes separadas a 70 oC y 120 oC de la siguiente manera: deje que la oblea se sitúe a 70 oC durante 30 s. A continuación, transfiera la oblea a la placa de 120 oC y deje reposar aquí durante 3,5 minutos antes de devolver la oblea a la placa de cocción de 70 oC durante otros 30 s. Retire la oblea de la placa caliente y, evitando los golpes bruscos de temperatura, deje que se enfríe a temperatura ambiente.
5. Coloque la fotomáscara de capa de flujo (lado de emulsión hacia abajo) sobre la película fotorresistente y exponga la oblea utilizando una lámpara UV hasta lograr una exposición total de 200 mJ/cm^2.
6. Post-exposición hornea con dos placas calientes (70oC y 105oC) de la siguiente manera: deje que la oblea se sitúe a 70oC durante 20 s antes de transferir la oblea a la placa caliente de 105oC y dejarla aquí durante 40 s. Por último, devuelva la oblea a la placa de cocción de 70oC durante otros 20 s para completar el horneado después de la exposición.
7. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente en una pila de tejidos de microfibra. Desarrolle la oblea transfiriéndola a un plato Petri lleno de 726 MIF fotorresistente desarrollador para iniciar el proceso de desarrollo. El desarrollo se acelera cuando se realiza en una coctelera de sobremesa y toda la oblea se sumerge en el desarrollador.
8. Enjuague la oblea con agua desmineralizada y utilice un microscopio estéreo para comprobar la superficie de la oblea en busca de cualquier residuo de fotorresistente. Si se pueden ver residuos fotorresistentes, devuelva la oblea al desarrollador.
9. Reflujo del fotorresistente positivo colocando la oblea en una placa caliente a 110 oC durante 25 min. Este proceso dará lugar a características redondeadas, así como recocido de cualquier grieta que pueda haber aparecido durante el proceso de fabricación. Proceda a silanizar la oblea como se describe en el paso 1.17.
10. Retire la segunda oblea de silicio del horno, lo que le permite enfriarse a temperatura ambiente antes de proceder con el recubrimiento de espín. Aplicar 5 mL de SU8 3050 fotorresistente en el centro de la oblea.
11. Para obtener una altura de función de 30 m aplique el siguiente protocolo de giro: girar durante 20 s a 500 rpm (110 rpm/s), aumentar la velocidad de giro a 4.000 rpm (330 rpm/s) y mantener aquí durante 42 s, y desacelerar la oblea a 0 con una desaceleración de 200 rpm/s. tejido de microfibra cuidadosamente eliminar cualquier cordón de borde que pueda haber ocurrido durante el recubrimiento de espín.
12. Hornee suavemente utilizando dos placas calientes separadas (65oC y 95oC) de la siguiente manera: deje que la oblea se sitúe a 65oC durante 30 s. A continuación, transfiera la oblea a la placa de 95 oC y deje que descanse aquí durante 14 minutos antes de devolver la oblea a la placa de cocción de 65 oC durante otros 30 s. Retire la oblea de la placa caliente y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
13. Mida la intensidad de la lámpara UV antes de la exposición y utilícela para determinar la duración de la exposición necesaria para alcanzar una dosis total de exposición de 260 mJ/cm². Coloque la fotomáscara (lado de emulsión hacia abajo) en la película fotorresistente y coloque la oblea debajo de la fuente de luz UV. Exponga la oblea utilizando una lámpara UV hasta lograr una exposición total de 260 mJ/cm2.
14. Post-exposición horneando con dos placas calientes (65oC y 95oC) de la siguiente manera: deje que la oblea se sitúe a 65oC durante 60 s antes de transferir la oblea a la placa caliente de 95oC y déjela aquí durante 4,5 minutos. para completar el horno post-exposición.
15. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente en una pila de tejidos de microfibra. Desarrolle la oblea transfiriéndola a un plato Petri lleno de fotodesarrollador mrDev-600 para iniciar el proceso de desarrollo. El desarrollo se acelera cuando se realiza en una coctelera de sobremesa y toda la oblea se sumerge en el desarrollador.
16. Enjuague la oblea con isopropanol y utilice un microscopio estéreo para comprobar la superficie de la oblea en busca de cualquier residuo fotorresistente. Si se pueden ver residuos fotorresistentes, devuelva la oblea al desarrollador. Una vez completamente desarrollado, hornee duro el fotorresisto colocando la oblea en una placa caliente fijada a 150 oC durante 1 h.
17. Silanize ambas obleas para evitar la adhesión de PDMS durante los procesos de litografía suave. Para realizar la silanización, pipetee 2-3 gotas (por oblea) del silano en un pequeño vial de vidrio. Coloque este vial, junto con las obleas en un desecador y tire del vacío durante 5-10 min. Selle el desecador y deje las obleas al vacío durante un período de 12 – 16 h.
    ADVERTENCIA: El silano es tóxico y no debe inhalarse. Tenga cuidado de trabajar en una campana de humos y usar guantes de nitrilo al manipular el silano. Esto incluye la colocación de la bomba de vacío en la campana de humos al tirar de vacío en el desecador.
18. Suelte el vacío del desecador y retire las obleas silanizadas. Enjuagar con agua y usar un vapor de N₂ para secar las obleas. En este punto, las obleas se pueden colocar en el almacenamiento hasta que sea necesario.

2. Fabricación de dispositivos microfluídicos

NOTA: El proceso de litografía suave utilizado para fabricar dispositivos microfluídicos multicapa basados en PDMS se puede separar en tres pasos distintos: 1) La preparación de PDMS de las capas de flujo y control, 2) La alineación y unión de las dos capas PDMS, 3) El la finalización del dispositivo.

1. Preparación de PDMS
   1. Prepare dos soluciones precursoras de PDMS combinando la base y los agentes de curado en un vaso de precipitados de plástico y utilizando una varilla de mezcla para agitar los dos componentes hasta que se mezclen por completo. La capa de control requiere 20 g de agente base y 1 g de agente de curado (relación 20:1). La capa de flujo requiere 40 g del agente base y 8 g del agente de curado (relación 5:1). Desgaslas las soluciones en un desecador.
   2. Coloque la oblea de capa de flujo en una placa Petri y vierta la mezcla PDMS de relación 5:1 sobre la oblea. Desgasifique el PDMS durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire.
   3. Girar recubrir la oblea de la capa de control (preparado con el negativo SU8 3050photoresist) con 20:1 relación PDMS. Vierta 5-10 ml del PDMS en el centro de la oblea y ejecute el siguiente protocolo de giro (retenga el izquezco sobre PDMS para su uso posterior): gire a 500 rpm durante 15 s (100 rpm/s), aumente la velocidad de centrifugado a 1450 rpm (300 rpm/s) durante 45 s para 45 s( , y luego desacelere la oblea a 0 rpm (200 rpm/s).
   4. Para garantizar un espesor de película PDMS homogéneo, coloque la oblea recubierta PDMS sobre una superficie nivelada en una placa Petri cerrada (para evitar la contaminación por polvo). Deje que la oblea se sit for 30 min.
   5. Retire la capa de flujo del desecador y coloque las capas de flujo y control en un horno (80 oC). Curar ambas capas durante 28-30 minutos y eliminar cuando el PDMS es lo suficientemente maleable como para manipular, sin dejar de ser ligeramente pegajoso. Proceda inmediatamente con el proceso de alineación.
2. Alineación y unión
   1. Con un bisturí, quite cada uno de los cuatro dispositivos del PDMS en la oblea de la capa de flujo. Al retirar la capa PDMS de la oblea de silicio, cubra inmediatamente el lado de la entidad con cinta adhesiva para evitar la contaminación por partículas de polvo.
   2. Alinee aproximadamente los bloques de capa de flujo en la capa de control por ojo, colocando el lado de la entidad del dispositivo en contacto con la capa de control PDMS. Posteriormente, realice ajustes finos en la posición de cada uno de los bloques de capa de flujo para alinear los canales de la capa de flujo con los canales de la capa de control, utilizando un microscopio estéreo para ayudar en la visualización de los ajustes.
   3. Aplique presión para eliminar los bolsillos de aire entre las dos capas PDMS. Vierta el PDMS restante con una relación de 20:1 guardado anteriormente alrededor de los bloques de capa de flujo alineados. Coloque 100 g de peso en cada uno de los dispositivos para garantizar un contacto suficiente durante el proceso de unión.
   4. Devolver los dispositivos alineados (incluidos los pesos) al horno de 80 oC y dejar que se adhieran durante al menos 1,5 h y no más de 6 h.
3. Finalización del dispositivo
   1. Retire la oblea del horno y extraiga cada uno de los dispositivos individuales de la oblea de la capa de control, cubriendo el lado de la característica de cada dispositivo con cinta adhesiva.
   2. De forma iterativa, haga un solo agujero para cada una de las 9 entradas de capa de flujo, 24 entradas de canal de capa de control y la salida de capa de flujo única de cada dispositivo. Golpee el dispositivo con el lado de la función hacia arriba, utilizando una cámara para asegurarse de que los agujeros se perforan dentro de los límites de la entidad.
   3. Para cada dispositivo, limpie una sola diapositiva de microscopio con isopropanol y acetona y seque las diapositivas bajo una corriente de N_2. Posteriormente, coloque las diapositivas del microscopio en una placa caliente establecida a 150 oC durante 15 minutos.
   4. Utilice la ceniza de plasma de oxígeno para unir los dispositivos PDMS a los portaobjetos de vidrio, aplicando una potencia de ceniza de 50 W durante 45 s. Asegúrese de que el lado de la función del dispositivo esté orientado hacia arriba al enroscar. Una vez completado, coloque la función del dispositivo hacia abajo en la corredera de vidrio, aplicando presión para eliminar el gas atrapado entre las superficies.
   5. Colocar los dispositivos unidos en una placa caliente establecida a 110 oC durante 1 h. Los pesos se pueden colocar encima de los dispositivos para mejorar la adherencia del dispositivo.

3. Configuración de hardware

NOTA: Para lograr el control sobre los chips microfluídicos, es necesario instalar y conectar numerosas piezas de hardware entre sí. Se requieren tres grupos distintos de hardware: 1) Sistema de control neumático para los canales de control, 2) Un regulador de presión neumático para controlar el flujo de los reactivos de reacción dentro del dispositivo, y 3) Un sistema de refrigeración para enfriar la solución de reacción IVTT antes de inyección en el dispositivo microfluídico. En la Figura 1se proporciona información general sobre la configuración de hardware. Cabe señalar que los protocolos proporcionados aquí intentan ser lo más generales posible, sin embargo se hace referencia a ciertas piezas específicas de equipo utilizadas a lo largo de nuestra investigación. Todo el hardware puede ser reemplazado por alternativas capaces de realizar la misma función. En tales casos, los protocolos aquí se pueden utilizar para describir los pasos generales necesarios para configurar el sistema y los requisitos de cada uno de los componentes. Brower et al.⁴⁸ y White and Streets⁴⁹presentan configuraciones de hardware alternativas.

1. Sistema de control neumático (véase la figura 2)
   1. Mediante el protocolo de los fabricantes, establezca una conexión TCP entre el controlador de bus de campo y la estación de trabajo del usuario. Utilice el software de control (proporcionado como archivos complementarios) para componer comandos MODBUS que se envían a través de la conexión TCP al controlador y accionar las válvulas solenoides.
   2. Amplíe el controlador de bus de campo con ocho módulos de salida digital de 4 canales, uno para cada válvula solenoide que se utilice. Cada electroválvula preside un pasador de conexión. Conecte el cable positivo a una de las cuatro salidas positivas en uno de los módulos de salida digital mientras conecta el cable negativo a uno de los puertos de tierra de los módulos de salida digital.
      NOTA: Para que el sistema funcione correctamente, los solenoides deben conectarse sistemáticamente, con el primer solenoide conectado al primer puerto de salida, el segundo solenoide al segundo puerto de salida y así sucesivamente. En nuestro sistema, se utilizan dos matrices de válvulas con 8 y 22 válvulas solenoides respectivamente. Los puertos de salida 1-8 se conectan a la matriz de 8 válvulas y los puertos de salida 9-30 se conectan a la matriz de 22 válvulas.
   3. Conecte ambas matrices de válvulas a una fuente de aire comprimido mediante tubos de 1/4". Utilice reguladores de presión para ajustar la presión de la matriz de 22 válvulas a 3 bar, y la matriz de 8 válvulas a 1 bar.
2. Regulación de la presión de caudal (véase la figura 3)
   NOTA: Para fluir fluidos a través de la capa de flujo del dispositivo microfluídico, se utiliza un regulador de presión de 4 puertos disponible comercialmente. La presión de salida de cada puerto se regula a través del software suministrado con el controlador de presión. Conecte el regulador de presión a un ordenador mediante el conector USB suministrado.
   1. Conecte el regulador de presión a una fuente de aire comprimido, asegurándose de que la presión suministrada no exceda la presión máxima permitida por el regulador.
   2. Conecte un conector de barba Luer macho a 3/32" a cada uno de los cuatro puertos de salida de bloqueo Luer hembra del regulador de presión. Conecte una longitud de tubo blando (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) a la barba.
   3. Conecte un segundo conector Luer macho a un conector de barba de 3/32" al extremo abierto del tubo blando y adjúntelo a los puertos del conector del depósito de fluidos.
   4. Utilice el software proporcionado para ajustar la presión deseada de cada toma de corriente del regulador de flujo, presurizando los reactivos almacenados dentro de los depósitos para dar lugar al flujo de los reactivos en el dispositivo microfluídico. La conexión de los depósitos al dispositivo microfluídico se discutirá en la sección 4.2.
3. Configuración de refrigeración fuera del chip (consulte la figura 4)
   1. Utilice tubos de PVC (OD: 10 mm, ID: 6 mm) para conectar el sistema de refrigeración por agua al bloque de agua de placa fría utilizando accesorios de compresión. Llene el depósito de líquido del sistema de refrigeración por agua con un refrigerante e incline suavemente la unidad para desplazar cualquier aire atrapado, añadiendo continuamente refrigerante al depósito para asegurarse de que permanece lleno. Cuando se retire todo el gas del sistema, llene el depósito a aproximadamente el 90-95% de su volumen máximo.
   2. Tubo de PTFE de bobina (OD: 0.042", ID: 0.022") sobre la cara fría del elemento Peltier y asegúrelo con cinta adhesiva. Asegúrese de que un extremo del tubo de PTFE esté conectado a los depósitos del sistema de control de presión de la capa de flujo (como se describe en la sección 4.3). El otro extremo del tubo de PTFE debe sobresalir no más de 1 cm de la superficie de Peltier. Inserte un tubo PEEK de 5 – 10 cm de longitud (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) en el extremo saliente del tubo de PTFE. El llenado del tubo y la conexión al dispositivo microfluídico se explican más detalladamente en la sección 4.3.
   3. Coloque la cara caliente del elemento Peltier en la placa fría del bloque de agua, aplicando suficiente compuesto térmico a las dos caras. Asegúrese de que el tubo, el elemento Peltier y el bloque de refrigeración estén en contacto directo entre sí en todo momento.
   4. Conecte el elemento Peltier al controlador de temperatura (a través de un conector de bus serie), de modo que se pueda regular la tensión suministrada al Peltier. Coloque de forma segura un termistor en la superficie Peltier, conectando la salida al controlador de temperatura. Después de encender el enfriador de agua, adapte la tensión suministrada al Peltier hasta que la temperatura sea estable a 4 oC.
      NOTA: Con esta configuración, la temperatura del Peltier se controla manualmente adaptando la tensión suministrada, mientras que el termistor solo sirve para controlar la temperatura.

4. Preparación de un experimento

NOTA: Antes de iniciar un experimento, se debe preparar el dispositivo microfluídico y los reactivos de reacción deben insertarse en el tubo correcto para inyección en el dispositivo. En esta sección se discutirá: 1) La conexión de la tubería del canal de control al dispositivo, 2) La conexión de los reactivos de entrada no refrigerados al dispositivo y 3) La conexión de los reactivos de entrada refrigerados al dispositivo.

1. Conexión del tubo del canal de control
   1. Para cada uno de los canales de control del dispositivo microfluídico, corte una longitud de tubo (OD: 0.06", ID: 0.02"). En un extremo, inserte el pasador de un talón Luer de 23 G, 1/2" y en el otro inserte un pasador de conexión de acero inoxidable (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
   2. Conecte el talón Luer a un Luer macho a un conector de nylon de barba de 3/32". Inserte la barba del conector en una longitud de tubo de poliuretano (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Inserte este tubo de poliuretano directamente en una de las válvulas solenoides.
   3. Fije un talón Luer de 23 G, 1/2" a una jeringa e insértelo en una pieza corta (3-4 cm) de tubo (OD: 0.06", ID: 0.02"). Coloque el extremo abierto de este tubo en un depósito de agua ultrapura y llene la jeringa con agua ultrapura.
   4. Numeracada cada canal de control del dispositivo microfluídico como se muestra en la Figura 5. Para cada canal (excluyendo los canales de control 1 a 3, que no están llenos de agua), busque el tubo correspondiente (conectado a las válvulas solenoides) e inserte un pasador metálico en el extremo abierto del tubo conectado a la jeringa. Inyecte agua en el tubo del canal de control hasta que se haya llenado la mitad de la longitud.
   5. Desconecte el tubo de la jeringa e inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el orificio correspondiente del dispositivo microfluídico. Repita el proceso para todos los canales de control.
   6. Utilice la interfaz de control para abrir todas las válvulas solenoides. Esto presurizará el fluido dentro del tubo del canal de control, forzándolo en el dispositivo microfluídico y cerrando todas las válvulas basadas en membrana dentro del dispositivo. En la Figura 6se muestra un ejemplo de membranas abiertas y cerradas dentro del dispositivo.
2. Conexión de reactivos no refrigerados al dispositivo
   1. Para cada uno de los reactivos no refrigerados, corte una longitud de tubería (OD: 0,06", ID: 0,02") para conectar la salida del depósito a las entradas del dispositivo microfluídico.
   2. Tome un extremo del tubo e insértelo en el depósito, asegurándose de que el tubo llegue a la base del depósito. La salida del tubo del depósito debe apretarse de tal forma que se logre un sello hermético. Inserte un pasador de conexión de acero inoxidable (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) en el extremo abierto del tubo.
   3. Coloque un talón Luer de 23 G, 1/2" al final de una jeringa pequeña (1 ml). Añadir una longitud corta de tubos (OD: 0.06", ID: 0.02") al talón Luer. Colocando el extremo del tubo en la solución de reactivo deseada, llene la jeringa con el reactivo.
   4. Inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el tubo de poliuretano conectado a la jeringa y llene el tubo con el reactivo. Cuando se utilizan pequeños volúmenes de reacción, el reactivo no entrará en el depósito, y el tubo en sí actuará como el depósito. Desconecte la jeringa e inserte el pasador del conector en uno de los orificios de entrada de la capa de flujo del dispositivo microfluídico.
   5. Aplique presión a cada uno de los depósitos utilizando el software regulador de presión para forzar los reactivos en el dispositivo microfluídico.
3. Conexión de fluidos refrigerados al dispositivo microfluídico
   1. Asegúrese de que el enfriador de agua y el elemento Peltier estén encendidos, con la temperatura superficial del Peltier a 4 oC. Monte la configuración de refrigeración lo más cerca posible del dispositivo microfluídico, minimizando el volumen no refrigerado entre el Peltier y la entrada del dispositivo.
   2. Conecte el extremo abierto del tubo de PTFE a un tubo conectado a uno de los depósitos de fluidos (como se describe en la sección 4.2) utilizando un pasador de conector de acero inoxidable (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
   3. Conecte una jeringa pequeña (1 ml) a un talón Luer (23 G, 1/2") con una longitud corta de tubo (OD: 0,06", ID: 0,02") conectado al final. Llene la jeringa con el reactivo enfriado (aquí, la solución de reacción IVTT).
   4. Conecte el tubo PEEK a la jeringa a través del tubo conectivo y aplique presión constante a la jeringa, forzando el reactivo a través del tubo PEEK y en el tubo de PTFE. Desconecte el tubo PEEK de la jeringa e insértelo directamente en una de las entradas del canal de flujo del dispositivo microfluídico. Cuando se aplica presión a través del software regulador de presión, el reactivo refrigerado se verá forzado a entrar en el dispositivo microfluídico.

5. Experimentación

NOTA: Antes de realizar experimentos, todas las conexiones de hardware y tuberías detalladas en las secciones 3 y 4 de los protocolos deben completarse, y todos los reactivos deben estar conectados al dispositivo. El procedimiento experimental se puede dividir en cuatro partes distintas: 1) La carga del dispositivo microfluídico, 2) Preparación del microscopio, 3) La calibración del dispositivo y 4) Realización del experimento. La interfaz de control virtual personalizada (consulte la figura 7) utilizada a lo largo de esta investigación se proporciona como un recurso complementario a través de la lista de materiales)

1. Carga del dispositivo microfluídico
   1. Coloque el dispositivo microfluídico, con todo el tubo de capa de control y flujo unido a la etapa del microscopio y cierre las aberturas de la incubadora. Establezca la temperatura ambiente de la incubadora a 29 oC. Asegúrese de que el sistema de refrigeración está encendido y se ha ajustado a 4 oC antes de iniciar el experimento.
   2. Asegúrese de que todos los canales de flujo y control estén presurizados. Ajuste la presión de los canales de control 1-3 a 1 bar, y presuriza los canales de control 9-29 a 3 bar. Los reactivos requieren una presión de entre 20 y 100 mbar para ser aplicado a los depósitos de fluidos utilizando el software regulador de presión.
   3. Retire el aire del dispositivo microfluídico utilizando uno de los reactivos. Cierre la salida del dispositivo (presurice el canal de control 29) y despresurice simultáneamente los canales de control 1-3 y 15-28. A continuación, despresuriza selectivamente los canales de control del multiplexor para permitir que el reactivo seleccionado fluya hacia el dispositivo. Utilice el microscopio para supervisar la extracción de aire.
      NOTA: En el caso de que los reactivos no se carguen correctamente en el dispositivo o de que las burbujas de aire no se estén eliminando, la presión se puede aumentar hasta 350 mbar.
   4. Asegúrese de que todos los reactivos fluyan correctamente, sin introducir aire, utilizando la función Flush en el software de control. La supervisión del flujo de fluidos se puede simplificar cargando primero un fluoróforo y monitoreando su desplazamiento por reactivos individuales.
2. Preparación del microscopio
   1. Con el microscopio, localice cualquier punto de interés (un solo punto dentro de cada reactor es suficiente) dentro del dispositivo microfluídico, y almacene las coordenadas de los mismos. Estos puntos se tomarán imágenes durante los procesos de calibración y experimentales.
      NOTA: Durante los procedimientos de calibración y experimentales incluidos en el software de control, se indica al microscopio que capture periódicamente las imágenes en las coordenadas previamente almacenadas. Para lograrlo, el software de control se comunica con el software del microscopio, informándole para grabar nuevas imágenes. Esta comunicación es única para cada configuración del microscopio, y como tal esta funcionalidad se ha modificado dentro de la interfaz de software proporcionada. Proporcionado es un ejecutable ficticio, que puede ser modificado por el usuario final para la compatibilidad con su propio sistema de microscopio.
3. Calibración del dispositivo microfluídico
   1. Determinar el volumen de fluido desplazado de cada reactor durante un único paso de entrada (secuencia de bomba proporcionada por los canales de control de accionamiento peristáltica 15-17, que comprende 6 comandos MODBUS ejecutados secuencialmente), ejecutando el protocolo de calibración en el paquete de software.
   2. Establezca los siguientes campos de datos dentro del software de control: Elution Buffer Channel, Fluorophore Channel, Number of Dilution Cycles (el valor predeterminado es 10 diluciones), Number of Inflow Steps (el valor predeterminado es 15 pasos), Number of Mixing Cycles (el valor predeterminado es 4 ciclos) y el tiempo entre los ciclos de mezcla (el valor predeterminado es 0 segundos). Inicie la calibración pulsando Realizar experimento de calibración.
      NOTA: Durante el proceso de calibración, todos los reactores se llenan con un fluoróforo y se graban imágenes. Posteriormente, se realizan una serie de diluciones en las que se mide un eluyente en los reactores (basado en el número establecido de pasos de entrada), desplazando así el fluoróforo. Después de mezclar a fondo, se toman nuevas imágenes. Este proceso se repite para el conjunto Número de ciclos de dilución.
   3. Una vez finalizada la calibración, siga los pasos presentados por el software de control, completando el análisis del experimento de calibración.
      NOTA: El análisis proporcionará a los usuarios la relación de actualización para cada reactor en función de la disminución de fluorescencia registrada durante cada ciclode dilución. Este valor indica la fracción del volumen del reactor desplazada por el conjunto Número de pasos de entrada . A su vez, este valor se utilizará durante los experimentos para determinar cuántos pasos de entrada se requieren para desplazar un volumen de reactor específico.
4. Realización del experimento
   1. Establezca los valores necesarios para el experimento deseado dentro de la interfaz de control virtual. Crítico es la fracción de actualización [%] que determina el volumen del reactor desplazado por ciclo experimental y debe establecerse entre 15 y 40%.
      NOTA: El protocolo experimental específico determinará qué campos de la interfaz de control se deben establecer antes de iniciar el experimento. Se requerirá cierta codificación menor para adaptar la interfaz de control para experimentos novedosos.
   2. Inicie el protocolo experimental pulsando el botón Realizar experimento en la interfaz de control.
      NOTA: Sin cambios, el software proporcionado inicia una expresión de proteína simple. Los reactores 1 y 8 se utilizan como controles, mientras que los reactores 2-7 albergan experimentos idénticos. Aquí, el 75% del volumen del reactor comprende la solución IVTT, y el 25% es agua ultrapura o una solución de ADN lineal de 2,5 nM. Las diluciones se producen cada 15 minutos, con el 30% del volumen del reactor desplazado por dilución. Las imágenes se graban al final de cada ciclo de dilución.

6. Análisis de datos

NOTA: Se han proporcionado guiones para el análisis de las imágenes (ver archivos complementarios o la Tabla de Materiales),haciendo uso del paquete de análisis 'bfopen', que es necesario para la revisión de'.nd2'archivos (proporcionados por nuestro nuestro microscopio).

1. Ejecute el script de análisis 'calibrationScript.m' y una vez que se le solicite seleccione el archivo deseado '.nd2'. Se mostrará una sola imagen del reactor con la que se puede determinar la intensidad de imagen correcta. Utilice el control deslizante para optimizar la intensidad de la imagen de forma que los bordes del canal microfluídico sean claramente visibles.
2. Se mostrará una imagen del reactor. Dentro de esta imagen, seleccione un área dentro del canal del reactor cuyo intensidad de fluorescencia debe determinarse.
   NOTA: La intensidad de fluorescencia de cada reactor, para cada imagen grabada se determinará con los resultados mostrados en una gráfica simple, permitiendo la visualización de los resultados.

Results

Para demostrar la eficacia de la plataforma microfluídica multicapa para la conducción de experimentos IVTT, se utilizó la configuración descrita para expresar la proteína deGFP. El experimento se llevó a cabo en una mezcla de reacción³⁰ IVTT disponible comercialmente - que comprende todos los componentes de transcripción y traducción necesarios - complementado con sustratos de reacción y plantillas de ADN. Los experimentos se llevaron a cabo a una temperatura de 29 oC; una temperatura que se encuentra óptima para la expresión IVTT de proteínas.

El dispositivo microfluídico posee nueve ensenadas únicas, de las cuales cuatro fueron utilizadas durante este experimento. El primero contenía la mezcla de reacción IVTT obtenida comercialmente. La mezcla de reacción IVTT acomoda todos los componentes necesarios para expresar con éxito las proteínas, sin embargo, GamS purificado se añadió a la mezcla de reacción - a una concentración final de 1,3 m - antes de cargar en el dispositivo microfluídico. La adición de la proteína GamS sirve para minimizar la degradación de las especies de ADN lineal al realizar los experimentos. Fundamentalmente, la mezcla de IVTT se inyectó en tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) enrollados en un elemento Peltier con una temperatura superficial de 4 oC para enfriar la solución antes de la inyección de la misma en el dispositivo microfluídico; la degradación de la solución de reacción antes de su uso. Se utilizó un tubo de cetona de éter de poliéter micro-bore (PEEK) para conectar el tubo de PTFE dejando la superficie del elemento Peltier con el dispositivo microfluídico, reduciendo el volumen de la mezcla de reacción IVTT que no se enfría. La segunda solución insertada en el dispositivo contenía la codificación de la plantilla de ADN lineal para el deGFP - disuelto en agua ultrapura - a una concentración de 10 nM. La tercera solución, el agua ultrapura, sirvió para múltiples propósitos durante los procedimientos experimentales. Principalmente, el agua ultrapura se utilizó para asegurar que el volumen desplazado por dilución fuera igual para todos los reactores, actuando como un reemplazo para el ADN en las reacciones de control. Además, también se utilizó agua ultrapura para diluir el fluoróforo durante la calibración del dispositivo y para vaciar el volumen muerto del dispositivo al cambiar entre reactivos. La solución final insertada en el dispositivo fue una solución fitC-dextran purificada (25 m) necesaria para realizar la calibración inicial del dispositivo. Las soluciones de ADN, agua y fluoróforo se inyectaron en tubos (0,02" ID, 0,06" OD) que posteriormente podrían insertarse en uno de los canales de entrada del dispositivo microfluídico según la Sección 4.2 de los protocolos. Como tal, estas soluciones se almacenaron a 29 oC para la totalidad de los experimentos.

El accionamiento de los canales de control del dispositivo microfluídico se logra a través de un software de control personalizado donde cada uno de los canales de control se puede accionar individualmente. La ejecución de reacciones IVTT prolongadas no se puede lograr a través de este proceso manual y requiere el uso de protocolos automatizados incorporados dentro del software de control. Al preparar un dispositivo microfluídico para experimentos, se pueden utilizar protocolos automatizados similares para ejecutar una serie de procesos útiles: el lavado del volumen muerto del dispositivo con un nuevo reactivo, la mezcla de los reactivos dentro del reactor de anillo y la carga de un nuevo reactivo en el reactor mientras desplaza un volumen igual de la solución actual. Además, hay dos procesos complejos disponibles: la conducción de una calibración del dispositivo y la ejecución de una expresión prolongada de proteínas libres de células. Todos los procesos antes mencionados se pueden ejecutar fácilmente desde la interfaz principal, junto con la capacidad de configurar múltiples parámetros para variar ajustes de proceso específicos como el canal de entrada, el volumen de entrada y la duración de la mezcla.

Debido a las fluctuaciones en la presión y las imperfecciones durante la fabricación de dispositivos microfluídicos, el volumen de fluido desplazado durante un solo ciclo de inyección puede variar entre dispositivos. Como tal, antes de realizar experimentos IVTT, se determinó el volumen del reactor desplazado por ciclo de inyección (Refresh Fraction). Esta calibración requiere el llenado de los ocho reactores con una solución de referencia fluorescente. En este caso, se utilizó una solución purificada de FITC-dextran (25 m). Posteriormente, los reactores se diluyen 10 veces con agua ultrapura. Al medir la disminución de la fluorescencia por ciclo de dilución para cada reactor, se determinó el volumen de fluido desplazado durante un único ciclo de inyección. Dentro del software de control, este valor (la relación de actualización) se registró para su uso durante el experimento IVTT. Fundamentalmente, para tener en cuenta las variaciones en el caudal en todo el dispositivo, así como las discrepancias en los volúmenes individuales del reactor, la relación de actualización se determina y almacena para cada reactor individual. La secuencia de llenado y dilución de los reactores se llevó a cabo automáticamente utilizando el programa Realizar calibración que forma parte del software de control. Los resultados del experimento de calibración se muestran en la Figura 8.

El proceso preprogramado más complejo ejecuta un experimento IVTT de larga duración, lo que permite a los usuarios iniciar el experimento y posteriormente permitirle operar desatendido hasta su finalización. A lo largo del experimento, los reactores 1 y 5 se utilizaron como espacios en blanco, con sólo agua añadida a los reactores durante las diluciones. Los reactores 2 y 6 se utilizaron como controles negativos y contenían sólo solución de reacción IVTT y agua ultrapura. Los reactores restantes (3, 4, 7 y 8) contenían las soluciones de reacción IVTT y 2,5 nM de codificación de ADN lineal para el gen deGFP. La inicialización de los reactores se logra llenando completamente todos los reactores (excluyendo 1 y 5) con la solución de reacción IVTT, antes de que el 25% del volumen del reactor fuera desplazado con agua ultrapura. A partir de entonces, se inició la inyección periódica de reactivos en los reactores. El experimento se llevó a cabo de tal manera que se inyectaron nuevos reactivos en los reactores cada 14,7 minutos, con el 30% del volumen del reactor siendo desplazado durante cada ciclo de dilución. La composición de cada inyección era tal que el 75% del líquido inyectado comprendía una solución ivTT fresca, mientras que el 25% restante consistía en ADN o agua ultrapura. Después de cada inyección de nuevos reactivos, los reactores se mezclaron continuamente, después de lo cual se registró una imagen de fluorescencia de cada reactor utilizando el microscopio. Posteriormente se permitió que la reacción se ejecutara continuamente durante 68 ciclos, resultando en una duración experimental de 16,5 h. Los resultados de este experimento se indican en la Figura 9.

Al realizar experimentos IVTT prolongados, hay dos causas principales para el fracaso de una reacción; la introducción de aire en el dispositivo microfluídico o la degradación de la solución de reacción IVTT. La aparición de aire dentro del dispositivo microfluídico es más a menudo el resultado directo de pequeñas burbujas de aire existentes en las soluciones de entrada, que posteriormente se inyectan en el dispositivo microfluídico. Al entrar en el dispositivo, la presencia de aire inhibe el flujo adecuado de fluidos, por lo que las reacciones ya no se refrescan periódicamente, lo que conduce a la formación de reacciones por lotes dentro de los anillos del reactor. En algunos casos, el aire se elimina lentamente del dispositivo por el lavado repetido de los reactivos, después de lo cual la reacción continúa según lo previsto (como se muestra en la Figura 9). En otros casos, el aire permanece atrapado, y sólo se puede eliminar abortando el experimento y posteriormente aplicando presión continua (alta) a la capa de flujo del dispositivo microfluídico, análogo al proceso de llenado descrito en la Sección 5.1 de los protocolos. Durante nuestros experimentos, el lysato celular se almacena en tubos de PTFE en un elemento Peltier enfriado a 4 oC. Ambas medidas ayudan a limitar la degradación de la solución de reacción IVTT a lo largo del tiempo, con el tubo de PTFE inerte que garantiza una interacción limitada entre el tubo y la solución de reacción y las temperaturas frías que preservan la funcional (bio)molecular componentes necesarios para realizar la TEDT. En caso de degradación de la solución de reacción - como resultado de un enfriamiento insuficiente o interacciones no deseadas entre la solución de reacción y el entorno de almacenamiento - entonces esto se exhibirá experimentalmente como una reducción gradual de la proteína expresión con el tiempo. Una vez degradada, la solución de reacción IVTT no se puede recuperar y se debe preparar un nuevo experimento.

Figura 1. La configuración de hardware necesaria para realizar reacciones IVTT continuas. A) Esquema de la configuración de hardware. B) Fotografía de la configuración utilizada a lo largo de este manuscrito. La implementación de un dispositivo microfluídico multicapa para reacciones IVTT continuas requiere una amplia configuración de hardware para regular la presión de flujo, accionar canales de control, reacciones y reactivos de calor y frío, almacenar fluidos e imaginar el dispositivo durante Experimentos. Los experimentos se realizan a temperaturas de 30oC, lo que se logra colocando el microscopio dentro de una incubadora establecida a esta temperatura. Para evitar el deterioro de la solución de reacción IVTT, se almacena dentro de tubos de PTFE enrollados sobre la cara fría de un elemento Peltier. La temperatura del elemento Peltier se establece en 4 oC, con un enfriador de agua y un bloque de agua que se utiliza para mantener esta temperatura. Los reactivos que no requieren refrigeración, se almacenan en depósitos de fluidos fuera de la incubadora del microscopio. La presión constante se aplica a estos depósitos mediante un regulador de presión controlado por ordenador. De esta manera, los fluidos son forzados a través del tubo de salida de los depósitos, que se conectan directamente a los canales de entrada del dispositivo microfluídico. Cada uno de los canales de control del dispositivo microfluídico está conectado a una válvula neumática. Toda la matriz de válvulas está bajo presión constante. La apertura de la válvula permite la presurización del fluido dentro del tubo que conecta la válvula neumática al canal de control del dispositivo microfluídico, abriendo y cerrando así las membranas PDMS que se encuentran dentro del dispositivo microfluídico. Las válvulas neumáticas se abren y cierran a través de una interfaz de usuario que ordena a un controlador de bus de campo (no se muestra) que abra y cierre válvulas neumáticas específicas. Figura adaptada de Yelleswarapu et al.²². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Descripción general de la configuración de la válvula neumática y la conexión del canal de control. Se muestra una matriz de 8 válvulas con tres conexiones de canal de control instaladas en las válvulas 1, 2 y 3. El aire comprimido se puede suministrar a la matriz de válvulas a través de tubos de 1/4". Para las actuaciones de los canales de control se utilizan dos presiones: 1 bar para los canales de control de presión inferior (1, 2 y 3) y 3 bar para los canales de control de presión más altos (9 a 30, no se muestra aquí). El tubo se puede llenar con agua ultrapura e insertarse en una de las entradas del canal de control utilizando un pasador de conector de acero inoxidable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Descripción general del regulador de presión de flujo comercial y del sistema de reservorio. Un regulador de presión disponible comercialmente se utiliza para inyectar fluidos en la capa de flujo del dispositivo microfluídico multicapa. La conexión del controlador de presión a un ordenador permite la modulación de la presión utilizada para realizar las inyecciones de fluidos. Los reactivos se pueden almacenar en un depósito de fluidos, que está conectado directamente al regulador de presión. La aplicación de presión en el depósito fuerza el fluido fuera del depósito a través del tubo de salida. Este tubo de salida se puede conectar directamente a una de las entradas de fluidos del dispositivo microfluídico mediante un pasador de conector de acero inoxidable. En caso de que el volumen del reactivo no pueda alcanzar el depósito de fluidos, el tubo de salida actúa como depósito para el reactivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Descripción general del sistema de refrigeración utilizado para enfriar los reactivos de reacción. (Izquierda)Configuración de refrigeración aislada y (derecha) Configuración de refrigeración colocada dentro del microscopio y conectada al dispositivo microfluídico. Se utiliza un elemento Peltier para enfriar la solución de reacción IVTT antes de la inyección en el dispositivo microfluídico. El reactivo se almacena dentro de tubos de PTFE enrollados sobre la cara fría del elemento Peltier. Se utiliza una longitud de tubo PEEK para transferir el fluido enfriado al dispositivo microfluídico, con el pequeño diámetro interno (0,005") minimizando el volumen del reactivo que ya no se enfría. Junto con el tubo de PTFE enrollado, se coloca un termistor, lo que permite un monitoreo de temperatura en tiempo real en la superficie del elemento Peltier. La tensión aplicada al Peltier se establece de tal forma que la temperatura superficial del Peltier se mantenga entre 0 oC y 4 oC. Para eliminar el exceso de calor producido por el elemento Peltier, la cara caliente del Peltier se coloca contra un bloque refrigerado por agua, con la adición de grasa de disipador de calor libre de silicona asegurando una transferencia de calor óptima entre las dos caras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Descripción general del diseño del dispositivo microfluídico. El reactor de flujo microfluídico para reacciones IVTT continuas consta de ocho anillos de reactor, cada uno con un volumen de 10,7 nL. Nueve entradas permiten la entrada de nueve soluciones de reacción únicas en el dispositivo. 24 canales de control regulan el flujo de fluidos dentro del dispositivo. Los canales de control 9 a 14 forman un multiplexor. Estos canales de control deben ser presurizados en todo momento para inhibir el flujo de fluido en el dispositivo. La despresurización de dos canales de control permite simultáneamente la entrada de un único reactivo. Los canales de control 15, 16 y 17 se utilizan para bombear peristálticamente los reactivos en el dispositivo de forma controlada. Los canales de control 18 a 25 controlan cada uno la entrada de uno de los ocho reactores que se encuentran dentro del dispositivo. El canal de control 26 puede cerrar el canal de descarga, forzando así el fluido en los reactores. El canal de control 27 ayuda al llenado homogéneo de los reactores. Los canales de control 28 y 29 regulan las salidas del reactor de anillo y la única salida del dispositivo respectivamente. Por último, los canales de control 1, 2 y 3 se utilizan para bombear peristálticamente el fluido dentro de los reactores de anillo, lo que resulta en la mezcla de los reactivos. El diseño de este dispositivo microfluídico y la figura están adaptados de Neiderholtmeyer et al.²⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Válvula a base de membrana dentro del dispositivo microfluídico. A) Canal de flujo dentro del dispositivo microfluídico. Dos canales de control se pueden ver en segundo plano. Estos canales no están presurizados y, como tal, las válvulas están abiertas (flujo de lata de fluidos). B) Los dos canales de control que intersecan los canales de la capa de flujo se han presurizado, cerrando las válvulas (es decir, el flujo de fluidose se ve impedido). Tras la presurización de los canales de control, la membrana delgada PDMS que separa los canales de capa de flujo y control se desvía hacia arriba (la capa de control se encuentra debajo de la capa de flujo) que cierra el canal de capa de flujo. El redondeo del canal de capa de flujo es fundamental para garantizar que la membrana desviada cierre completamente el canal de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Interfaz de usuario utilizada para controlar el dispositivo microfluídico. A lo largo de esta investigación, se ha utilizado una interfaz de control personalizada para controlar el flujo de fluidos dentro de los dispositivos microfluídicos. La interfaz permite a los usuarios accionar individualmente cada uno de los canales de control (numerados 1-3 y 9-29), o ejecutar protocolos elaborados que resultan en el lavado y la carga de reactivos, la calibración del dispositivo microfluídico, y la ejecución de Experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Resultados de un experimento de calibración. Durante un experimento de calibración, los reactores se llenan con un fluoróforo (25 m FITC-Dextran) después del cual se registra la intensidad de fluorescencia. Posteriormente, una serie de diluciones siguen, donde se utiliza un número determinado de pasos de entrada (15) para inyectar agua ultrapura en los reactores. Después de cada dilución, los reactivos se mezclan y se mide la fluorescencia. La disminución de la intensidad de fluorescencia por dilución revela el volumen del anillo del reactor desplazado para el número establecido de pasos de entrada; un valor llamado Refresh Ratio. A) La intensidad media y la desviación estándar de los ocho reactores se muestran en rojo, con las trazas de intensidad individuales mostradas en gris. B) La relación de actualización media y la desviación estándar se muestran para cada paso de dilución en rojo. Las relaciones de actualización individuales de cada reactor individual se muestran en gris. Se puede ver que siete de los ocho reactores muestran un comportamiento muy similar, sin embargo, un reactor muestra fluctuaciones en la relación de actualización después del séptimo ciclo de dilución. Esto pone de relieve la necesidad de relaciones de actualización únicas para cada uno de los reactores, en lugar de utilizar una relación de actualización media para la inyección de reactivos en los reactores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. Resultados de un experimento IVTT que expresa la proteína deGFP. Se inició una reacción prolongada de IVTT de tal manera que el 30% del volumen del reactor se desplaza cada 14,6 minutos. La reacción se permitió correr durante más de 16 horas antes de ser terminada. Dos reactores del dispositivo microfluídico se utilizaron como espacios en blanco, con sólo agua ultrapura que se voló a través de los reactores durante todo el experimento (reactores 1 y 5). Todos los demás reactores comprendieron una solución de reacción IVTT del 75% y un 25% de agua ultrapura (reactores 2 y 6) o plantillas de ADN lineal de 2,5 nM que codifican para la expresión de deGFP (reactores 3, 4, 7 y 8). En los cuatro reactores donde se añadió ADN, hay una clara expresión de DeGFP. Tres de los cuatro reactores proporcionan una intensidad de fluorescencia similar, con un reactor que muestra una menor señal de fluorescencia. Esto podría ser causado por una disparidad en el flujo que resulta en menos ADN que entra en el reactor, o debido a variaciones en las dimensiones del reactor. Después de 14 horas, se ve un aumento repentino en la señal de los reactores que contienen ADN. Esto es causado por una burbuja de aire que entra en la capa de flujo del dispositivo microfluídico, presumiblemente originada de una de las soluciones de entrada. La captura de aire en el dispositivo microfluídico limita significativamente el flujo de fluidos a través de los canales, por lo que no se pueden añadir o eliminar reactivos frescos de los reactores hasta que el aire haya pasado. Tras la reanudación del flujo, el experimento vuelve a su intensidad de fluorescencia anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivos suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos. 

Discussion

Se ha presentado un dispositivo microfluídico multicapa basado en PDMS y se ha demostrado su capacidad para mantener reacciones IVTT durante períodos prolongados de tiempo. Aunque es adecuada para este ejemplo específico, esta tecnología puede utilizarse para numerosas otras aplicaciones. El control adicional sobre el flujo de fluidos , junto con la capacidad de reponer continuamente los reactivos de reacción mientras se retiran (por)productos - es ideal para reacciones de síntesis continuas, la investigación de diversos comportamientos dinámicos y la conducción de múltiples variaciones de una sola reacción.

A pesar del proceso de fabricación relativamente sencillo de los dispositivos basados en PDMS, el uso de los mismos requiere una amplia configuración de hardware. Compuesto por matrices de válvulas, reguladores de presión, bombas de presión, incubadoras y unidades de refrigeración, la transición de la fabricación al uso no es elemental y requiere una inversión inicial significativa. Además, la capacidad de configurar y realizar experimentos exitosos con estos dispositivos de forma consistente requiere una inversión significativa en el tiempo; un punto que este manuscrito pretende abordar. Sin embargo, una vez en su lugar, toda la configuración se puede modificar para una gama de propósitos. Además, la configuración del hardware comprende numerosos elementos modulares, cada uno de los cuales se puede ampliar para permitir el empleo de diseños de dispositivos microfluídicos más complejos. Además, el diseño modular permite la sustitución de componentes de hardware por alternativas de funcionamiento similar, de modo que los usuarios no se limitan a la configuración específica descrita aquí^48,49.

La variabilidad entre dispositivos individuales y en las condiciones externas (como las fluctuaciones de presión) puede dar lugar a imprecisiones al realizar experimentos con estos dispositivos. Para abordar este problema, se debe realizar una calibración del sistema antes de cada experimento, proporcionando una relación de actualización única para cada uno de los reactores. Mientras que la calibración aborda las variaciones de dispositivo a dispositivo y experimento a experimento, es un proceso que consume mucho tiempo y no es impecable. Los fluidos con viscosidades diferentes no fluirán con la misma velocidad cuando se exponen a una presión idéntica, y como tal realizar la calibración con múltiples reactivos puede no producir relaciones de actualización idénticas. Este efecto se atenúa mediante el uso de tres canales de control para bombear peristálticamente los reactivos en el dispositivo microfluídico, en lugar de regular el flujo variando únicamente la presión suministrada. Como último recurso en los casos en que la disparidad en la viscosidad es muy grande, se puede implementar una relación de actualización única para cada reactivo individual mediante la realización de múltiples experimentos de calibración.

El uso de una bomba peristáltica para inyectar reactivos en el dispositivo microfluídico atenúa los efectos del uso de soluciones con diferentes viscosidades, sin embargo, también crea un problema secundario. El uso de pasos discretos para bombear fluidos en el dispositivo microfluídico, significa que la resolución de las inyecciones en un solo reactor, está limitada por el volumen inyectado al realizar un solo ciclo de bomba. Dentro de nuestra investigación, este valor - determinado durante la calibración - es aproximadamente igual al 1%, lo que indica que un solo ciclo de bomba desplaza aproximadamente el 1% del volumen del reactor (aproximadamente 0,1 nL). Como tal, el desplazamiento del 30% del volumen del reactor requiere la ejecución de 30 ciclos de bomba, con 23 ciclos de bomba de la solución de reacción IVTT que se añaden, y sólo 7 ciclos de bomba de ADN o agua ultrapura que se añaden. Aunque son suficientes para nuestra investigación, los protocolos experimentales alternativos pueden encontrar problemas al intentar agregar un mayor número de reactivos únicos, utilizar una fracciónde actualización más baja o agregar volúmenes más pequeños de un solo reactivo a un reactor. En tales casos, el diseño del dispositivo microfluídico se puede adaptar para proporcionar a los reactores un volumen mayor. Un ejemplo de ello se informa en Niederholtmeyer et al.³⁶.

Fundamentalmente, el dispositivo descrito dentro de este manuscrito permite que las reacciones se mantengan durante duraciones prolongadas, lo que resulta en tasas de transcripción y traducción en estado estacionario. Mediante la inyección periódica de nuevos reactivos en los reactores - y la eliminación de la reacción (por) productos - las reacciones son sostenidas y se pueden controlar comportamientos dinámicos complejos. De esta manera, se ha creado una plataforma que, hasta cierto punto, imita el entorno celular. Además, esta plataforma permite la exploración de la dinámica del sistema, adaptando el período entre las inyecciones y la composición específica de las inyecciones. Como resultado, estos dispositivos microfluídicos multicapa son una poderosa herramienta para la caracterización y optimización de nuevas redes sintéticas que muestran un comportamiento dinámico complejo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetona	VWR	20063.365
AZ 40 XT	Merck KGaA (Darmstadt, Alemania)	-	Fotorresistencia positiva
AZ 726 MIF Revelador Merck	KGaA (Darmstadt, Alemania)	-	Revelador fotorresistente positivo
isopropanol	Merck KGaA (Darmstadt, Alemania)	109634
Portaobjetos de microscopio	VWR	ECN 631-1550
mr Dev 600	Microresist Technology GmbH (Berlín, Alemania)	-	Revelador Negativo Fotorresistente Disipador
calor sin silicio Trabajos de grasa	Trabajos	CW7270	Compuesto térmico
Obleas de silicio	Materiales de silicona	-	< Orientación 1-0-0>, 100 mm de diámetro, 525 y micro; m espesor
SU-8 3050	Microchem Corp. (Newton, MA)	-	Negativo fotorresistente
Sylgard 184 Kit de elastómero (PDMS)	The Dow Chemical Company	01317318
tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silano	Sigma-Aldrich	448931-10G
Name	Company	Catalogo Número	Comentarios
>Equipo
entrada/salida digital	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-504	8x
Lente de cámara	The Imaging Source-Compression
fitting	Koolance, Inc.	FIT-V06X10	Racor para tubos de 6 mm de diámetro interior y 10 mm de diámetro exterior. 4x
Módulo final de controlador	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-600
Tubo de conexión de dispositivos	Saint-Gobain Performance Plastics	AAD04103	0,02" de diámetro interior, 0,06" de diámetro exterior, Tygon Tubing (ND-100-80)
Clavijas de conector de dispositivo	Unimed SA (Lausana, Suiza)	200.010-A	Tubo AISI 304, 0,35 mm de diámetro interior, 0,65 mm de diámetro exterior, 8 mm de largo
Controlador Ethernet	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-881
Conector de bus hembra	Encitech	DTCK15-DBS-K	Conector de bus hembra de 15 polos
Depósitos de fluidos	Fluigent	Fluiwell-4C
Sistema de presión Fluigent	MFCS-EZ	0 - 345 mbar
Hg lámpara de arco corto	Advanced Radiation Corporation	-	Placa calefactora de 350 W
Microscopio invertido
LabVIEW Software	de Greef Lab, Universidad Tecnológica de Eindhoven	https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
		LIQ-705CL-B
Talones Luer	Instech Laboratories, Inc.	LS23
Conectores Luer a lengüeta	Cole Parmer	45505-32	3/32" ID
Matlab Software	de Greef Lab, Universidad Tecnológica de Eindhoven
	La fuente de imagen	DMK 42AUC03
Cámara microscópica	Hamamatsu Photonics	OrcaFlash4.0 V2 ( C11440-22CU)
Agitador orbital	Cole Parmer	EW-513000-05
Horno	Thermo Scientific	Heraeus T6P 50045757
Plasma de oxígeno asher	Quorum Technologies	K1050X
Perforadora PDMS	SYNEO	Accu-Pucnh MP10
Tubo de PEEK	Trajan	1301005001-5F	0.005" ID, 1/32" OD, Rojo
Elemento Peltier	Termodinámica Europea	APH-127-10-25-S
Controlador de temperatura Peltier	Warner Instruments	CL-100
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	-Diseño de
fotomáscara	Maerkl Lab, EPFL	https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Matriz de válvulas neumáticas	FESTO-1x		22 juntas de válvulas y 1x 8 válvulas, válvulas normalmente cerradas.
Adaptador de corriente	Koolance, Inc.	ADT-EX004S Adaptador de	corriente de CA de 110/220 V
Tubo de PTFE	Cole Parmer	06417-21	#24 AWG Clavija de perforación de PTFE de pared delgada
	SYNEO	CR0320245N21R4	OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
Tubería de PVC	Koolance, Inc.	HOS-06CL	6 mm ID, 10 mm OD
Cuchillas de un solo filo	GEM	Scientific-Tubo
blando	Fluigent-Suministrado		con depósitos de fluido. (1 mm de diámetro interior, 3 mm de diámetro exterior)
Barnizadora de centrifugación	Laurell Technologies Corporation	WS-650MZ-23NPPB
Microscopio estereoscópico	Olympus Corporation	SZ61
Cable de termistor	Warner Instruments	TA-29	termistor de perlas
	AMM, EE. UU.-	exposición a los rayos UV cercanos, 350 W	de
vacío	Vacuumbrand GmbH	MD1C
Bloque de placa fría refrigerado por agua	Koolance, Inc.	PLT-UN40F Enfriador
agua	Koolance, Inc.	EX2-755
Báscula de pesaje	Sartorius	M-prove