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Neuroscience

Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59692
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory for Neural Circuit Systems, Institute of Neuroscience, Tokushima Bunri University

Summary

Introducimos un método de grabación óptica reproducible y estable para las rebanadas cerebrales utilizando tinte sensible al voltaje. El artículo describe la tinción de tinte sensible al voltaje y el registro de señales ópticas utilizando preparaciones convencionales de corte de hipocampo.

Abstract

La imagen de tinte sensible al voltaje de fotón (VSD) de campo ancho de las preparaciones de corte cerebral es una herramienta útil para evaluar la conectividad funcional en circuitos neuronales. Debido al cambio fraccionario en la señal de luz, ha sido difícil utilizar este método como un ensayo cuantitativo. En este artículo se describen los sistemas especiales de manipulación de equipos ópticos y de corte, que hacen que esta técnica sea estable y confiable. El presente artículo muestra en detalle el manejo de las rebanadas, la tinción y el registro de las rebanadas de hipocampo teñidas con VSD. El sistema mantiene las condiciones fisiológicas durante mucho tiempo, con buena tinción, y evita los movimientos mecánicos de la rebanada durante las grabaciones. Además, permite la tinción de rodajas con una pequeña cantidad del tinte. La óptica logra una alta apertura numérica con bajo aumento, lo que permite la grabación de la señal VSD a la velocidad de fotogramas máxima de 10 kHz, con resolución espacial de 100 píxeles x 100 píxeles. Debido a la alta velocidad de fotogramas y la resolución espacial, esta técnica permite la aplicación de los filtros posteriores a la grabación que proporcionan una relación señal-ruido suficiente para evaluar los cambios en los circuitos neuronales.

Introduction

La imagen de tinte sensible al voltaje de fotones de campo ancho (VSD) de preparaciones de rebanadas cerebrales teñidas a granel se ha convertido en una herramienta cuantitativa útil para evaluar la dinámica de los circuitos neuronales1,2,3,4 . Después del análisis de los cambios en las propiedades ópticas debido a la excitación de la membrana5,6,7, imágenes VSD fue descrito por primera vez a principios de la década de 1970 por Cohen y otros6,8, 9. ; es un método adecuado para monitorear las funciones cerebrales en tiempo real, ya que el tinte sondea directamente los cambios potenciales de la membrana (es decir, la señal primaria de las neuronas).

Los primeros VSD poseían las características deseables para entender el sistema cerebral, como una rápida constante en el tiempo para seguir la rápida cinética de los eventos potenciales de la membrana neuronal, y la linealidad con el cambio en el potencial de membrana9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Al igual que otros experimentos de imágenes, esta técnica requiere una amplia gama de ajustes específicos, como las cámaras, óptica, software y fisiología de la rebanada, para lograr los resultados deseados. Debido a estos escollos técnicos, los beneficios esperados durante los esfuerzos iniciales no necesariamente se materializaron para la mayoría de los laboratorios que no se especializaron en esta técnica.

La causa primaria de la dificultad técnica fue la baja sensibilidad del VSD hacia el cambio potencial de membrana cuando se aplica a la tinción a granel de preparaciones de rodajas. La magnitud de la señal óptica (es decir, el cambio fraccionario en fluorescencia) es generalmente 10-4-10-3 de la señal de control (F0) en condiciones fisiológicas. La escala de tiempo del cambio potencial de membrana en una neurona es de aproximadamente milisegundos a pocos cientos de milisegundos. Para medir los cambios en el potencial de membrana de la neurona, la cámara que se utiliza para la grabación debe ser capaz de adquirir imágenes a alta velocidad (10 kHz a 100 Hz). La baja sensibilidad de VSD y la velocidad necesaria para seguir la señal neuronal requiere una gran cantidad de luz para ser recogido en la cámara a alta velocidad, con una alta relación señal-ruido (S/N)2,16.

La óptica del sistema de grabación también es un elemento crítico para garantizar la recopilación de luz suficiente y para mejorar S/N. El aumento logrado por la óptica es a menudo excesivamente bajo, como 1X a 10X, para visualizar un circuito neural funcional local. Por ejemplo, para visualizar la dinámica del circuito hipocampal, un aumento de aproximadamente 5 sería adecuado. Dicho bajo aumento tiene baja eficiencia de fluorescencia; por lo tanto, la óptica avanzada sería beneficiosa para dicha grabación.

Además, la fisiología de las rebanadas también es esencial. Dado que el análisis de imágenes requiere que los sectores estén intactos, se necesita un manejo cuidadoso de las rebanadas17. Además, las medidas adoptadas para mantener la viabilidad de las rebanadas durante más tiempo son importantes18.

En el presente artículo se describe el protocolo para la preparación de rodajas, tinción VSD y mediciones. El artículo también describe las mejoras en los VSD, el dispositivo de imagen y la óptica, y otros refinamientos adicionales al sistema experimental que han permitido que este método se utilice como un ensayo sencillo, potente y cuantitativo para visualizar el modificación de las funciones cerebrales19,20,21,22,23,24,25. La técnica también puede ser ampliamente utilizada para la potenciación a largo plazo en el área CA1 de las rodajas de hipocampo1. Además, esta técnica también es útil en la grabación óptica de potenciales de membrana en una sola célula nerviosa26.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Tokushima Bunri. El siguiente protocolo para la preparación de sectores es casi un procedimiento estándar27, pero las modificaciones han sido los protocolos de tinción y grabación con VSD.

1. Preparación Antes del día del experimento

  1. Preparar el stock A (Tabla 1), stock B (Tabla 2), y stock C (Tabla3) soluciones y almacenar en un refrigerador.
  2. Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Tabla4, ver paso 3) y guardarlo en el refrigerador.
  3. Prepare 1 L de ACSF modificado (Tabla5)y guárdelo en el refrigerador.
  4. Dispensar alícuotas de suero bovino fetal (FBS) de 500 ml en viales de 2 ml y almacenarlas en un congelador.
  5. Disolver el 4% del agar en polvo en ACSF (ca. 120 ml) en un microondas y verterlo en un plato Petri desechable de 90 mm. La placa de agar debe refrigerarse antes de su uso posterior.
  6. Coloque los siguientes elementos en un congelador el día anterior al experimento: una bandeja quirúrgica, un recipiente de rebanadora y un bloque de enfriamiento de aluminio (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Asegúrese de que haya suficientes anillos de plexiglás con filtros de membrana para el sistema de manipulación de rodajas17,28 (ver paso 6.12).
  8. Disolver el 2% del agar en polvo en 50 ml de 3 M KCl en un microondas. Tomar alrededor de 85 l del disuelto de agar-KCl caliente en puntas de 200 ml utilizando un micropipeta para el electrodo de puesta a tierra. Separe la punta en el gel de agar todavía caliente de 3 M KCl. Repita el paso para llenar alrededor de 20-40 consejos con 2% de agar.

2. Preparación de la solución de stock VSD (di-4-ANEPPS)

  1. Prepare 1 ml de 10% de solución de aceite de ricino polioxilado con agua ultrapura.
  2. Añadir 1 ml de etanol a un vial de di-4-ANEPPS (vial de 5 mg), vórtice y sonicato durante 10 min. La solución se convertirá en un color rojo intenso con posibles pequeños residuos de los cristales di-4-ANEPPS.
    NOTA: El etanol utilizado en este paso debe estar recién abierto.
  3. Transfiera la solución a un microtubo de 2 ml con una tórica. Gire hacia abajo la solución y agregue 500 sl de 10% de solución de aceite de ricino polietoxilado.
    NOTA: El tinte es altamente lipofílico. DMSO y poloxámero también se pueden utilizar para disolver di-4-ANEPPS pero en términos de la señal óptica tras el cambio en el potencial de la membrana, encontramos que el uso de etanol -aceite de ricino polietoxilado da una mejor relación señal-ruido. Esto podría estar relacionado con la tasa de transferencia de disolvente a la membrana celular.
  4. Vórtice y sonicar hasta que el tinte se haya disuelto por completo.
  5. Evite la exposición a la luz y guárdela en un refrigerador. No almacenar en un congelador. Las acciones pueden durar unos meses.
    NOTA: El día del experimento, siga los pasos 3-9.

3. Preparación diaria de ACSF (1 L) (Tabla 4)

  1. Pesar NaCl, NaHCO3y glucosa en un matraz.
  2. Añadir 950 ml de agua destilada al matraz y empezar a burbujear con 95% O2/5% CO2 gas.
  3. Añadir 2,5 ml de stock Una solución al matraz e incubar durante aproximadamente 10 min a temperatura ambiente.
  4. Añadir 2,5 ml de solución c de stock al matraz.
  5. Añadir agua destilada para hacer la solución a 1 L.

4. Preparación diaria de la solución VSD de tinción

  1. Sonicar un vial de 500 l de solución de material DE FBS y VSD (paso 2) en un ultra-sonicador durante 5 min.
  2. Añadir 500 ml de ACSF recién preparado en el vial de FBS.
  3. Añadir al vial 20 (en caso de ratones) o 40 (en caso de ratas) de solución en stock de VSD.
  4. Ultra-sonicado y vórtice el vial hasta que la solución se vuelva naranja pálido.

5. Preparación para la cirugía

  1. Tome 100 ml de ACSF refrigerado por separado en un recipiente de acero inoxidable de 300 ml, un vaso de precipitados de 300 ml y un recipiente de plástico, y colóquelos en un congelador. Vierta 150 ml de ACSFmodificado refrigerado (Tabla 2) en otro vaso de precipitados y colóquelo en el congelador. Espere hasta que las soluciones se enfríen; el tiempo que se toma debe medirse y determinarse de antemano.
  2. Doblar para romper una cuchilla de afeitar (acero al carbono, grado industrial de 0,13 mm de espesor, hoja en ambos lados) en la mitad para la cortadora.
    NOTA: La otra mitad se puede utilizar para la disección con un portacuchillas adecuado.
  3. Prepare un bloque de la placa de agar ACSF 4% con una plantilla de ajuste (Figura1).
  4. Preparar una cámara de incubación húmeda (una cámara de tipo interfaz; una caja sellada apretada de 1,2 L modificada con un empaque de silicona) para mantener las rodajas cerebrales fisiológicamente vivas (Figura2); añadir ACSF en un recipiente pequeño y carbonato con 95% O2/5% CO2 gas, y llenar una placa Petri de 90 mm x 20 mm con ACSF en la parte superior.
    NOTA: Se debe colocar una placa Petri más pequeña (60 mm x 20 mm) en el centro de la placa de 90 mm para apoyar un papel de filtro en el plato.
  5. Ponga la caja en un dispositivo de calefacción y espere 20 minutos para calentarla hasta 28 oC.
  6. Agregue hielo triturado en el recipiente de la cortadora. Coloque los siguientes instrumentos en una cuba de acero inoxidable (pequeña) sobre hielo: bisturí, portacuchillas, pinzas de anillo, bloque de agar y una etapa de cortadora. Mantenga el ACSF congelado y el ACSF modificado sobre hielo y burbuja con 95% O2/5% CO2 gas (también conocido como carbogen).
  7. Coloque los siguientes instrumentos en una tina (grande): tijeras (grandes, pequeñas), pinzas, una espátula, una cuchara y alicates diagonales.

6. Cirugía (Mice)

  1. Anestetizar el ratón usando isoflurano en una campana de humo. Evalúe el nivel de la anestesia comprobando el reflejo del pedal del animal al pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día.
  2. Descapita el ratón y sumerja la cabeza en ACSF helado en una bandeja quirúrgica de acero inoxidable.
  3. Extraiga el cerebro en 1 min y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga ACSF refrigerado durante 5 min.
  4. Saca el cerebro del vaso de precipitados y, con un bisturí, recorta el bloqueo cerebral (Figura3A).
  5. Coloque el bloqueo cerebral en un bloque de agar 4% (paso 5.3, Figura 3B). Ambos hemisferios se pueden montar en un bloque de agar. Limpie el exceso de ACSF del bloque con un papel de filtro.
  6. Aplique adhesivo fino (súper pegamento) a la mesa de corte. Coloque el bloque de agar sobre él y limpie el exceso de adhesivo con un papel de filtro.
  7. Aplica suavemente una pequeña cantidad de ACSF helado (5 ml) usando una pipeta de la parte superior del bloque cerebro-agar. Esto ayudará a solidificar el exceso de súper pegamento y evitar que el pegamento cubra el cerebro y perdor el corte.
  8. Fije la tabla de segmentación de datos a la bandeja de segmentación de datos (figura3C)y vierta el ACSF modificado.
  9. Ajuste la cortadora a una velocidad lenta, con la frecuencia de la hoja al máximo.
  10. Establezca el espesor de la rebanada en 350-400 m y comience a cortar (Figura3C). Coloque los sectores en la esquina de la bandeja de cortes en una secuencia, de modo que la profundidad de las rebanadas se pueda distinguir fácilmente. Por lo general, se pueden obtener de tres a cinco rebanadas de un hemisferio.
  11. Cortar la porción del tronco cerebral usando una aguja de 30 G (Figura 3D).
    NOTA: La microcirugía en la rebanada cerebral, como un corte entre el borde CA3-CA1, debe realizarse en esta etapa bajo un microscopio binocular, si es necesario.
  12. Usando un cepillo de pintura con punta pequeña, coloque la rebanada en el centro del filtro de membrana (0,45 mm de poros, membrana de PTFE, diámetro de 13 mm) sujeta con el anillo de plexiglás17 (15 mm de diámetro exterior, 11 mm de diámetro interior, 1 mm de espesor, Figura 3E). Coloque el anillo en la cámara de recuperación húmeda (Figura2) y fije la cubierta para mantener la presión interna alta.
    NOTA: Las rodajas se pegarán a la membrana dentro de 30 minutos y se pueden manejar con los anillos en los pasos posteriores en la cámara de grabación. No hay necesidad de utilizar pesas u otras medidas para mantener la rebanada en su lugar.
  13. Ajuste la dirección y la posición de la rebanada en el anillo para asegurarse de que está bien centrada y tiene una dirección coherente (consulte el paso 9.3).
  14. Dejar la muestra a 28oC durante 30 min, y luego a temperatura ambiente durante al menos 10 a 30 min para la recuperación de rodajas.
    NOTA: Las rodajas ahora pueden conservar una buena condición fisiológica al menos durante 15 h.

7. Manchado y enjuado de las rebanadas (Mice)

  1. Aplique suavemente 100-110 l de la solución de tinción (Paso 4) en cada rebanada del anillo utilizando un micropipeta. Ocho a nueve rodajas se pueden teñir con una solución de tinción preparada en el paso 4. Deje las rodajas durante 20 minutos para la tinción.
  2. Preparar 50-100 ml de ACSF en un recipiente y poner el anillo con muestra en rodajas en él para enjuagar la solución de tinción.
  3. Guarde la rebanada enjuagada en otra cámara de incubación. Espere más de 1 h para la recuperación antes del experimento.
    NOTA: La cámara de incubación se puede separar del gas y trasladarse al lugar de grabación en condiciones herméticas y selladas. La rebanada puede permanecer viva durante al menos 20 minutos sin suministro de gas. Esto es útil en caso de que necesite mover el sector a otro lugar para la grabación.

8. Preparación diaria del Aparato Experimental

  1. Encienda el amplificador, el ordenador y el sistema de cámara, y compruebe que el software se está ejecutando.
  2. Coloque ACSF en un tubo de 50 ml y burbuja con carbogen.
  3. Utilice una bomba peristáltica para hacer circular el ACSF. Ajuste el caudal a aproximadamente 1 ml/min.
  4. Ajuste la altura de la pipeta de aspiración para que el nivel de líquido dentro de la cámara de experimento sea siempre constante.
    NOTA: El nivel de la solución es importante para obtener un registro estable, por lo tanto, el ajuste debe realizarse utilizando un micromanipulador.
  5. Instale el electrodo de tierra compuesto de viruta amarilla llena de agar 3 M KCl (2%) (paso 1.8) en un soporte con un cable Ag-AgCl con una pequeña cantidad de solución KCl de 3 M.
  6. Llene una pequeña cantidad de ACSF (aproximadamente dos tercios del volumen) en el electrodo de vidrio (1 mm de diámetro exterior, 0,78 mm de diámetro interno tirado con un tirador de micropipeta) usando una punta amarilla de entubada delgada cónica y colóquela en el soporte del electrodo.
  7. Fije el soporte a la varilla instalada en el manipulador. Asegúrese de que el uso de un amplificador de resistencia al electrodo es de aproximadamente 1 M.
    NOTA: El electrodo de tipo parche de apertura ancha de vástago largo (4-8 m de apertura) debe ser bueno para la grabación de campo y como un electrodo estimulante.

9. Inicio de una sesión de grabación

  1. Tome una preparación de rodajas de la cámara húmeda con fórceps.
  2. Coloque rápidamente la rebanada en una cámara experimental bajo el microscopio (Figura4).
  3. Empuje el borde del anillo firmemente en la junta tórica de silicona. Tenga cuidado de no romper la membrana o la parte inferior de la cámara del experimento.
    NOTA: La dirección de la rebanada debe tenerse en cuenta con respecto a la dirección de los electrodos estimulantes y de grabación en el campo de visión. La rebanada saludable debe adherirse al filtro de membrana por lo que no hay necesidad de utilizar otros dispositivos para fijar las rebanadas tales como pesas y mallas de nylon.
  4. Coloque la punta del electrodo estimulante y el electrodo de registro potencial de campo en la rebanada bajo el microscopio con luz transmitida.
  5. Utilice el sistema de grabación electrofisiológica para comprobar la respuesta. Confirme el registro electrofisiológico habitual (no manchado) con una configuración determinada.
    NOTA: El electrodo de grabación se puede omitir, pero es útil para comprobar la fisiología de la rebanada.
  6. Ajuste la intensidad de la luz de excitación a aproximadamente el 70-80% de la capacidad máxima en la cámara que corresponde a 13-15 mW/cm2 en la muestra al tomar muestras a 10 kHz con lente objetivo de inmersión en agua 5x y 1lente de tubo PLAN APO. La longitud de onda de la luz de excitación es de 530 nm, y el filtro de emisión debe ser > 590 nm.
    NOTA: Utilice un obturador para minimizar la cantidad de luz de excitación. La exposición continua a la luz puede deteriorar la fisiología de las rebanadas. El posible efecto nocivo de la luz depende de la intensidad y duración de la luz. Utilice el registro electrofisiológico para juzgar el efecto de la luz. En caso de la resistencia de 13-15 mW/cm2, aproximadamente 1 s de exposición debe ser el límite superior de la tolerancia.
  7. Ajuste el enfoque con el sistema de adquisición utilizando la fuente de luz fluorescente porque el enfoque puede ser diferente dependiendo de la longitud de onda e iniciar la adquisición.
  8. Examine los datos en un software de adquisición de imágenes.
    NOTA: Utilizamos el paquete original de microprogramación de software de análisis numérico para el análisis detallado.

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Representative Results

La Figura 5 muestra la señal óptica representativa tras la estimulación eléctrica de la garantía de Schaffer en el área CA1 de una rebanada de hipocampo de ratón. Las imágenes consecutivas en la Figura 5A muestran la señal óptica antes de que se aplicaran filtros espaciales y temporales, mientras que la Figura 5B muestra los mismos datos después de aplicar un filtro cúbico de 5 x 5 x 5 (una convolución del núcleo gaussiano, 5 x 5 espacial- y 5 a temporal) dos veces. Debido a la alta velocidad de fotogramas (0,1 ms/frame) y la alta resolución espacial (100 píxeles x 100 píxeles), la aplicación del filtro no cambió la señal, sino que filtró el ruido, que también se puede observar en el curso de tiempo registrado en píxeles en una sola prueba ( Figura 5C, sin filtro; Figura 5D, con filtro; y Figura 5E,superpuesta).

La Figura 6 compara la respuesta típica en el área CA1 de un sector hipocampal entre el ratón (Figura6A)y la rata (Figura 6B). Como es evidente en la figura, la respuesta hiperpolarizadora debido a los insumos inhibitorios es evidente en la rebanada del hipocampo de rata al aplicar el mismo estímulo a la garantía de Schaffer cerca de la frontera CA1/CA3. La pequeña respuesta hiperpolarizante se observa en el lado distal de la CA1 después de 24 ms en la rebanada del hipocampo del ratón, pero una respuesta hiperpolarizante más masiva superó la respuesta despolarizante en la rebanada del hipocampo de la rata. Las imágenes DESV pueden demostrar claramente la diferencia entre las rodajas de ratón y rata hipocampal.

Figure 1
Figura 1 : Una ilustración del bloque de agar utilizado para montar tejido cerebral para cortar y una plantilla para hacer el bloque. (A) Ilustración esquemática del bloque cerebral y del bloque de agar 4% (B). (C, D) Fotografía de una plantilla ajustable hecha por una placa de plexiglás (5 mm de espesor cada una) para hacer el bloque de agar. Al preparar el bloque de agar, las placas superior e inferior deben apilarse como se muestra en D. (E) Al insertar una hoja en las ranuras largas y delgadas (1) y (2), la parte triangular se corta, la ranura (3) se utiliza para recortar toda la profundidad del bloque. (4) La extracción de la placa superior permite cortar las piezas no necesarias. Usando la ranura 1 y 2, haga sólo 5 mm de cortes profundos para que el bloque resultante sea como se muestra en (A) y (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Ilustración de la cámara de incubación de tipo interfaz utilizada para mantener la fisiología de las rebanadas. (A) Visión general del sistema. (B) Detalles interiores. ( C) Ilustración de la cámara de recuperación. El espécimen debe colocarse sobre un papel de filtro colocado en una placa Petri de 90 mm y 60 mm llena de ACSF. Este último plato es apoyar el papel de filtro. Los platos y el recipiente burbujeante ACSF se mantienen en su lugar con un plato de plexiglás. El papel de filtro no debe tocar la pared de la caja hermética ni el recipiente. El aire se suministra a través de una botella burbujeante que incorpora gases humedecidos en la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Preparaciones de rodajas hipocampales de un cerebro de ratón. (A) El cerebro aislado del ratón debe cortarse primero en la línea discontinua (a), luego en b). Finalmente, el corte debe hacerse a lo largo de la línea (c). El corte debe ser perpendicular a la parte inferior. (B) El bloque cerebral debe montarse en un bloque de agar. (C) El bloque de agar debe colocarse en la cortadora. (D) Corte resultante. El exceso de tejido debe cortarse en la línea discontinua. (E) La rebanada debe colocarse en el centro del filtro de membrana con un soporte de plexiglás (diámetro exterior 15 mm, diámetro interior 11 mm, el filtro de membrana PTFE de 13 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Sistema de grabación de señales ópticas de preparaciones de sectores. (A) Una fotografía del microscopio utilizada para tomar imágenes de las rebanadas del manuscrito actual. La óptica consiste en una lente objetivo (5x NA0.60), una caja de espejo para filtro dicroico (580 nm) y una lente de proyección (tubo) (PLAN APO x1.0). Una cámara de alta velocidad se conecta en la parte superior de la lente de proyección a través de un montaje en C. Hay otra cámara USB habitual para la observación. La luz de excitación se introduce utilizando fibra óptica. (B) Fotografía de las lentes compatibles con la caja de espejo. (C) Diagrama esquemático del sistema de grabación. El sistema de imágenes y el sistema de grabación electrofisiológica son controlados por un PC. El sistema de iluminación LED con un sistema de control de retroalimentación de fotodiodo se utilizó como fuente de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Señal óptica representativa en el área CA1 de una rebanada de hipocampo de ratón en un solo ensayo. (A) Las imágenes consecutivas muestran la propagación de la señal neuronal adquirida a una velocidad de fotogramas de 0,1 ms/frame a lo largo de la vía colateral de Schaffer antes de aplicar cualquier filtro espacial y temporal (cada 0,2 ms). La excitación fue de 530 nm y la emisión fue >590 nm. (B) Los mismos datos después de una aplicación de un núcleo gaussiano tridimensional de 5 x 5 x 5 dos veces. (C, D) Las trazas de señales ópticas en los píxeles representativos [cada dos píxeles (36 m) a lo largo de una línea en el centro de la CA1 se muestran en el cuadrado en A, * denota el píxel en la pirámide de estrato] de los datos mostrados en A y B. (E) La señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta de la señal superpuesta señales ópticas en C y D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Comparación de la señal óptica entre las rodajas de ratón y la rata del hipocampo. Las imágenes consecutivas representativas sobre la estimulación eléctrica de la vía colateral Schaffer cerca del borde CA3/CA1 de un ratón (A) y la rebanada del hipocampo de la rata (B). El video 1 muestra la rebanada del hipocampo del ratón y el video 2 muestra la rebanada del hipocampo de la rata. El curso de tiempo de la señal óptica en el medio del CA1 en el estrato piramidal (st. pyr.) y el estrato radiatum (st. rad.) se muestra a la derecha de la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Final mM Peso
NaH2PO4 • 2H2O 1,25 mM 3.90 g
MgSO4•7H2O 2 mM 9,86 g
Kcl 2,5 mM 3,73 g
Añadir H2O para hacer 50 mL

Tabla 1: Stock A.

Final mM Peso
MgSO4•7H2O 2 mM 12.32 g
Añadir H2O para hacer 50 mL

Tabla 2: Stock B.

Final mM Peso
CaCl2•2H2O 2 mM 5,88 g
Añadir H2O para hacer 50 mL

Tabla 3: Stock C.

Final (mM) Peso
Nacl 124 mM 7.25 g
NaHCO3 26 mM 2.18 g
Glucosa 10 mM 1,8 g
Stock A 2,5 ml
Añadir unos 950 ml de H2O y burbuja con gas mezclado (95 % O2/5 % CO2) (10 min)
Stock C (CaCl2) 2 mM 2,5 ml
Añadir H2O para hacer 1.000 mL

Tabla 4: Preparación diaria de ACSF.

Final (mM) Peso
NaHCO3 26 mM 2.18 g
Sacarosa 205,35 mM 70.29 g
Glucosa 10 mM 1,8 g
Stock A 2,5 ml
Stock B 2,0 ml
Añadir unos 900 ml de H2O y burbuja con gas mezclado (95 % O2/5% CO2) (10 min)
Stock C 0,4 mM 0,5 ml
Añadir H2O para hacer 1.000 mL

Tabla 5: ACSF modificado (solución de corte).

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Discussion

La fisiología de la rebanada es vital para recoger la señal correcta. El uso del sistema de filtro de anillo-membrana en este protocolo garantiza quela rebanada permanezca sana y sin distorsión durante todo el procedimiento 2,16,17. Otros sistemas se pueden utilizar para retener la fisiología de las rebanadas durante la grabación, pero la rebanada no debe deformarse en ningún momento, ya que la imagen necesita que cada parte de la rebanada esté sana. El sistema de filtro de anillo-membrana también es mejor para la tinción, ya que esto nos ayuda a minimizar el volumen de la solución de tinción requerida. También es importante controlar la intensidad de la luz de excitación, ya que debe ser baja con respecto a la fracción de tiempo. La iluminación continua puede dañar la muestra; por lo tanto, es necesario un uso adecuado del obturador.

La toxicidad del VSD se ha discutido a menudo29, pero es el resultado de la multiplicación no lineal de la concentración de tinte, la intensidad de la luz de excitación, y la duración de la exposición a la luz. El procedimiento de tinción mostrado en este protocolo no causó ningún cambio medible en los parámetros fisiológicos de la rebanada, como las relaciones de entrada-salida de las grabaciones de campo potencial y las de la potenciación a largo plazo (LTP), pulso emparejado facilitación (PPF). El deterioro de la fisiología de la rebanada es considerable especialmente bajo iluminación continua16,pero se puede manejar mediante el seguimiento del potencial de campo. Mediante el uso de estas precauciones, podemos grabar LTP con grabación óptica continua utilizando VSD para más de 12 h24, que es comparable a los experimentos in vitro mejor acondicionados.

Durante la grabación, la mesa de aire puede ser útil, pero se debe permitir el aislamiento de otros dispositivos debido al bajo aumento de la óptica. Sin embargo, las perturbaciones mecánicas son una de las causas significativas detrás de la mala imagen. Si la cantidad considerable de señal falsa en la imagen consiste en signos opuestos en el borde del objeto, por lo tanto la diferencia del brillo, es la más probablemente causada por las perturbaciones mecánicas. Los movimientos de la muestra y el fluido son las causas más frecuentes de ruido de movimiento, y por lo tanto, deben evitarse o minimalizarse.

La señal VSD (cambio fraccionario en la intensidad de la luz) es pequeña (10-3 a 10-4 de la fluorescencia inicial). Para detectar un cambio tan pequeño, la fluorescencia debe exceder de 105 a 106 fotones en el detector en la fracción de tiempo para superar el efecto del ruido de fotones. Además, para seguir la actividad neuronal, la velocidad de fotogramas debe ser rápida, cerca de las constantes de tiempo necesarias para realizar grabaciones electrofisiológicas como la de alrededor del rango de kHz. Una combinación de estas dos condiciones requiere la cantidad de fluorescencia que es mucho más extensa que otros tipos de imágenes fluorescentes. Esto requiere una alta apertura numérica en toda la óptica, y el microscopio habitual no es la mejor opción. Se necesitan una pupila y una abertura más grandes, como se muestra en la Figura4.

El sistema de recodificación debe coincidir con la mayor profundidad del pozo de fotones, velocidad de fotogramas rápida y bajo nivel de ruido. La elección depende principalmente de la velocidad del sistema neural. La señal más rápida, como la transducción de señal hipocampal, necesita un sistema especializado de bajo ruido y ultrarrápido. Sin embargo, la señal lenta, como la lenta propagación de la actividad en los cortices, podría detectarse utilizando las cámaras de grado habitualpero científico.

La selección de la fuente de luz también es crítica. La elección de la luz depende de su intensidad, estabilidad y el área de iluminación. En el caso de las imágenes de campo ancho de baja ampliación, la fuente de luz puntual, como los arcos y los láseres, debe expandirse, lo que dificulta el uso de estas fuentes. Los arcos, como el mercurio y las lámparas de xenón, son la fuente de luz brillante, pero por lo general no son estables. Sin embargo, el reciente desarrollo de la luz de xenón podría superar el problema. La lámpara halógena es estable y tiene un área más grande de filamento que puede coincidir fácilmente con imágenes de campo ancho, pero está limitada en la resistencia especialmente a 530 nm. El reciente desarrollo de LED de potencia nos ha permitido utilizarlo como la fuente de luz potencial, pero debe tener el estabilizador de retroalimentación debido a la dependencia de la temperatura. Se pueden utilizar láseres, pero la alta coherencia da lugar a un ruido moteado, que suele ser inaceptable para las imágenes de campo ancho.

El protocolo de imágenes VSD presentado en este artículo mide un valor relativo a la condición de reposo. La medición absoluta del potencial de membrana no se puede realizar utilizando la técnica actual. Las mediciones de duración de imágenes y fluorescencia ratiométricas se pueden utilizar para evaluar los potenciales absolutos de la membrana.

La toma de imágenes de las rebanadas cerebrales teñidas a granel con VSD con bajo aumento puede demostrar los cambios potenciales de la membrana del subumbral en las interacciones de microcircuitos del cerebro. Tal alcance funcional con respecto a la conexión entre el microcircuito en la resolución en tiempo real será útil en muchas áreas de la investigación cerebral, especialmente para analizar los aspectos patológicos más probables causados por tales funciones excitatorias e inhibitorias conexiones entre diferentes áreas cerebrales. Esta aplicación será fundamental para investigar los cambios en los circuitos neuronales relacionados con ciertos tipos de enfermedades neuropsiquiátricas30,31,32.

El desarrollo del indicador de voltaje codificado genéticamente33,34 es la dirección futura para las grabaciones potenciales de membrana óptica que allanarán el camino para las aplicaciones atractivas del análisis específico del tipo de célula de las eventos a nivel de circuito.

Hay mucho margen de mejora en la óptica, especialmente para visualizar las conexiones funcionales de campo ancho. Nuestra novedosa óptica confocal35 permitirá la grabación de alta velocidad y alta relación S/N de la señal VSD.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

TT recibió la Beca JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 y JP15K00413) de MEXT y subvenciones del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] y H30 [18062156]). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM - Ultima Imaging system
High speed image acquisition system Brainvision co. Ltd. MiCAM 02 Imaging system
Macroscepe for wide field imaging Brainvision co. Ltd. THT macroscope macroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer Brainvision co. Ltd. LEX-2G LED illumination
Image acquisition software Brainvision co. Ltd. BV-ana image acquisition software
Multifunctional electric stimulator Brainvision co. Ltd. ESTM-8 Stimulus isolator+AD/DA converter
Slicer Leica VT-1200S slicer
Slicer Leica VT-1000 slicer
Blade for slicer Feather Safety Razor Co., Ltd. #99027 carbon steel razor blade
Membrane filter for slice support Merk Millipore Ltd., MA, USA Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, membrane filter/0.45 13
Numerical analysis software Wavemetrics Inc., OR, USA IgorPro analysing software
Stimulation isolator WPI Inc. A395 Stimulus isolator
AD/DA converter Instrutech ITC-18 AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA catalog number: D-1199 VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Pluronic F-127 P30000MP poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oil Sigma-Aldrich Cremophor EL C5135 polyethoxylated castor oil

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References

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Tominaga, Y., Taketoshi, M., Maeda, N., Tominaga, T. Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye. J. Vis. Exp. (148), e59692, doi:10.3791/59692 (2019).

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