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Neuroscience

तंत्रिका टर्मिनलों पर Synaptic आशय वितरण के Ultraस्ट्रक्चरल Morphometric विश्लेषण के लिए नवजात चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59694
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Anesthesiology, University of Virginia Health System, 2Department of Anesthesiology, Universita' degli Studi di Padova

Summary

हम तंत्रिका टर्मिनलों पर synaptic आशय वितरण के morphometric विश्लेषण के लिए उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए नवजात चूहे मस्तिष्क ऊतक प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । इन पद्धतियों के साथ प्राप्त माइक्रोग्राफ भी अन्य सेलुलर घटकों की एक संख्या की आकृति विज्ञान और उनके आयामी संरचनात्मक संबंधों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

हमारी प्रयोगशाला और कई दूसरों के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की आकृति विज्ञान और synaptic vesicles के स्थानिक संगठन का अध्ययन करने के उच्च समाधान शक्ति का दोहन किया है । आदेश में उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कि पूर्व synaptic आशय वितरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार की डिग्री उपज सकते है प्राप्त करने के लिए, इष्टतम नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है । रासायनिक स्थिरीकरण नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में पहला कदम है, और अति महत्वपूर्ण ultrastructure को संरक्षित करने के लिए । एक ग्लूटाल्डिहाइड-फॉर्मलेडिहाइड विलयन के साथ संवहनी स्थिरीकरण, जिसके बाद वाइटोसोम-sectioned नमूनों के साथ आज़मियम tetroxide, अणुओं की अधिकतम संख्या को स्थिर, विशेष रूप से प्रोटीन और lipids, और बेहतर संरक्षण में परिणाम परासंरचना का । ऊतक तो counterstaining, अनुक्रमिक निर्जलीकरण और राल-embedding के साथ संसाधित है । En ब्लॉक यूरेनिल एसीटेट के साथ धुंधला (अर्थात, राल embedding से पहले vibratome-sectioned ऊतक के धुंधला) अंतर्जात कंट्रास्ट को बढ़ाता है और नमूना प्रसंस्करण के दौरान निष्कर्षण के खिलाफ सेल घटकों स्थिर । कंट्रास्ट को अल्ट्राथिन सेक्शनों पर एक के बाद एक दाग के रूप में यूरेनिल एसीटेट लगाने से और अधिक बढ़ाया जा सकता है । यूरेनिल एसीटेट उपचार के बाद सीसे साइट्रेट के साथ ultrathin वर्गों के डबल धुंधला हो जाना भी छवि संकल्प में सुधार, इलेक्ट्रॉन-न्यूक्लीय एसिड युक्त संरचनाओं के लिए नेतृत्व की चयनात्मक बंधन के माध्यम से की अस्पष्टता को तेज करके यूरेनिल एसीटेट । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी synaptic पुटिकाओं और उनके आकार और स्थानिक संगठन के टर्मिनल bouton में मात्रा का परिमाण के रूपात्मक विवरण के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । हालांकि, क्योंकि यह निश्चित ऊतक का उपयोग करता है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी केवल अप्रत्यक्ष जानकारी प्रदान कर सकते है रहने या प्रक्रियाओं को विकसित करने के बारे में । इसलिए, अन्य तकनीकों पर विचार किया जाना चाहिए जब मुख्य उद्देश्य synaptic आशय की तस्करी और exocytosis के गतिशील या कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए है.

Introduction

हम नवजात चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए synaptic आशय के में गहराई से रूपात्मक विश्लेषण तंत्रिका टर्मिनलों1,2में स्थानिक वितरण । इन पद्धतियों का अनुसरण करते हुए नमूनों के प्रक्रमण द्वारा प्राप्त किए जा सकने वाले उच्च-कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ़ का उपयोग सेलुलर घटकों की संख्या और उनके आयामी संरचनात्मक संबंधों3,4के विस्तृत आकारिकी का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है ।

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEM) एक शक्तिशाली उपकरण के लिए organelles और अंय सेलुलर संरचनाओं की आकृति विज्ञान का अध्ययन मात्रात्मक है । इस दशक के रूप में, वहाँ जांच की कोई अन्य तरीके हैं जो इम्यूनो-टैगिंग के बिना लिपिड झिल्ली और organelles के संकल्प की एक ही डिग्री प्रदान कर सकते हैं, उच्च दाब ठंड से cryofixation के अपवाद के साथ. हालांकि, स्थिर प्रतिस्थापन तकनीकों का व्यापक रूप से इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, और आम तौर पर महंगे उपकरण और लंबी तैयारी बार की आवश्यकता है ।

आदेश में है TEM उच्च समाधान शक्ति का लाभ लेने के लिए, इष्टतम नमूना तैयारी सबसे महत्वपूर्ण है । नमूना तैयार करने के मुख्य लक्ष्य जीवित अवस्था से न्यूनतम परिवर्तन के साथ ऊतक संरचना को संरक्षित करना, नमूना कंट्रास्ट को बढ़ाना, और इलेक्ट्रॉन को संसाधित करने के दौरान सेलुलर घटकों के निष्कर्षण के विरुद्ध ऊतक को स्थिर करना है । बीम. TEM ऊतक तैयार करने के लिए कई प्रोटोकॉल शुरू कर दिया गया है और पिछले कुछ वर्षों में कई प्रयोगशालाओं द्वारा सिद्ध । उनमें से कई synaptic पुटिकाओं5,6,7,8,9,10,11के इष्टतम दृश्य के लिए तरीकों पर ध्यान केंद्रित किया है । अच्छी तरह से स्थापित की एक संख्या के अलावा, सोने के मानक तरीकों का उपयोग में वर्तमान में, हम रासायनिक निर्धारण, पद निर्धारण, एन ब्लॉक धुंधला, अनुक्रमिक निर्जलीकरण, राल embedding और पद धुंधला है कि इष्टतम ऊतक संरचना को संरक्षित करने के उद्देश्य के लिए प्रक्रियाओं को चुना है और उत्कृष्ट छवि कंट्रास्ट प्राप्त करना । नोट की, ठीक ultrastructure के संरक्षण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब नवजात चूहा मस्तिष्क के ऊतकों के साथ काम कर रहे । वास्तव में, बहुत युवा जानवरों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र वयस्क मस्तिष्क से अधिक पानी की सामग्री की विशेषता है, extracellular रिक्त स्थान के अधिक प्रमुख इज़ाफ़ा, और कोशिकाओं के बीच लूजर कनेक्शन12. यह नवजात चूहे मस्तिष्क ऊतक osmolarity में परिवर्तन करने के लिए गहराई से संवेदनशील बनाता है, और उत्कृष्ट विरूपण के लिए प्रवण और/ इसलिए, हमारे तरीके नमूना प्रसंस्करण के लिए समाधान नियोजित है कि परासारिता के रूप में चूहा नवजात मस्तिष्क के लिए संभव के रूप में बंद कर रहे हैं । हमारा लक्ष्य तंत्रिका टर्मिनलों पर synaptic आशय स्थानिक वितरण के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए उच्च गुणवत्ता, उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त करने के लिए किया गया था । विशेष रूप से, हम तंत्रिका टर्मिनल के भीतर पुटिकाओं की संख्या को मापने की मांग की, पूर्व synaptic प्लाज्मा झिल्ली से synaptic पुटिकाओं की दूरी, पूर्व synaptic झिल्ली पर डॉक्ड पुटिकाओं की संख्या, synaptic पुटिकाओं के आकार और अंतर-पुटक दूरी1.

संतोषजनक रासायनिक नियतन उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के लिए एक पूर्वापेक्षा है जो synaptic पुटिका आकारिकी और स्थानिक संगठन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार प्रदान कर सकता है । यद्यपि कई प्रकार के नियतन विद्यमान हैं, तथापि संवहनी छिड़काव द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों का स्थिरीकरण निश्चित रूप से अन्य पद्धतियों से बेहतर है । संवहनी छिड़काव के माध्यम से निर्धारण प्रणालीगत संचलन की गिरफ्तारी के बाद तुरंत शुरू होता है के बाद से, यह मस्तिष्क के ऊतकों के deoxygenation के बीच अंतराल को छोटा करता है और fixatives के साथ प्रोटीन की परस्पर जोड़ने, सेल में ंयूनतम परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप संरचना. इसके अलावा, यह तेजी से और समान पैठ accomplishes, क्योंकि संवहनी बिस्तर से लगानेवाला के तेजी से प्रवाह के extracellular और सेलुलर डिब्बों12,13,14। ग्लूटाल्डिहाइड के साथ प्राथमिक स्थिरीकरण, आज़मियम tetroxide के साथ माध्यमिक निर्धारण (बाद निर्धारण) के बाद, ठीक संरचना15,16,17के उत्कृष्ट संरक्षण पैदावार । ग्लूटारल्डिहाइड और पैराफॉर्मैल्डिहाइड के मिश्रण से ऊतक12में अधिक तेजी से पैठ का अतिरिक्त लाभ होता है ।

के बाद से जैविक ऊतकों को पर्याप्त रूप से एक राल मैट्रिक्स के समर्थन के बिना पतली वर्गों में कटौती करने के लिए कठोर नहीं हैं, वे पतली sectioning से पहले एक माध्यम में एंबेडेड की जरूरत है । पानी-immiscible epoxy रेजिन सामांयतः TEM में एक embedding माध्यम के रूप में उपयोग किया जाता है । जब मैट्रिक्स के इस प्रकार का प्रयोग किया जाता है, सभी नमूना मुक्त पानी राल घुसपैठ से पहले एक कार्बनिक विलायक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । पानी को इथेनॉल के आरोही सांद्रता के समाधान की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूना पारित करने से हटा दिया जाता है और/ इस प्रोटोकॉल में, नमूने पहले लचीला aclar चादरें, तो एक कैप्सूल में एंबेडेड के बीच एंबेडेड फ्लैट हैं । अंतिम परिणाम एक बेलनाकार राल ब्लॉक की नोक पर स्थित ऊतक है, जो आदर्श ज्यामिति के लिए कम हो माइक्रोटोम sectioning के दौरान उत्पंन होने वाले कंपन से प्रभावित है ।

अंतर्जात ऊतक कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए भारी धातुओं के साथ धुंधला होना नमूना तैयार करने का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू है । प्रतिबिंब में चित्र के विपरीत, इलेक्ट्रॉन के परमाणुओं द्वारा ऊतक में प्रकीर्णन के कारण होता है । हालांकि, जैविक सामग्री मुख्यतः कम परमाणु वजन अणुओं (यानी, कार्बन, हाइड्रोजन, ऑक्सीजन और नाइट्रोजन) से मिलकर बनता है । अतः पर्याप्त प्रकीर्णन के विपरीत उच्च परमाणु भार परमाणुओं को ऊतक के कोशिकीय अवयवों में समाविष्ट करने की आवश्यकता होती है । यह भारी धातुओं के साथ नमूना के धुंधला के माध्यम से हासिल की है12,18,19। Osmium tetroxide, यूरेनियम और सीसा, जो lipids के लिए दृढ़ता से बाइंड, सबसे आम भारी धातुओं इलेक्ट्रॉन दाग के रूप में इस्तेमाल किया ।

Osmium (परमाणु संख्या ७६) के अस्तित्व में densest धातुओं में से एक है । यह दोनों एक लगानेवाला और एक दाग है, हालांकि tem में अपनी प्राथमिक भूमिका एक विश्वसनीय लगानेवाला12के रूप में है । उपयोग में विभिन्न निर्धारण प्रोटोकॉलों के अलावा, ओस्मियम के बाद ग्लूटार्ल्डिहाइड के साथ दोहरे निर्धारण की विधि नमूना तैयार करने के दौरान कोशिका अवयवों के निष्कर्षण को कम करने में सबसे अधिक प्रभावी है । इन दो फिक्टिव्स अणुओं के विभिंन प्रकार की अधिकतम संख्या को स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से प्रोटीन और lipids, और परिणाम ultrastructure ऊतक के बेहतर संरक्षण में12,14,15, 16 , १७।

यूरेनियम (परमाणु संख्या ९२) इलेक्ट्रॉन दाग के रूप में इस्तेमाल सबसे भारी धातु है, ज्यादातर यूरेनिल एसीटेट के रूप में आम तौर पर । इसी प्रकार osmium करने के लिए, यह एक दाग और fixative के रूप में कार्य करता है, हालांकि tem में अपनी प्राथमिक भूमिका एक20,21दाग के रूप में है । न्यूइक अम्ल-युक्त तथा झिल्लीदार संरचनाओं को ऐल्डिहाइड-नियत ऊतकों22,23में यूरेनिल लवण के साथ दृढ़ता से और अधिमान्य रूप से दाग दिया जाता है । ओस्फिकेशन के बाद और निर्जलीकरण से पहले यूरेनिल एसीटेट के साथ ऊतकों के उपचार झिल्ली और न्यूइक एसिड युक्त संरचनाओं के स्थिरीकरण में परिणाम, साथ ही बढ़ाया कंट्रास्ट, और कुछ संरचनात्मक विवरण है कि नहीं होगा की पहचान की अनुमति देता है अकेले आज़मियम के साथ दाग नमूनों में आसानी से पाया जा12,24,25। यह सोचा है कि यूरेनिल एसीटेट कम आज़मियम के साथ संयोजन द्वारा ठीक संरचना को स्थिर हो सकता है कि osmication के दौरान लिपिड झिल्ली पर जमा किया गया है24. अधिकतम कंट्रास्ट प्राप्त है जब यूरेनिल एसीटेट embedding से पहले लागू किया जाता है और एक पोस्ट के रूप में पतली वर्गों में दाग12।

सीसा (परमाणु संख्या ८२) सबसे आम TEM के लिए इस्तेमाल किया दाग है और मुख्य रूप से पतली वर्गों के बाद धुंधला के लिए कार्यरत है । सीसा लवण में उच्च इलेक्ट्रॉन अपारदर्शिता होती है तथा झिल्ली, नाभिकीय तथा साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन, न्यूक्लिइक अम्ल तथा ग्लाइकोजन26,27सहित अनेक कोशिकीय संरचनाओं के लिए अपनत्व प्रदर्शित होता है । जब डबल धुंधला विधि नियोजित है (यानी, यूरेनिल एसीटेट के साथ धुंधला नेतृत्व के साथ उपचार द्वारा पीछा किया है), यूरेनिल एसीटेट धुंधला के एक डेवलपर के रूप में काम करता है । उदाहरण के लिए, ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ निर्धारित क्रोमेटिन कालीड पोस्ट-धुंधला हो जाना, तीन28,29,30,31,३२का एक कारक द्वारा यूरेनाइल एसीटेट तेज बढ़ जाता है । सीसा भी osmium के रूप में अंय धातुओं द्वारा प्रदान की जा रही धुंधला बढ़ाता है । यह माना जाता है कि सीसा लवण कम आज़मियम३३की उपस्थिति में फॉस्फिटाइड के ध्रुवीय समूह के लिए संलग्न द्वारा आज़मियम-फिक्स्ड ऊतकों की झिल्ली दाग । दोनों यूरेनिल एसीटेट और सीसा, विशेष रूप से लंबे समय तक durations के लिए के साथ धुंधला की एक संभावित नुकसान यह है कि कई अलग संरचनात्मक तत्वों को समान रूप से और गैर विशेष रूप से दाग रहे हैं, और इस तरह आसानी से एक दूसरे से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है12 .

इस तरह के ऑप्टिकल सुपर संकल्प फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी में के रूप में वैकल्पिक प्रकाश स्रोतों, की हाल ही में शुरू की है, काफी प्रकाश माइक्रोस्कोपी संकल्प३४सुधार हुआ है । हालांकि, क्योंकि प्रकाश माइक्रोस्कोपी के ऊतक-रसायन और प्रतिरक्षा साइटोकेमिकल तरीकों पर निर्भर करता है व्यक्तिगत रूप से कल्पना-प्रोटीन या एंजाइमों लेबल, tem की शक्ति को एक बार में सभी संरचनात्मक तत्वों को प्रदर्शित करने के लिए नायाब रहता है में गहराई से अध्ययन ऊतक संरचनाओं के आकारिकी और आयामी संबंध । विशेष रूप से, कोई अंय तकनीक में पूर्व synaptic तंत्रिका boutons पर synaptic आशय वितरण के रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए आवश्यक रूपात्मक विस्तार प्रदान कर सकते हैं । फिर भी, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इलेक्ट्रॉन micrographs जीव मर जाता है के बाद ऊतक की संरचना पर कब्जा है, और इसलिए वे पूर्व synaptic पुटिका तस्करी और exocytosis की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकते । इसलिए, अंय उपकरण, जैसे एफएम डाई-लाइव इमेजिंग और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, पर विचार किया जाना चाहिए जब मुख्य उद्देश्य synaptic आशय तस्करी और exocytosis के गतिशील और/या कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए है ।

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Protocol

सभी अध्ययनों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा वर्जीनिया विश्वविद्यालय में अनुमोदित किया गया था (Charlottesville, VA) और स्वास्थ्य दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया ।

1. संवहनी छिड़काव द्वारा निर्धारण

नोट: चूहा मस्तिष्क संवहनी छिड़काव के लिए विधि का एक सामांय वर्णन इस13 जर्नल में पहले से ही विस्तृत किया गया है और इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है । हालांकि, पूर्व-synaptic टर्मिनलों पर synaptic पुटिकाओं वितरण के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्राप्त करने के लिए नवजात चूहे मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के लिए निम्नलिखित कदम विशिष्ट हैं ।

  1. 4% पैराफॉर्मलेडिहाइड तैयार करें
    1. एक धूआं हुड के नीचे एक भावप्रवण प्लेट पर एक 2 एल ग्लास बीकर में ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर (पीबी) के ८०० मिलीलीटर प्लेस । बफर उबलते बिना लगभग ६० डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी ।
    2. पैराफॉर्मलेडिहाइड पाउडर में से ४० ग्राम जोड़ें । लगातार हलचल
    3. पीएच को मापने के दौरान, 10 N NaOH की छोटी बूंदें जोड़ें जब तक समाधान साफ करता है । अंतिम पीएच 7.2-7.4 होना चाहिए ।
    4. शेष ०.१ M PB 1 L के अंतिम खंड में जोड़ें । शांत चलो, एक ०.४५ μm झिल्ली के साथ फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस रात में स्टोर ।
      नोट: दिन में छिड़काव से पहले ताजा पैराफार्मलेडिहाइड तैयार करें ।
      चेतावनी: एल्डिहाइड vapors साँस लेना नाक लक्षण और airway जलन पैदा कर सकता है । त्वचा के साथ संपर्क जिल्द की सूजन का कारण बनता है । Aldehydes एक धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए, जबकि दस्ताने पहने, एक सुरक्षात्मक गाउन और सुरक्षा काले चश्मे
  2. टायरोडे विलयन तैयार करें
    1. प्लेस 1 एक सरगर्मी थाली पर एक गिलास बीकर में आसव पानी की L । बीकर में NaCl (8 g), KCl (०.१५ g), CaCl2 (०.१ g), mgcl2 (०.००६ g), नाह2पीओ4 (०.०५५ g), nahco3 (1 g) और डेक्सट्रोज (1 g) जोड़ें ।
    2. लगातार हलचल और पीएच उपाय । पीएच को ७.२ और ७.४ के बीच रखें ।
      नोट: Tyrode समाधान भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ।
  3. 2% की अंतिम एकाग्रता पर ग्लूटारल्डिहाइड के साथ 4% पैराफॉर्मलेडिहाइड मिलाएं । इसमें ४० मिलीलीटर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जोड़ें-ग्रेड ५०% ग्लूटार्ल्डिहाइड 1 एल से 4% पैराफॉर्मडिहाइड । एक भावप्रवण प्लेट में अच्छी तरह मिलाएं
    नोट: लगभग १०० मिलीलीटर पैराफॉर्मलेडिहाइड-ग्लूटार्ऐल्डिहाइड फिक्टिव सॉल्यूशन को नवजात चूहे के शरीर को शवद करने के लिए आवश्यक है । इसलिए कम से 10 नवजात चूहों को 1 L फिक्टिव के साथ परसाइस किया जा सकता है । पैराफॉर्मलेडिहाइड और ग्लूटाल्डिहाइड को तुरंत इस्तेमाल से पहले तक मिक्स न करें । Perfusion से पहले कमरे के तापमान के लिए सभी समाधान लाओ ।
  4. एक बार बाईं वेंट्रिकल के लिए उपयोग प्राप्त किया गया है (पूरे पशु छिड़काव प्रोटोकॉल13देखें), १२० mmhg के एक छिड़काव दबाव में 30 एस के लिए tyrode समाधान के साथ संवहनी प्रणाली फ्लश ।
    नोट: परिगलन की सफलता संवहनी बिस्तर से रक्त के पूर्ण बहिष्कार पर भाग में निर्भर करता है
  5. 10 मिनट के लिए समान दाब पर पैराफार्मलेडिहाइड-ग्लूटार्ल्डिहाइड विलयन से फ्लश ।
    नोट: कलाकृतियों की शुरुआत से बचने के लिए निरंतर छिड़काव दबाव का अनुरक्षण आवश्यक है । इसके अलावा, perfusate के तापमान चूहे के शरीर के तापमान से नीचे नहीं होना चाहिए वाहिकासंकीर्णन से बचने के लिए
  6. खोपड़ी से स्थिर मस्तिष्क और ताजा पैराफार्मलेडिहाइड में जगह-ग्लूटाल्डिहाइड फिक्टिव को 4 डिग्री सेल्सियस रात में निकालें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

2. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया

  1. 4% में फिक्स्ड मस्तिष्क एम्बेड करें और गोंद एक vibratome चरण पर मस्तिष्क-agarose ब्लॉक
    नोट: अंय प्रयोगशालाओं एगर समर्थन के बिना vibratome पर एक स्थिर ब्लॉक प्राप्त करने के द्वारा अच्छी गुणवत्ता वर्गों प्राप्त किया है
  2. ५० μm मोटाई की धारा स्लाइसें । माइक्रोटोम को कम आवृत्ति और गति के लिए सेट करें ।
    नोट: अनुभागों में ०.१ M PB में संग्रहीत किया जा सकता है ०.०५% सोडियम ऐज़ाइड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए.
  3. ०.१ मीटर पंजाब में एक पेट्री डिश में वर्गों प्लेस, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों की जांच और embedding के लिए नमूनों का चयन करें
    नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।

3. रिंसिंग

नोट: यह महत्वपूर्ण है कि aldehydes के साथ निर्धारण के बाद और आज़मियम के साथ पोस्ट-निर्धारण से पहले नमूना कुल्ला, के बाद से अवशिष्ट फिक्टिव्स आज़मियम precipitates उत्पादन हो सकता है

  1. पिपेट ०.१ एम पी ए शॉर्ट, वाइड-माउथ ग्लास शीशी में कैप के साथ । प्रत्येक शीशी के प्रति एक नमूना रखें । पूरी तरह से नमूना कवर है कि यह सूखी नहीं है ।
    नोट: निर्धारण, निर्जलीकरण और घुसपैठ के सभी समाधान परिवर्तन के माध्यम से इस कदम से एक ही शीशी में नमूनों रखें, जब तक वे फ्लैट embedding के लिए तैयार हैं ।
  2. 3 मिनट x 2 के लिए ०.१ मीटर पीबी में नमूना कुल्ला, तो एक micropipette के साथ पंजाब को हटा दें ।
    नोट: नवजात चूहे के मस्तिष्क के बाद से गहराई से परासारिता में परिवर्तन करने के लिए संवेदनशील है12,३५,३६,३७, के रूप में एक ही वाहन में धोने बाहर ले कि लगानेवाला मिश्रण में इस्तेमाल किया

4. पोस्ट-Osmium के साथ निर्धारण

  1. आज़मियम टेट्रॉक्साइड की तैयारी (oso4)
    नोट: इस लेखक की प्रयोगशाला OsO 4 4 % का इस्तेमाल करता है गिलास ampoules में एक जलीय समाधान में आपूर्ति (oso4 4% के एच2ओ में 5 मिलीलीटर) । अंय प्रयोगशालाओं OsO4 क्रिस्टल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है । हालांकि, कई घंटे एक वाहन में OsO4 क्रिस्टल भंग करने के लिए आवश्यक हैं ।
    1. 4% OsO4के 5 मिलीलीटर (एक ampoule) ले लो,यह खुला है और यह एक भूरे रंग कांच की बोतल में जगह
      नोट: OsO4 एक मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट है और आसानी से प्रकाश के संपर्क में कमी । कमी एक भूरे रंग के कांच की बोतल में OsO4 रखकर तैयारी के दौरान बचा जा सकता है
    2. ०.२ एम पंजाब के 5 मिलीलीटर जोड़ें । यह 2% OsO4/०.१ एम पीबी के 10 मिलीलीटर की पैदावार होगी ।
      नोट: के बाद से नवजात चूहे के मस्तिष्क गहराई से osmolarity में परिवर्तन करने के लिए संवेदनशील है, एक ही बफर का उपयोग करने के लिए तैयार ऐल्डिहाइड फिक्सेटिव्स और oso4 समाधान12,३५,३६,३७
    3. ०.१ एम पंजाब के अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें । यह ०.१ मीटर पीबी में 1% OsO4 के 20 मिलीलीटर का अंतिम समाधान निकलेगा ।
    4. 1% OsO4 आकर्षित करने के लिए एक लंबी सुई के साथ फिट एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें और यह एक भूरे रंग के कांच की बोतल या एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर एक scint शीशी में रखें ।
      चेतावनी: OsO4 अत्यंत अस्थिर है और इसके धुएं नाक, आंख और गले के लिए विषाक्त कर रहे हैं । सभी काम एक धूआं में प्रदर्शन किया जाना चाहिए हुड दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़ों का उपयोग करते हुए, और कोई शरीर का हिस्सा OsO4को उजागर किया जाना चाहिए । हैंडलिंग और अपशिष्ट निपटान आपके संस्थान के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए । स्टोर अप्रयुक्त oso4 गिलास डाट पर teflon लाइनर के साथ एक कसकर डाटदार भूरे रंग की कांच की बोतल में, डबल एल्यूमीनियम पंनी में बोतल लपेटो और एक dessicator में स्टोर । धुएं रिसाव की उपस्थिति में, OsO4 आंतरिक सतहों और रेफ्रिजरेटर की सामग्री उतरना कर सकते हैं । उपर्युक्त भंडारण स्थितियों के अंतर्गत, कई महीनों तक ओएसओ4 विलयन स्थिर रहता है । जब भंडारण के दौरान समाधान ऑक्सीकरण हो जाते हैं, वे भूरे रंग के हो जाते हैं, जिस स्थिति में उन्हें निपटाने की आवश्यकता होती है ।
  2. नमूना शीशी में ०.१ एम पंजाब में 1% OsO4 जोड़ें और एक micropipette के साथ 1 ज के बाद 1 एच निकालें oso4 के लिए बैठते हैं ।
    नोट: इस खंड को OsO4 लागू करने से पहले, यह खोलना और नमूना समतल करने के लिए महत्वपूर्ण है । सीधे नमूने के शीर्ष पर आवेदन से बचें, बजाय शीशी की दीवारों का उपयोग करने के लिए धीरे से शीशी के नीचे OsO4 ड्रिप । नमूना OsO4 आवेदन के बाद शीघ्र ही भूरे और कठोर हो जाता है। ऊतक क्षति से बचने के लिए अब से धीरे से संभाल

5. रिंसिंग

नोट: यह OsO4 के साथ पोस्ट-निर्धारण और निर्जलीकरण से पहले के बाद नमूना कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से अवशिष्ट fixatives निर्जलीकरण एजेंटों३७के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं ।

  1. 3 मिनट x 3 के लिए ०.१ एम पंजाब के साथ कुल्ला ।
    नोट: नवजात चूहे के मस्तिष्क के बाद से गहराई से osmolarity में परिवर्तन करने के लिए संवेदनशील है, के रूप में है कि फिक्टिव मिश्रण12,३५,३६,३७में इस्तेमाल किया एक ही वाहन में धोने बाहर ले ।
  2. आज़मियम समाधान और पहले दो पीबी rinses में oso4 अपशिष्ट प्लेस और अपने संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार इसे निपटाने ।

6. अनुक्रमिक निर्जलीकरण और Uranyl एसीटेट के साथ धुंधला

नोट: इस लेखक की प्रयोगशाला embedding के लिए पानी immiscible epoxy रेजिन का उपयोग करता है । जब epoxy रेजिन का उपयोग किया जाता है, सभी नमूना मुक्त पानी घुसपैठ से पहले embedding माध्यम से एक कार्बनिक विलायक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । पानी को इथेनॉल और एसीटोन12के आरोही सांद्रता के समाधान की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूना पारित करके हटा दिया जाता है ।

  1. यूरेनिल एसीटेट (UA) की तैयारी
    1. एक २०० मिलीलीटर आयतनी ग्लास फ्लास्क एक सरगर्मी थाली पर etoh ७०% की १०० मिलीलीटर युक्त रखें ।
    2. फ्लास्क में 4 ग्राम UA के जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी में लपेटें (UA precipitates जब प्रकाश के संपर्क में) और लगातार हलचल ।
      नोट: UA धीरे और ७०% EtOH में incompletely से घुल । विलयन का उपयोग करने से पहले अघुलनशील क्रिस्टलों को व्यवस्थित होने दें । UA समाधान का उपयोग करने से पहले एक ०.४५ μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए । UA समय से आगे तैयार किया जा सकता है और एक भूरे रंग की बोतल में 4 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे रखा महीनों के लिए ।
      चेतावनी: UA हल्का रेडियोधर्मी और अत्यधिक विषाक्त है । UA पाउडर की साँस लेना ऊपरी श्वसन तंत्र विकारों और फेफड़ों, जिगर और गुर्दे की बीमारी का कारण बन सकता है । UA खतरनाक जब किया जाता है या जब यह त्वचा और श्लेष्मा झिल्ली के साथ सीधे संपर्क में आता है. सभी काम एक धूआं में प्रदर्शन किया जाना चाहिए-दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़ों का उपयोग कर हुड । हैंडलिंग और अपशिष्ट निपटान आपके संस्थान के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए ।
  2. 1 मिनट के लिए ५०% EtOH में dehydrate । UA जोड़ने से पहले ५०% EtOH निकालें ।
  3. ७०% EtOH में 4% UA जोड़ें । चलो 1 एच या रात भर के लिए बैठते हैं । यदि रात भर, फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह है ।
    नोट:     टोपी शीशी EtOH वाष्पीकरण से बचने के लिए और प्रकाश के लिए जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।
    1. UA अपशिष्ट के निपटान और दो निंनलिखित अपने संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार rinses
  4. 1 मिनट के लिए ७०% EtOH में dehydrate ।
  5. 5 मिनट के लिए ९०% एटोह में निर्जलीकरण ।
  6. 5 मिनट x 2 के लिए १००% EtOH में dehydrate ।
  7. 2 मिनट x 3 के लिए एसीटोन में नमूना कुल्ला ।

7. घुसपैठ और Embedding

नोट: एक राल मैट्रिक्स के अतिरिक्त समर्थन के बिना पतले वर्गों में कटौती करने के लिए पर्याप्त ऊतकों कठोर नहीं हैं । इसलिए, घुसपैठ और एम्बेडिंग12में होना चाहिए ।

  1. EPON राल की तैयारी
    1. एक ६० मिलीलीटर गावज सिरिंज का उपयोग करें । सिरिंज प्लंजर निकालें और एक सुरक्षा सुई के साथ सिरिंज कैप ।
    2. खुली ओर के साथ सिरिंज प्लेस और राल मिश्रण संवर्द्धित के प्रत्येक घटक की मात्रा जोड़ें । एंबेड के 22 मिलीलीटर-८१२ (राल) जोड़ें । ३७ मिलीलीटर की कुल मात्रा में DDSA (hardener) जोड़ें । ५०.५ मिलीलीटर की कुल मात्रा में एनएमए (hardener) जोड़ें । एक पिपेट के साथ DMP-30 (त्वरक) के ५२५ μL जोड़ें । पिपेट के प्लंजर को बहुत धीरे से हिलना क्योंकि डीएमपी बहुत चिपचिपा होता है ।
      नोट: यह सूचीबद्ध क्रम में एंबेडिंग अभिकर्मकों को जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । एक्सीलरेटर (DMP-30) पिछले जोड़ा जाना चाहिए । एक ठीक है कि वांछित विशेषताओं है ब्लॉक प्राप्त करने के लिए, यह हार्डनर और त्वरक की सटीक राशि का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । हौसले से तैयार embedding मिश्रण पसंद कर रहे हैं ।
    3. प्लंजर को वापस रखो और एक घुमाव पर सिरिंज को लगातार मिलाते हुए कम से 30 मिनट के लिए रखें । रंग पीला से अंबर में बदल जाएगा ।
      नोट: सभी सामग्री बहुत अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए । ऐसा करने में विफलता ऊतक नमूना और असमान कठोरता के एक ब्लॉक के असमान गर्भाधान में परिणाम
  2. एक scint शीशी में एसीटोन के 1 मात्रा के साथ EPON राल के 1 मात्रा मिक्स और मिश्रण करने के लिए हिला । 1:1 EPON लागू करें: अंतिम एसीटोन कुल्ला हटाने के बाद ऊतक पर एसीटोन मिश्रण । एसीटोन वाष्पीकरण से बचने के लिए कवर रखें । 2-4 एच के बाद राल और एसीटोन के 1:1 मिश्रण निकालें या रात भर रखें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  3. पूर्ण राल के साथ राल और एसीटोन के मिश्रण की जगह । चलो 4 एच या रात भर के लिए बैठते हैं । हुड के तहत एक संग्रह कंटेनर में सभी EPON अपशिष्ट रखो polymerized जा सकता है और बाद में निपटारा किया ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

8. फ्लैट-embedding

नोट: नमूने एक सैंडविच की तरह फैशन में दो aclar फिल्मों के बीच फ्लैट एंबेडेड हैं ।

  1. स्पष्ट aclar शीट के दो आयताकार टुकड़े काट दिया । इएटोह ७०% के साथ साफ फिल्मों पोंछ । चादरों ट्रिम कर दीजिए ताकि वहां के ऊतकों से मुक्त प्लास्टिक अनुभाग के हर पक्ष पर कम से १.५ सेमी है । शीर्ष पर aclar शीट नीचे के रूप में एक ही चौड़ाई होना चाहिए, और इसकी ऊंचाई लगभग नीचे चादर का दो तिहाई होना चाहिए ।
  2. धीरे से नमूना के साथ शीशी झुकाव और धीरे शीशी के नीचे से ऊतक उठा ।
  3. एक माइक्रो लचीला रंग और एक ठीक ब्रश का उपयोग करने के लिए ध्यान से शीशी दीवारों के साथ खंड और aclar शीट पर स्थानांतरण स्थानांतरित ।
    नोट: नमूना क्षति से बचने के लिए सावधानी के साथ वर्गों को संभाल ।
  4. धीरे से एक नमूना के शीर्ष पर aclar चादर रखें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वहां दो चादरें के बीच पर्याप्त राल के लिए सैंडविच सील है
  5. अनुभाग पर सीधे दबाव डालने के बिना किसी भी फंसे हुए हवा के बुलबुले को धीरे से धकेलें । अतिरिक्त EPON बाहर पोंछ ।
    नोट: हवा बुलबुले के उंमूलन महत्वपूर्ण है, के रूप में अपनी उपस्थिति के नमूने के दृश्य मुश्किल है और राल बांड की स्थिरता कमजोर ।
  6. एक विलायक प्रतिरोधी कलम और ओवन में जगह ६० ͦC पर 2-3 दिनों के लिए polymerize करने के लिए चादरें लेबल ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

9. कैप्सूल Embedding

नोट: अतिसूक्ष्मदर्शी को चकों से आपूर्ति की जाती है ताकि वे बेलनाकार खंडों को धारण कर सके जो नमूनों को कैप्सूलों में एम्बेड करने से प्राप्त होते हैं । बेलनाकार ब्लॉकों में आदर्श ज्यामिति होती है जो सेक्शनिंग के दौरान उत्पन्न होने वाले कंपन से कम से प्रभावित होती है ।

  1. धीरे से sandwiched aclar फिल्मों खोलो । नमूना दो aclar शीट में से एक का पालन करेंगे ।
  2. Aclar शीट है कि अनुभाग शामिल की ओर चिह्नित करने के लिए एक विलायक प्रतिरोधी कलम का प्रयोग करें । ऊतक के पास निशान ।
    नोट: यह ब्याज की ऊतक छिद्रण से पहले इस कदम का प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. खंड का एक वृत्त नमूना प्राप्त करने के लिए एक डिस्क पंच का उपयोग करें । कलम के निशान छिद्रित बाहर ऊतक का हिस्सा होना चाहिए ।
  4. एक कैप्सूल धारक पर एक embedding कैप्सूल पक्ष की टोपी तैयार करते हैं । टोपी पर राल की एक बूंद रखें ।
  5. ऊतक अनुभाग ऊपर का सामना करना पड़ के साथ टोपी के अंदर छिद्रित डिस्क रखें । जब प्रकाश नमूने पर चमकता है तो कलम का निशान चमका होगा ।
  6. कैप में एक कैप्सूल डालें और लेबल डालने के लिए ठीक चिमटी का उपयोग करें । रोल और कम एक मुद्रित 2 सेमी कागज के लंबे टुकड़े कैप्सूल में । लेबल के लिए कैप्सूल की ओर दीवारों की वक्रता के लिए फिट बनाओ । बहुलकीकरण पूरा होने के लिए रुको, ताकि लेबल स्थाई रूप से राल में एंबेडेड हो जाता है ।
  7. कैप्सूल के अंदर embedding राल डालो और कैप्सूल के किनारे तक भरें ।
  8. 2-3 दिनों के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर ओवन में एक नुकीली लकड़ी की छड़ी की सहायता से ऊतक के नमूने को कैप्सूल के नीचे की ओर धकेलें ।
    नोट: इस बात का ध्यान रखें कि ऊतक को बहुत कठोर न दबाएं, इसके बजाय इसे शिथिल होने दें ताकि एम्बेड माध्यम की एक पतली परत ऊतक और कैप्सूल की सतह के बीच मौजूद रहे । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।

10. ब्लॉक चेहरे की Trimming

नोट: छोटे आकार और ब्लॉक चेहरे के उचित आकार संतोषजनक sectioning के लिए आवश्यक शर्तें हैं । इसलिए, नमूना ब्लॉक की ट्रिमिंग एक आवश्यकता है ।

  1. एक तेज एक धार रेज़र ब्लेड का उपयोग करें । तुरंत उपयोग करने से पहले एसीटोन के साथ साफ करें ।
  2. एक ब्लॉक धारक में कैप्सूल ब्लॉक माउंट और एक stereomसूक्ष्मदर्शी के मंच पर ब्लॉक धारक जगह है ।
    नोट: ट्रिमिंग प्रक्रिया को सूक्ष्मदर्शी दूरबीन और तिर्यक प्रदीप्ति के अंतर्गत किया जाना चाहिए ।
  3. एक रेज़र ब्लेड का उपयोग कर कैप्सूल की नोक से aclar शीट निकालें । विच्छेदन क्षेत्र के प्रकाश में एक चमकदार परत के रूप में aclar चादर प्रकट होता है ।
  4. ४५ डिग्री के कोण पर रेज़र ब्लेड पकड़ो और कैप्सूल ब्लॉक के चार पक्षों नीचे कटौती करते हैं ।
    नोट: अगर ब्लेड को दोनों हाथों से धारण किया जाए तो ट्रिमिंग का बेहतर नियंत्रण हासिल होता है ।
  5. कम कटौती करें ताकि ब्लॉक लगभग ४५ डिग्री की दीवार कोण के साथ एक छोटे पिरामिड के रूप लेता है ।
    नोट: नमूना चेहरा बहुत बेहतर समर्थन किया है अगर यह करने के लिए अग्रणी पक्षों को कम रखा जाता है । यदि ब्लॉक टिप बहुत पतली और लंबी है, यह पतली sectioning के दौरान कंपन होगा । आदर्श रूप में, ब्याज के क्षेत्र ब्लॉक चेहरे में केंद्रित होना चाहिए ।
  6. कैप्सूल के टिप ट्रिम करने के लिए ज़्यादा ऊतक त्यागने और केवल ब्याज के क्षेत्र की रक्षा ।
    नोट: खंड का कोई हिस्सा ऊतक के बिना नहीं होना चाहिए, के रूप में ब्लॉक चेहरे के घनत्व में बदलाव sectioning में कठिनाई का एक प्रमुख कारण हैं । आदर्श रूप में, कैप्सूल चेहरे की सतह क्षेत्र 1 मिमी2से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  7. एक विषमबाहु trapezoid के आकार में कैप्सूल चेहरे ट्रिम । क्योंकि एक विषमबाहु चतुर्भुज में कोई पक्ष बराबर है, इस आकार के नमूने के बाकी के सापेक्ष ब्याज के क्षेत्र को उंमुख करने के लिए सबसे अच्छा है ।
    नोट: सेक्शनिंग के दौरान, trapezoid आकार का चेहरा किसी भी अंय आकार की तुलना में बहुत बेहतर समर्थन किया है ।

11. माइक्रोटोम सेक्शनिंग

नोट: जैविक नमूनों के अधिकांश अपने प्राकृतिक राज्य में बहुत मोटी है एक इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा प्रवेश किया जाना है । इसलिए, सामग्री पतली वर्गों है कि इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा प्रवेश किया जा सकता है में कटौती की जानी चाहिए ।

  1. पतली वर्गों (चांदी हस्तक्षेप रंग, 600-900 Å) सतह के समानांतर विमानों पर एक ultramicrotome में कटौती ।
  2. ग्रिड पर वर्गों प्लेस । इस लेखक की प्रयोगशाला बाहरी व्यास में ३.०५ मिमी के तांबे के ग्रिड का उपयोग करती है ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।

12. पोस्ट-Uranyl एसीटेट के साथ धुंधला

  1. आसुत जल में 2% यूए तैयार करें । एक २०० मिलीलीटर आयतनी ग्लास फ्लास्क एक सरगर्मी थाली पर आसुत पानी की १०० मिलीलीटर युक्त रखें । फ्लास्क में 2 जी का यूए जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी में लपेटें (UA precipitates जब प्रकाश के संपर्क में) और लगातार हलचल ।
    नोट: UA तैयारी के विवरण के लिए, इस प्रोटोकॉल की धारा 6 देखें ।
  2. प्लेस एक पेट्री डिश में दंत मोम की एक साफ चादर पर 2% के कई व्यक्तिगत बूंदें UA ।
  3. 25 मिनट के लिए UA की एक बूंद पर नमूना (अनुभाग की ओर नीचे) के साथ ग्रिड फ्लोट ।
    नोट: UA की एक अलग बूंद पर प्रत्येक ग्रिड फ्लोट ।
  4. संदंश के साथ अपने किनारे पर ग्रिड पकड़ो और एक प्लास्टिक धोने की बोतल से कमरे के तापमान पर उबला हुआ आसुत पानी के एक सज्जन जेट के तहत दो बार कुल्ला ।
    नोट: ग्रिड को सीसा के साथ धुंधला होने से पहले सूखने न दें ।

13. पोस्ट-लीड के साथ धुंधला

  1. एक CO2-मुक्त चैंबर तैयार (सीओ2 हवा में नेतृत्व वर्षण का प्राथमिक स्रोत है) । एक पेट्री डिश में 1 N NaOH के साथ लथपथ फिल्टर कागज का एक टुकड़ा रखें । फिल्टर कागज के शीर्ष पर साफ दंत मोम की एक छोटी सी चादर प्लेस और पकवान के एक तरफ कई NaOH छर्रों जगह है । डिश को ढंक दें ।
    नोट: इस सेटअप को तैयार करने से पहले ग्रिड UA के साथ दाग रहे हैं, ताकि चैंबर में वातावरण2 सीओ से मुक्त है और समय ua धुंधला द्वारा नेतृत्व धुंधला के लिए तैयार है पूरा हो गया है ।
  2. 4% NaOH बनाओ । आसुत जल के 5 मिलीलीटर के लिए NaOH के ०.२ ग्राम जोड़ें ।
  3. सातो के ट्रिपल लीड सॉल्यूशन को तैयार करें । 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, एक गिलास बोतल में सीसा नाइट्रेट के ०.१ जी, सीसा साइट्रेट के ०.१ ग्राम, सीसा एसीटेट की ०.१ ग्राम और सोडियम साइट्रेट की ०.२ जी जोड़ें । आसुत पानी के ८.२ मिलीलीटर जोड़ें और तेजी से हिला के लिए 5 मिनट के लिए 30 एस Sonicate, तो जोड़ें हौसले से 4% NaOH के १.८ मिलीलीटर ।
  4. पेट्री डिश में मोम पर सातो की लीड की कई बूंदें रखें ।
  5. सीसा की बूंद पर UA (अनुभाग की ओर नीचे) के साथ दाग ग्रिड प्लेस ।
    नोट: प्रत्येक ग्रिड नेतृत्व की एक अलग बूंद पर मंगाई जानी चाहिए । प्रत्येक बूंद के लिए ग्रिड के बजाय पक्षों पर नीचे फिसलने के ड्रॉप के गुंबद के शीर्ष पर तैरने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए ।
  6. डिश को ढककर 5 मिनट के लिए दाग दें ।
  7. संदंश के साथ अपने किनारे पर ग्रिड पकड़ो और एक प्लास्टिक धोने की बोतल से कमरे के तापमान पर उबला हुआ आसुत पानी की एक सज्जन जेट के तहत अच्छी तरह से धोने ।
  8. धब्बा फिल्टर कागज पर ग्रिड सूखी और ग्रिड की दुकान ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अनुभाग फ़िल्टर काग़ज़ के सीधे संपर्क में नहीं आता है ।

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Representative Results

सामान्य मापदंड जो अधिकांशतः संतोषजनक या दोषपूर्ण नमूने के संरक्षण के संकेत के रूप में स्वीकार किए जाते हैं, उन्हें स्थापित किया गया है । इन मापदंडों चार चयनित इलेक्ट्रॉन micrographs (इष्टतम तैयारी के दो उदाहरण हैं, दोषपूर्ण तैयारी के दो उदाहरण) है कि युवा चूहा मस्तिष्क के ऊतकों के इलाज के द्वारा इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का पालन करके प्राप्त किया गया में उदाहरण हैं ।

सामान्य रूप में, एक अच्छी गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एक व्यवस्थित, अलग और समग्र भूरे रंग की छवि के रूप में प्रकट होता है । एक संतोषजनक रूप से तैयार नमूने में, झिल्ली के बीच के स्थान को दानेदार सामग्री से भरा जाना चाहिए, और खाली नहीं होना चाहिए । इसी प्रकार किसी रिक्त स्थान को कोशिकाद्रव्यी भूमि पदार्थ या अंगकों में नहीं पाया जाना चाहिए (चित्र 1ए तथा चित्र 2A की तुलना अंक 3 तथा अंक 4के साथ कीजिए) । फिर भी, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि बहुत युवा जानवरों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, जब वयस्क मस्तिष्क की तुलना में extracellular रिक्त स्थान की वृद्धि की एक निश्चित डिग्री से पता चलता है, कोशिकाओं और एक समग्र whiter, कम के बीच लूजर कनेक्शन के साथ इलेक्ट्रॉन-सघन दिखावट । झिल्लियाँ निरंतर होनी चाहिए, बिना विकृति या टूटना (चित्र 1 क और चित्र 2a) । माइटोकॉन्ड्रिया का स्ट्रोमा एक समान और घना दिखाई देना चाहिए, जिसमें खाली जगह नहीं है । Cristae बरकरार है और सूजन नहीं होना चाहिए, और माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी दोहरी झिल्ली अटूट होना चाहिए (चित्रा 3के साथ चित्र 1a की तुलना) । पूर्व synaptic आशय संगठन, पूर्व और बाद synaptic झिल्ली के morphometric विश्लेषण की सुविधा के लिए बरकरार है और अनिवार्य रूप से एक दूसरे के समांतर की जरूरत है ( 1 चित्रादेखें) । Synaptic पुटिकाओं का पता लगाने और एक सतत एकल झिल्ली से बंधे होना चाहिए ( चित्रा 2देखें).

महत्वपूर्ण बात, यहां तक कि जब सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन कर रहे हैं, fixatives के साथ नमूना के उपचार, दाग और रेजिन कलाकृतियों परिचय । चूंकि कलाकृतियों को समाप्त नहीं किया जा सकता, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि कौन सी प्रक्रिया उन्हें उत्पन्न करती है, ताकि नमूने की उपस्थिति को उस उपचार के संबंध में प्रतिपादित किया जा सके जो यह12से गुजरा था । एक विरूपण साक्ष्य का एक उदाहरण-कई के बीच है कि tem के लिए नमूना तैयार करने के दौरान उत्पन्न किया जा सकता है-एक myelin आंकड़ा, एक झिल्ली पटलित शामिल है कि myelin आवरण जैसा दिखता है. हालांकि myelin आंकड़े रोगविज्ञान की स्थिति में देखा जा सकता है12, वे सबसे अक्सर aldehydes के साथ निर्धारण के दौरान झिल्ली लिपिड के निष्कर्षण से परिणाम ( चित्रा 4देखें) ।

Figure 1
चित्र 1: कोशिका संरचना के संतोषजनक परिरक्षण का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रतिनिधि (उदाहरण 1) । (क) तंत्रिकीय कोशिका झिल्लियां स्तरित और बिना ब्रेक के होती हैं । कोशिकाद्रव्य सूक्ष्मता बारीक और बिना खाली स्थान के होता है । माइटोकॉन्ड्रिया न तो सूखता है और न ही सिकुड़ जाता है । उनकी बाहरी दोहरी झिल्ली संरक्षित है, और आंतरिक cristae बरकरार हैं । (ख) पूर्व-synaptic झिल्ली से synaptic पुटिकाओं की दूरी को मापने के लिए एक विधि एक उदाहरण के लिए, पैनल A का विस्तार । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: कोशिका संरचना के संतोषजनक परिरक्षण का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रतिनिधि (उदाहरण 2) । (क) सिन्पाटिक पुटिकाओं का अलग और एक अटूट एकल झिल्ली द्वारा पंक्तिवाला है । Synaptic पुटिका वितरण, पूर्व synaptic और बाद synaptic झिल्ली के morphometric विश्लेषण की अनुमति देने के लिए समानांतर होने की जरूरत है और उनके निरंतरता संरक्षित । (ख) पूर्व-synaptic टर्मिनल के भीतर synaptic पुटिकाओं की गिनती की एक मिसाल, पैनल ए का विस्तार । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ऊतक संरचना के दोषपूर्ण परिरक्षण का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रतिनिधि (उदाहरण 1) । विरूपण और न्यूरोनल कोशिका झिल्ली के टूटना और स्पष्ट रूप से बढ़े हुए extracellular रिक्त स्थान की उपस्थिति नोट (* के साथ चिह्नित) । माइटोकॉन्ड्रिया डिस्टेंडेड दिखाई देता है और (तीर के साथ चिह्नित) cristae सूजन है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: ऊतक संरचना के दोषपूर्ण परिरक्षण का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रतिनिधि (उदाहरण 2) । कोशिका द्रव्य के भीतर बड़ी सफेद खाली रिक्त स्थान की उपस्थिति नोट (ǂ के साथ चिह्नित), पतले दानेदार साइटोप्लाज्मिक पदार्थ के स्थान पर. कोशिकाबाह्य रिक्त स्थान बढ़े हुए दिखाई देते हैं । एक कृत्रिम झिल्लीदार चक्क (माइलिन फिगर), जो ग्लूटार्ऐल्डिहाइड के साथ निर्धारण के दौरान लिपिडों के संघटन के कारण उत्पन्न होने की संभावना है, को परिवर्णी शब्द एमएफ से चिह्नित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

टीईएम के लिए नमूना तैयार करने के दौरान ऊतक वर्गों के हैंडलिंग में चालाकी, एकाग्रता और धैर्य की काफी मात्रा की आवश्यकता होती है । समाधान जोड़ने और निकालने के लिए एक micropipette का उपयोग करते हैं, नमूनों सतह तनाव से पिपेट टिप में चूसा जा सकता है, तो बहुत सावधानी पिपेट द्वारा ऊतक क्षति से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । इसके अलावा, निर्जलीकरण अनुक्रम के कुछ कदम के रूप में 1 मिनट के रूप में जल्दी हो सकता है, इसलिए ऑपरेटर के लिए तेजी से काम करने के लिए सुनिश्चित करें कि अगले निर्जलीकरण कदम समय पर शुरू कर दिया है और नमूना सूखी या शिकन नहीं करता है की जरूरत है । एक प्रक्रिया है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है osmium के साथ बाद निर्धारण है । वर्गों आज़मियम के साथ उपचार के बाद कठोर हो जाते है और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । Osmium जोड़ने से पहले, यह आवश्यक है कि वर्गों के शीशी के तल पर चपटा है, और किसी भी तह ऊतक फ्रैक्चर में परिणाम होगा । Osmicated ऊतक की हैंडलिंग विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है जब फ्लैट embedding के लिए aclar फिल्मों पर वर्गों के हस्तांतरण । विशेष देखभाल की जरूरत है जब शीशी के नीचे से नमूना उठाने के विखंडन से बचने के लिए, और जब फिल्म सैंडविच के बाहर हवा बुलबुले धक्का । हालांकि यह बाहर किसी भी फंस हवा धक्का महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह मुश्किल नमूना के दृश्य बनाता है और राल बांड की स्थिरता को कमजोर, osmicated ऊतक पर सीधा दबाव आसानी से नुकसान दण्ड दे सकते हैं । एक और कदम है कि अतिरिक्त देखभाल आवश्यक है नमूना घुसपैठ और embedding के लिए राल मिश्रण की तैयारी है । EPON, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया embedding राल, एक hardener और एक त्वरक के अलावा के साथ कठोर किया जा सकता है । यह वांछित विशेषताओं के साथ एक ठीक ब्लॉक प्राप्त करने के क्रम में हार्डनर और त्वरक की सटीक राशि का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । चिपचिपा रेजिन मापने के लिए दोनों भारात्मक और आयतनी तरीकों का वर्णन किया गया है । हालांकि भारात्मक तरीकों को पारंपरिक रूप से अधिक12सटीक माना जाता है, इस लेखक की प्रयोगशाला आयतनी मोड के साथ अच्छी सफलता मिली है (यानी, एक gavage सिरिंज के माध्यम से राल मिश्रण संवर्द्धित के प्रत्येक घटक की मात्रा जोड़ने) . बाद राल घटकों को ध्यान से मापा गया है, वे बहुत अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए करने के लिए वर्दी गर्भाधान पूरा, क्योंकि वे अलग viscosities और बहुलकीकरण की दर के अधिकारी । पूर्ण मिश्रण को प्राप्त करने में विफलता असमान कठोरता है कि पतली sectioning के लिए अनुपयुक्त है की एक ब्लॉक में परिणाम होगा ।

युवा चूहे मस्तिष्क के अनुभागों को संसाधित करने के लिए उपयोग किए गए समाधानों की tonicity में चिह्नित परिवर्तन संकुचन और/या extracellular अंतरिक्ष और सेलुलर घटकों के सूजन पैदा कर सकता है12,३५,३६,३७ . निर्धारण के दौरान, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब perfusate दबाव के रूप में एक ही अध्ययन के तहत ऊतक के लिए संभव के रूप में रखा जाता है । चूहा मस्तिष्क परासरणीयता लगभग ३३० mosm है । ०.१ मीटर पीबी समाधान में एक 2% ग्लूटार्ऐल्डिहाइड केवल थोड़ा अतिपरासारी (400-450 mOsm) है और बहिर्वैस्कुलर अंतरिक्ष12के विस्तार को कम करता है । विशेष रूप से, झिल्ली aldehydes के साथ निर्धारण के बाद rinsing और निर्जलीकरण समाधान के परासरण दबाव में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील रहते हैं । इसलिए, यह भी लगानेवाला के परासारिता और बाद में इस्तेमाल किया समाधान के बीच मतभेदों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है12,३५,३६,३७. इस कारण से, एक ही वाहन (०.१ मीटर पीबी, लगभग परासारिता ४४० mosm) इस प्रोटोकॉल में सभी समाधानों के लिए एक विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई अलग बफ़र्स सफलतापूर्वक tem के लिए नमूना तैयार करने के दौरान इस्तेमाल किया गया है और कोई एकल बफर दूसरों पर सार्वभौमिक श्रेष्ठता का दावा कर सकते हैं । जब कम tonicity के बफ़र्स पसंद कर रहे हैं, अन्य प्रयोगशालाओं इलेक्ट्रोलाइट्स या गैर इलेक्ट्रोलाइट्स12के साथ परासारिता को बढ़ाने के लिए चुना है.

इस प्रोटोकॉल में कई कदम रसायनों के उपयोग की आवश्यकता है कि विषाक्त हो सकता है जब ठीक से संभाला नहीं है । एक धूआं हुड के तहत काम करने का महत्व और aldehydes, osmium, यूरेनियम और सीसा यौगिकों हैंडलिंग जबकि व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहने overstated नहीं किया जा सकता है । जबकि स्वचालित विषम प्रणाली की मदद कर सकते है जोखिम के कुछ attenuate और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वे काफी महंगा हो सकता है और प्रयोगशालाओं कि TEM के नियमित उपयोग नहीं करते द्वारा सस्ती नहीं हो सकता है । हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप प्रयोगशाला संभावित एक खतरनाक जगह हो सकती है, TEM के लिए नमूना प्रसंस्करण समग्र सुरक्षित जब कड़ाई से किया जाता है ।

हाल ही में, सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी की शुरुआत के बारे में 15 एनएम३४ऑप्टिकल इमेजिंग समाधान शक्ति में वृद्धि हुई है । हालांकि, जब लक्ष्य पूर्व synaptic टर्मिनलों पर synaptic आशय स्थानिक संगठन के morphometric विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए है, कोई तकनीक morphometric विस्तार की एक ही डिग्री प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात, TEM नमूना के लिए जरूरत से सीमित करने से पहले यह संसाधित किया जा सकता है और कल्पना मर चुका है । इसलिए, जब अध्ययन उद्देश्य synaptic आशय की तस्करी और exocytosis के गतिशील या कार्यात्मक पहलुओं की जांच करने के लिए है, TEM के अलावा अंय उपकरणों पर विचार किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि NIH द्वारा समर्थित किया गया/K08 १२३३२१ (करने के लिए N.L.) और वर्जीनिया के विश्वविद्यालय में Anesthesiology के विभाग से धन के द्वारा । लेखकों को उत्कृष्ट प्रशिक्षण और TEM के साथ तकनीकी सहायता, और उसके अमूल्य पांडुलिपि आलोचना के लिए के लिए Alev (जीव विज्ञान, वर्जीनिया, Charlottesville, VA के विश्वविद्यालय के विभाग) शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । लेखक भी नमूना परिच्छेदन और बाद धुंधला के साथ तकनीकी सहायता के लिए वर्जीनिया विश्वविद्यालय में उंनत इलेक्ट्रॉन microscopy सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19170 acqueous
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16310 EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film Electron Microscopy Sciences 50425-25 7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder Electron Microscopy Sciences 69916 holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules Electron Microscopy Sciences 70021 "size 00, flat (cut bottom)"
Butler block trimmer Electron Microscopy Sciences 69945-01
Camel hair paint brush Electron Microscopy Sciences 65576-01
Disc punch Electron Microscopy Sciences 77850-09
Embed 812 kit Electron Microscopy Sciences 14120
Lead acetate Electron Microscopy Sciences 17600
Lead citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Lead nitrate Electron microscopy Sciences 17900
Leica UC7 ultracut microtome Leica
Micro scale Electron Microscopy Sciences 62091-23
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19208 EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven Thelco 51221159
Sodium azide Sigma-Aldricht S2002
StatMark pen Electron Microscopy Sciences 72109-01
Tyrode solution Electron Microscopy Sciences 11760-05
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400 powder

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४८ ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मस्तिष्क निर्धारण संवहनी छिड़काव भारी धातु धुंधला राल embedding अनुक्रमिक निर्जलीकरण इसके विपरीत osmium यूरेनिल एसीटेट सीसा
तंत्रिका टर्मिनलों पर Synaptic आशय वितरण के Ultraस्ट्रक्चरल Morphometric विश्लेषण के लिए नवजात चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी
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Ferrarese, B., Lunardi, N.… More

Ferrarese, B., Lunardi, N. Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals. J. Vis. Exp. (148), e59694, doi:10.3791/59694 (2019).

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