El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Descubrimiento de producto natural con filtrado de fragmentación de diagnóstico LC-MS/MS: aplicación para análisis de Microcystin
En este artículo
Resumen
Resumen
Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares, en lugar de un solo compuesto. Debido a sus características estructurales comunes, muchos compuestos dentro de la misma clase se someten a una fragmentación MS/MS similar y tienen varios iones de producto idénticos y/o pérdidas neutrales. El propósito del filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF) es detectar eficientemente todos los compuestos de una clase dada en un extracto complejo mediante el cribado de datasets LC-MS/MS no dirigidos para espectros MS/MS que contengan iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales. Este método se basa en un módulo DFF implementado dentro de la plataforma MZmine de código abierto que requiere que los extractos de muestra sean analizados mediante la adquisición dependiente de los datos en un espectrómetro de masas de alta resolución, como Orbitrap cuadrupolo o masa de tiempo de vuelo cuadrupolo Analizadores. La principal limitación de este enfoque es que el analista primero debe definir qué iones de producto y/o pérdidas neutrales son específicos para la clase específica de productos naturales. DFF permite el descubrimiento posterior de todos los productos naturales relacionados dentro de una muestra compleja, incluyendo nuevos compuestos. En este trabajo, demostramos la efectividad de la DFF mediante el cribado de extractos de Microcystis aeruginosa, una prominente floración de algas dañina que causa cianobacterias, para la producción de microcistina.
Introducción
LA espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método de espectrometría de masas ampliamente utilizado que implica aislar un ion precursor e inducir la fragmentación mediante la aplicación de energía de activación como la disociación inducida por colisión (CID)1. La forma en que un fragmento de iones está íntimamente ligado a su estructura molecular. Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares en lugar de como un único químico único2. Como tal, compuestos estructuralmente relacionados que son parte de la misma clase biosintética a menudo comparte....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. preparación de los datasets de cromatografía líquida no objetivo (LC)-MS/MS
Nota: DFF se puede realizar utilizando cualquier espectrómetro de masas de alta resolución y un método analítico optimizado para una clase objetivo de analitos. Las condiciones de LC-MS/MS optimizadas para MC en el espectrómetro de masas Orbitrap se enumeran en la tabla de materiales.
-
Descargar MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Nota: los datos de ejemplo CPCC300. Raw se pueden encontrar en https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- En el menú desplegable métodos de datos ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La gráfica DFF generada tras el análisis de M. aeruginosa CPCC300 se muestra en la figura 4. El eje xde esta gráfica es el m/z de los iones precursores que satisfacen los criterios definidos de DFF, mientras que el eje ymuestra el m/z de todos los iones de producto dentro de los espectros de MCS MS/MS. Para este análisis, los criterios para la detección de MC incluyeron iones precursores dentro del rango m/z
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La DFF es una estrategia rápida y directa para detectar clases enteras de compuestos, especialmente relevantes para el descubrimiento compuesto de productos naturales. El aspecto más importante de DFF es definir los criterios específicos de fragmentación de MS/MS para la clase de compuestos específica. En este ejemplo representativo, DFF se usó para detectar todos los residuos de Adda que contienen MCs presentes en un extracto celular de M. aeruginosa . Aunque la gran mayoría de los MCs contienen un residuo de A.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Los autores agradecen a Heather Roshon (centro de cultura phycological canadiense, Universidad de Waterloo por proporcionar la cultura de las cianobacterias estudiadas y Sawsan Abusharkh (Universidad de Carleton) para la asistencia técnica.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cianobacterias | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CENTRO CANADIENSE DE CULTIVO FICOLÓGICO | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ | |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Termoequipado | con fuente de ionización HESI | |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipado con bomba binaria, muestreador automático, compartimiento de columna | |
| Columna | C18Columna Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD (2,1 y veces; 100 mm, 1,8 y mu; m) |
| fuertes | |||
| Optima Grado LC-MS Metanol | Fisher | A456-4 | |
| Acetonitrilo de grado OptimaLC-MS | Fisher | A955-4 | |
| Grado OptimaLC-MS | Agua Fisher | W6-4 | |
| Grado LC-MS Ácido fórmico | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrífuga Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Otro | |||
| ámbar viales de HPLC 2 mL/tapones | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μ m Filtros de jeringa de PTFE | Pall Corp. | 4521 | |
| Filtros de microfibra de vidrio Whatman 47mm GF/A | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( cantidad / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Efectos de los factores ambientales sobre la toxicidad de una cianobacteria (Microcystis aeruginosa) en condiciones de cultivo. Microbiología Aplicada y Ambiental. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)· 4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2· 6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Glicerofosfato de sodio, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) fuerte, 5 mL | |||
| Lleve lo siguiente a 1 L con ddH2O | |||
| NaEDTA· 2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 · 6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2· 4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4· 2H2O | Baker | 3764 | |
| Cianobacterias BG-11 50X Solución de agua dulce | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
Referencias
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
