Summary
Le filtrage de fragmentation diagnostique, implémenté dans MZmine, est une approche élégante et post-acquisition pour filtrer les jeux de données LC-MS/MS pour des classes entières de produits naturels connus et inconnus. Cet outil recherche les spectres MS/MS pour les ions produits et/ou les pertes neutres que l’analyste a définies comme étant diagnostiques pour l’ensemble de la classe de composés.
Abstract
Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires, plutôt qu’un seul composé. En raison de leurs caractéristiques structurelles communes, de nombreux composés au sein de la même classe subissent une fragmentation MS/MS similaire et ont plusieurs ions de produit identiques et/ou des pertes neutres. Le but du filtrage de fragmentation diagnostique (DFF) est de détecter efficacement tous les composés d’une classe donnée dans un extrait complexe en criblant des jeux de données LC-MS/MS non ciblés pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres. Cette méthode est basée sur un module DFF implémenté dans la plate-forme open-source MZmine qui nécessite l’analyse d’extraits d’échantillons par acquisition dépendante des données sur un spectromètre de masse à haute résolution tel que l’Orbitrap quadrupolaire ou la masse de temps de vol quadrupolaire Analyseurs. La principale limitation de cette approche est l’analyste doit d’abord définir quels ions de produit et/ou pertes neutres sont spécifiques pour la classe ciblée de produits naturels. DFF permet la découverte subséquente de tous les produits naturels connexes dans un échantillon complexe, y compris les nouveaux composés. Dans ce travail, nous démontrons l’efficacité de la DFF en criblant des extraits de Microcystis aeruginosa, une floraison algale nocive importante causant des cyanobactéries, pour la production de microcystines.
Introduction
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est une méthode de spectrométrie de masse largement utilisée qui consiste à isoler union précurseur et à induire la fragmentation par l’application d’énergie d’activation telle que la dissociation induite par collision (CID)1. La manière dont un fragment d’ion est intimement lié à sa structure moléculaire. Les produits naturels sont souvent biosynthétisés comme des mélanges de composés structurellement similaires plutôt que comme un seul produit chimique unique2. En tant que tels, les composés structurellement apparentés qui font partie de la même classe biosynthétique partagent souvent les principales caractéristiques de fragmentation des MS/MS, y compris les ions de produit partagés et/ou les pertes neutres. La capacité à échantillonne des échantillons complexes pour des composés qui possèdent des ions de produit spécifiques à la classe et/ou des pertes neutres est une stratégie puissante pour détecter des classes entières de composés, conduisant potentiellement à la découverte de nouveaux produits naturels3, le 4 , 5 la plupart des , 6. pendant des décennies, des méthodes de spectrométrie de masse telles que la numérisation des pertes neutres et l’analyse des ions précurseurs effectuées sur des instruments à faible résolution ont permis de détecter les ions ayant les mêmes ions de perte ou de produit neutre. Cependant, les ions ou les transitions spécifiques devaient être définis avant d’effectuer les expériences. Comme les spectromètres de masse à haute résolution sont devenus plus populaires dans les laboratoires de recherche, les échantillons complexes sont maintenant couramment examinés en utilisant des méthodes d’acquisition non ciblées, dépendantes des données (DDA). Contrairement à la perte neutre traditionnelle et à la numérisation des ions précurseurs, les composés structurellement apparentés peuvent être identifiés par l’analyse post-acquisition7. Dans ce travail, nous démontrons une stratégie que nous avons développée appelée filtrage de fragmentation diagnostique (DFF)5,6, une approche simple et conviviale pour détecter des classes entières de composés dans des matrices complexes. Ce module DFF a été mis en œuvre dans la plate-forme open-source, MZmine 2 et disponible en téléchargeant MZmine 2,38 ou des versions plus récentes. DFF permet aux utilisateurs d’écran efficacement les jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent des ions de produit (s) et/ou des pertes neutres qui sont diagnostiques pour des classes entières de composés. Une limitation de DFF est des ions produits caractéristiques et/ou des pertes neutres pour une classe de composés doivent être définies par l’analyste.
Par exemple, chacune des plus de 60 différentes mycotoxines fumonisines identifiées8,9 possèdent une chaîne latérale tricarballylic, qui génère union de produit m/z 157,0142 (C6H5O5-) sur fragmentation du [M-H]- ion4. Par conséquent, toutes les fumonisines putatives d’un échantillon peuvent être détectées à l’aide de DFF en criblant tous les spectres MS/MS dans un jeu de données DDA contenant l’ion de produit m/z 157,0142 en évidence. De même, les composés sulfatés peuvent être détectés en criblage de jeux de données DDA pour les spectres MS/MS qui contiennent une perte diagnostique neutre de 79,9574 da (SO3)3. Cette approche a également été appliquée avec succès pour la détection de nouveaux peptides cycliques5 et des produits naturels qui contiennent des résidus de tryptophane ou de phénylalanine6.
Pour démontrer l’efficacité de la DFF et sa facilité d’utilisation au sein de la plate-forme MZmine10, nous avons appliqué cette approche à l’analyse des microcystines (MCS); une classe de plus de 240 toxines structurellement apparentées produites par les cyanobactéries d’eau douce11,12,13.
Les cyanotoxines les plus couramment signalées sont des MCs, avec le congénère MC-LR (leucine [L]/arginine [R]) le plus fréquemment étudié (figure 1). Les MCs sont des heptapeptides monocycliques non ribosomiques, biosynthétisés par plusieurs genres de cyanobactéries, dont Microcystis, Anabaena, Nostoc et Planktothrix12,13. Les MCs sont composés de cinq résidus communs et de deux positions variables occupées par les acides aminés L. Presque tous les MCs possèdent un résidu caractéristique de l’acide β-amino-3-amino-9-méthoxy-2, 6, 8-triméthyl-10-phényldéca-4, 6-diénoïque (Adda) à la position 511. Les voies de fragmentation MS/MS des MCS sont bien décrites14,15; le résidu Adda est responsable de l’ion de produit MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), ainsi que d’autres ions produits, y compris m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figure 2). Les ensembles de données DDA non ciblés des extraits cellulaires de Microcystis aeruginosa peuvent être examinés pour toutes les microcystines présentes à l’aide de ces ions diagnostiques, étant donné que les microcystines ont un résidu Adda.
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Protocol
1. préparation des ensembles de données de chromatographie en phase liquide non ciblées (LC)-MS/MS
Remarque: le DFF peut être effectué à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution et d’une méthode analytique optimisée pour une classe cible d’analytes. Les conditions LC-MS/MS optimisées pour MC sur le spectromètre de masse Orbitrap sont répertoriées dans le tableau des matériaux.
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Téléchargement de MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Remarque: les exemples de données CPCC300. RAW peuvent être trouvés à https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- Dans le menu déroulant méthodes de données brutes , sélectionnez l’option d' importation de données brutes .
- Choisissez le ou les fichiers de données à analyser. Des fichiers simples ou multiples peuvent être importés.
- Facultatif Si le format de données fournisseur n’est pas pris en charge par MZmine, utilisez Proteowizard16 pour générer des fichiers de données. mzml centrorespectés.
- Choisissez le filtre de prélèvement maximal pour appliquer l’algorithme de centrorespect fourni par le fournisseur.
2. filtrage de fragmentation diagnostique des fichiers DDA importés
- À l’aide du curseur, sélectionnez et mettez en surbrillance le ou les fichiers de données dans la colonne fichiers de données brutes de l’écran principal de mzmine.
- Dans le menu déroulant visualisation , sélectionnez l’option filtrage de fragmentation de diagnostic .
- Dans la boîte de dialogue DFF qui apparaît (figure 3), entrez les options suivantes:
- Durée de rétention – utilisez la plage automatique ou définissez la plage de durées de rétention en minutes lorsque la classe ciblée d’analytes est éluute.
- Précurseur m/z -utilisez la gamme auto ou définissez la plage m/z de la classe ciblée d’analytes, y compris la possibilité de plusieurs composés chargés, le cas échéant.
- m/z tolérance – entrez la précision de masse MS/MS réalisable du MSinstrument; 0,01 m/z ou 3,0 ppm est approprié pour une plate-forme Orbitrap. Si seuls les ions de produit de diagnostic seront étudiés, entrez 0,0 dans l’option valeur de perte neutre diagnostique (DA) . Inversement, si seules les pertes de diagnostic neutres seront étudiées, entrez 0,0 dans l’option ions du produit de diagnostic (m/z) .
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Ions de produit de diagnostic (m/z) – entrée l’ion (s) de produit spécifique à la classe m/z. Séparez plusieurs ions de produit par une virgule.
Remarque: la saisie de plusieurs ions de produit visualisera les spectres qui contiennent tous les ions de produit répertoriés. -
Valeur de perte neutre diagnostique (DA) – entrez la ou les pertes neutres spécifiques à la classe. Séparez plusieurs pertes neutres par une virgule.
Remarque: la saisie de plusieurs pertes neutres visualisera les spectres qui contiennent toutes les pertes neutres répertoriées. En entrant les deux ions de produit diagnostique et les pertes neutres visualiseront les spectres qui satisfont à tous les critères. - Intensité minimale de l’ion diagnostique (% crête de base) – en% du pic de base des spectres MS/MS, définir l’intensité minimale pour les ions de produit diagnostique et/ou les pertes neutres à prendre en considération.
- Fichier de sortie Peaklist – sélectionnez un chemin d’accès et un nom pour afficher les résultats.
- Cliquez sur le bouton OK pour démarrer l’analyse de la DFF. Un tracé DFF apparaîtra après avoir terminé avec succès les étapes ci-dessus
Remarque: deux fichiers de données. csv seront générés. {Fichier de sortie Peaklist}. csv contient le précurseur m/z, les numéros de balayage et les temps de rétention des scans. Cela peut être utilisé dans les modules MZmine existants, y compris les méthodes de données brutes > détection de crête > détection de crête ciblée pour générer des chromatogrammes d’ions extraits de précurseurs qui satisfaisaient aux critères de DFF définis. {Fichier de sortie Peaklist} _ Data. csv contient le précurseur m/z, l’ion de produit m/z et les durées de rétention pour permettre la génération de parcelles DFF en dehors de mzmine.
3. exemple d’utilisation du DFF pour l’analyse de la microcystine
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Préparation de l’échantillon
- Stériliser 250 mL de flacons d’erlenmeyer contenant 30 mL de milieux stériles MA17 ou d’autres milieux de croissance de cyanobactéries (BG-11) munis d’un bouchon en mousse.
- Ensemencez des milieux de croissance stérilisés avec une culture de cyanobactéries à environ 5 × 105 cellules ml-1 dans des conditions aseptiques. Surveillez la densité des cellules avec un hémocytomètre. Dans cet exemple, cultiver la souche M. aeruginosa CPCC300 photoautotrophe à 27 ° c, éclairée par une lumière fluorescente blanche fraîche (30 μE M-2 s-1) à l’aide d’une lumière de 12 h: 12 h de régime sombre. Agiter les cellules une fois par jour.
- Séparer les cellules du milieu de culture après 26 jours par filtration sous vide à l’aide de papiers filtrants en microfibre de verre GF/C de 47 mm de diamètre.
- Ajouter 3 mL de 80% de méthanol (AQ) à des cellules récoltées dans des éprouvettes de 14 ml.
- Vortex et ensuite sonication le ou les tubes à essai contenant des cellules de cyanobactéries pendant 30 s chacun. Conserver le (s) tube (x) d’essai à-20 ° c pendant 1 h. Retournez le tube à essai à la température ambiante et laissez le (s) échantillon (x) décongeler pendant 15 min.
- Répétez l’étape 3.1.5 deux fois supplémentaires pour lyser efficacement les cellules.
- Filtrer les extraits de cellules de cyanobactéries obtenues par l’intermédiaire d’un (des) filtre (s) de seringue PTFE de 0,22 μM.
- Extrait sec (s) avec un évaporateur à une température de 30 ° c à l’aide d’un flux doux de gaz azoté. Conserver l’extrait sec à-20 ° c jusqu’à l’analyse LC-MS/MS.
- Reconstituer le résidu séché avec 500 μL de 90% de méthanol (AQ) et le Vortex pendant 30 s dans un flacon HPLC ambre avant l’analyse.
- Analyser l’extrait de cyanobactéries à l’aide d’une méthode d’acquisition DDA sur un spectromètre de masse à haute résolution.
Remarque: les conditions optimisées de LC-MS pour l’analyse de MC utilisées ici sont répertoriées dans le tableau des matériaux. - Préparez les fichiers de datadata DDA et importez-les dans MZmine en suivant les étapes 1,1 et 1,2.
- Sélectionnez les fichiers de dataet démarrez les modules DFF en suivant les étapes 2.1 à 2.2.
- Pour l’analyse MC, utilisez les paramètres suivants dans le module DFF (figure 3).
- Temps de rétention – entrez la plage de 2,00 à 6,00 min.
- Précurseur m/z – entrée m/z plage de 430,00 à 1200,00.
- m/z tolérance – appliquez la tolérance m/z de 0,01 m/z ou 3,0 ppm.
- Ions de produit diagnostique (m/z) – entrée m/z de 135,0803, 163,1114 comme les ions de produit diagnostique
- Valeur de perte neutre diagnostique (DA) – Input 0,0 pour définir qu’aucune perte de diagnostic neutre n’est utilisée.
- Intensité minimale de l’ion diagnostique (% crête de base) – utiliser 15,00 comme seuil d’intensité minimum
- Fichier de sortie Peaklist – définissez le fichier de sortie en tant que putative_MCs. csv.
- Cliquez sur le bouton OK pour démarrer l’analyse de la DFF. Un tracé de DFF (figure 4) apparaîtra après avoir terminé avec succès les étapes ci-dessus
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Representative Results
Le tracé DFF généré suite à l’analyse de M. aeruginosa CPCC300 est illustré à la figure 4. L’axe xde cette parcelle est le m/z des ions précurseurs qui satisfont aux critères DFF définis tandis que l’axe ymontre le m/z de tous les ions de produit dans les spectres MS/MS MCS. Pour cette analyse, les critères de détection des MC comprenaient des ions précurseurs dans la gamme m/z de 440-1200, des durées de rétention comprises entre 2,00 et 6,00 min. Plus important encore, ces spectres MS/MS contiennent à la fois m/z 135,0803 et 163,1114 (± 3 ppm) au-dessus du seuil d’intensité du pic de base défini à 15%. Dans ces conditions, un total de 4116 spectres MS/MS ont été acquis au cours de l’analyse LC-MS/MS DDA. De ceux-ci, 26 spectres satisfaits des critères de DFF ont été détectés dans l’extrait de M. aeruginosa CPCC300. Cependant, plusieurs spectres MS/MS peuvent être acquis sur le même composé, en particulier pour les ions d’intensité plus élevée. Dans cet extrait, seulement 18 précurseurs uniques m/z ont été trouvés. Le plus petit ion (m/z 497,2746, [m + 2H]2 +) est le complément doublement chargé de la [m + H]+ précurseur m/z 993,5389, qui a également été détecté par DFF. Sur la base des études précédemment publiées sur cette souche18de M. aeruginosa , les principaux MCS détectés peuvent être attribués en toute confiance en tant que MC-LR et [D-ASP3] MC-LR. L’étude des spectres de masse des autres MCs putatifs a révélé que deux étaient des isotopes de 13C d’autres MCS détectés (m/z 993,5389, 1025,5343) et qu’un autre était un ADDUIT et un MC de m/z 993,5389. Sur les 12 MCs putatifs restants, quatre correspondaient aux masses de MCs connues et huit étaient des composés antérieurement non déclarés (dossier supplémentaire. Tableau S1).
Figure 1: structure chimique de MC-LR. Le résidu Adda est fréquent dans une grande proportion de MCs connus et produit des ions de produit diagnostique à m/z 135,0803 et 163,1114. D’autres variantes de MC contenant un résidu de diméthyl-Adda et d’acétyldeméthyl-Adda à la position 5 sont connues et ne produiront pas les mêmes ions de produit. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: spectres MS/MS de MC-LR. Les spectres MS/MS ont été acquis sur un spectromètre de masse Orbitrap montrant l’ion produit proéminent à m/z 135,0803 dérivé du résidu Adda. Union de produit additionnel à m/z 163,1114 est également dérivé du résidu Adda et augmente la sélectivité de l’analyse DFF. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: boîte de dialogue DFF dans MZmine. Les ions de produit et/ou les pertes neutres qui sont diagnostiques pour la classe ciblée de composés sont entrés. Le temps de rétention et les filtres d’ions précurseurs peuvent être utilisés pour augmenter la sélectivité de l’analyse. L’intensité minimale des ions diagnostiques fait référence à l’intensité du seuil des ions de produit diagnostique et aux pertes neutres qui doivent être atteintes pour que les spectres satisfassent aux critères de la DFF. L’abaissement de cette valeur peut entraîner des résultats faussement positifs. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: tracé de DFF pour l’analyse de MC de l' extrait cellulaire de M. aeruginosa. L’analyse DFF de l’extrait de m. aeruginosa CPCC300 a trouvé 26 spectres qui satisfaisaient aux critères DFF définis, comprenant 18 valeurs M/z uniques. Un clic droit sur le tracé permet à l’utilisateur de «dézoomer» les axes de domaine et/ou de plage. Union précurseur doublement chargé a été détecté à m/z 497,2746 et correspondait à un MC inconnu à [m + H]+ 993,5389. Les deux MCs connus produits par la souche CPCC300 sont [D-ASP3] MC-LR et MC-LR 18. Au total, huit MCS putatifs ne correspondaient pas au m/z des MCS connus, quatre MCS correspondaient au m/z de plusieurs congénères et trois étaient des isotopes/adduits d’autres MCS (dossier supplémentaire. Tableau S1). Le tracé DFF affiché ici a été généré manuellement dans Excel à partir du «putative_MCs_data. csv» qui a été automatiquement effectué lors de l’exécution du module DFF. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire. Conditions optimisées pour l’analyse LC-MS/MS des extraits de M. aeruginosa. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
DFF est une stratégie directe et rapide pour la détection de classes entières de composés, particulièrement pertinent pour la découverte de composés naturels de produits. L’aspect le plus important de la DFF est de définir les critères spécifiques de fragmentation MS/MS pour la classe ciblée de composés. Dans cet exemple représentatif, le DFF a été utilisé pour détecter tous les résidus d’Adda contenant des MCs présents dans un extrait cellulaire de M. aeruginosa . Bien que la grande majorité des MCs contiennent un résidu d’Adda, d’autres résidus à cette position ont été connus, notamment des variantes de dééthyle et d’acétyldeméthyl-Adda19. Les MCs avec ces résidus ne seraient pas détectés en utilisant les critères définis. Toutefois, comme DFF est une approche de post-acquisition, des fragments de diagnostic supplémentaires peuvent facilement être étudiés sur le même jeu de données en utilisant le protocole simple étape par étape décrit ici. Cela permet également à l’analyste de détecter des composés avec des modifications hypothétiques qui modifieraient les ions de produit diagnostique et/ou la perte neutre.
Les adduits et les fragments dans la source peuvent également répondre aux critères de DFF et être interprétés incorrectement comme des analytes uniques. Des faux positifs peuvent survenir lorsque d’autres composés présents dans l’extrait présentent les mêmes ions de produit et/ou les pertes neutres. Dans les deux cas, cela peut être atténué en utilisant des ions de produit supplémentaires et des pertes neutres qui augmentent la sélectivité de la méthode.
Bien que les ions précurseurs puissent répondre à tous les critères de DFF définis par l’analyste et représenter des composés au sein de la classe ciblée, leur identité absolue sera toujours putative. En utilisant les niveaux de confiance d’identification, proposés par Schymanski (2014), les MCs détectés à l’aide de cette approche MS/MS ont une confiance d’identification de «niveau 3» lorsque la formule moléculaire non équivoque de l’ion précurseur peut être attribuée par la masse exacte et l’isotope Profil20. Dans cet exemple, huit MCs putatifs avaient des masses qui correspondaient à de multiples MCs isobares11. L’identité absolue aurait été obtenue soit par comparaison du temps de rétention et des spectres MS/MS avec une norme authentique, soit confirmée par RMN et par d’autres méthodes spectroscopiques après purification. Les composés putatifs qui ne correspondent pas à des masses de tous les membres connus de la classe ciblée, tels que les huit MCs putatifs détectés ici, représentent des cibles tangibles pour la découverte de nouveaux produits naturels.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Les auteurs remercient Heather Roshon (Centre canadien de culture phycologique de l’Université de Waterloo pour avoir fourni la culture des cyanobactéries étudiées et sawsan Abusharkh (Université Carleton) pour l’assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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