Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.
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Artículo de método
En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.
Introducción
Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitros....
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Protocolo
1. Preparación y envejecimiento de las moscas
- Obtener o generar6 una colección de mutantes Drosophila que se utilizarán para la pantalla genética. Aquí, se utilizan líneas mutadas de ENU asignadas al segundo cromosoma y equilibradas sobre CyO.
- Amplificar las líneas experimentales del genotipo en una incubadora establecida a 25oC, ciclo claro/oscuro de 12 h en medio de melaza de harina de maíz.
- Recoger alrededor de 20 progenie homocigota entre 0-2 días de eclosión adulta de cada genotipo experimental. Elimine el sesgo sexual recogiendo constantemente moscas macho o hembra.
- Envejecer las m....
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Resultados
En esta ertícula, presentamos los pasos utilizados para identificar el tumor cerebral del gen (mocoso) como un papel en el mantenimiento de la integridad neuronal (por ejemplo, neuroprotección) en moscas adultas17; una metodología que puede utilizarse para identificar genes implicados en la neuroprotección. Utilizamos un enfoque genético hacia adelante (la estrategia se describe en la Figura 1A)para examinar a través .......
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Discusión
Las pantallas genéticas delanteras en Drosophila han sido un enfoque eficaz para identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos, incluyendo la neuroprotección dependiente de la edad5,23,24, 25. Usando esta estrategia, logramos identificar al mocoso como un gen neuroprotector novedoso17.
Un paso crítico en este.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Estamos particularmente agradecidos al Dr. Barry Ganetzky, en quién es el laboratorio de la pantalla genética que se realizó, permitiendo la identificación y caracterización del mocoso como un gen neuroprotector. Agradecemos al Dr. Steven Robinow por proporcionar amablemente la colección de moscas mutadas en uEN utilizadas en la pantalla genética presentada en este artículo. Agradecemos a los miembros del laboratorio Ganetzky, los doctores Grace Boekhoff-Falk y David Wassarman por sus útiles debates a lo largo de la duración de este proyecto, Ling Ling Ho y Bob Kreber por asistencia técnica, el Dr. Aki Ikeda para el uso de su instalación de microtome en el Un....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo principal | |||
| imágenes es 20x | |||
| Software de imagen | Nikon | ||
| Nikon | Nikon | ||
| Fly empujando y trepando assay | |||
| VWR® Frasco de Drosophila, estrecho | VWR | 75813-160 | |
| VWR® Cinta de etiquetado de laboratorio de uso general | VWR | 89097-912 | |
| Alfombrilla | |||
| Estereoscopio | Motic | Modelo SMZ-168 | |
| CO2 estación de anestesia (Pistola de soplado, válvula de pie, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn' Tanque de CO2 |
| Cepillos de punta fina | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubadora | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila línea utilizada para el mapeo de recombinación | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Línea de equilibrador de Drosophila utilizada para el mapeo de recombinación |
| Kit de deficiencia para el cromosoma 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Ácido acético glacial | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Tubos de microcentrífuga de primera calidad: 1,5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Agente de limpieza Histochoice 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Medio de montaje | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Portaobjetos de microscopio Unifrost Poly-L-Lysine, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cubreobjetos: Rectángulos | Fisherbrand | 12-545M | Dimensiones: 24 mm x 60 mm |
| Temporizador trazable | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | n.º de modelo 26025 | |
| Bandeja de portaobjetos y estanterías | DWK Life Sciences | Estantería para 20 portaobjetos | |
| Fisherbrand™ pinza extralarga de uso general | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark&comercio; Profesional | ||
| Aplicadores puritanos de 6 pulgadas | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Cuchillas de afeitar | VWR | 55411-050 | |
| Tuppers o recipientes de vidrio para líquidos de | 16 + 1 para agua corriente | ||
| Hojas de micrótomo recubiertas de alto perfil | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Cubitera redonda con tapa, 4 L | Corning™ | ||
| Vaso de precipitados | u otro recipiente para agua helada y casetes | ||
| Baño de tejidos | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtomo | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel y sistema de limpieza PCR | Promega | A9282 | |
| ex Taq ADN polimerasa | TaKaRa | 5 U/μ l | |
| Invitrogen&comercio; SYBR&comercio; Caja fuerte&comercio; Tinción de gel de ADN | Invitrogen&comercio; | ||
| UltraPure&comercio; Agarosa | Invitrogen&comercio; | ||
| 1 Kb Plus Escalera de ADN | Invitrogen&comercio; | ||
| editor de plásmidos ApE-A | Disponible para descarga gratuita | ||
| Statistical analysis | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
Referencias
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
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Reimpresiones y permisos
