Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Voksen mus siffer amputasjon og regenerering: en enkel modell for å undersøke pattedyr blastema formasjon og Intramembranous forbening

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

Summary

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus Terminal falanks amputasjon å undersøke pattedyr blastema dannelse og Intramembranous forbening, analysert av fluorescerende immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi.

Abstract

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus falanks Terminal (P3) amputasjon, en Prosedyremessig enkel og reproduserbar pattedyr modell av epimorphic gjenfødelse, som innebærer blastema dannelse og Intramembranous forbening analysert av fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi (Benvolum). Regenerering av pattedyr er begrenset til amputasjoner transecting den delen av Terminal falanks (P3). sifre amputert på mer proksimale nivåer mislykkes i å regenerere og gjennomgå antifibrotiske healing og arrdannelse. Den regenerering responsen er formidlet av dannelsen av en proliferativ blastema, etterfulgt av bein regenerering via Intramembranous forbening å gjenopprette amputert skjelett lengde. P3 amputasjon er en prekliniske modell for å undersøke epimorphic regenerering i pattedyr, og er et kraftig verktøy for utforming av terapeutiske strategier for å erstatte antifibrotiske helbredelse med en vellykket regenererende respons. Vår protokoll bruker fluorescens immunhistokjemi til 1) identifisere tidlig-og-sent blastema celle populasjoner, 2) studie revaskularisering i sammenheng med regenerering, og 3) undersøke Intramembranous forbening uten behov for komplekse bein og stabiliserings enheter. Vi demonstrerer også bruken av sekvensiell in vivo Benvolum for å lage bilder med høy oppløsning for å undersøke morfologiske endringer etter amputasjon, i tillegg til å kvantifisere volum-og lengde endringer i samme siffer i løpet av regenerering. Vi tror denne protokollen tilbyr enorm nytte å undersøke både epimorphic og vev regenererende svar i pattedyr.

Introduction

Pattedyr, inkludert mennesker og mus, har kapasitet til å regenerere tuppen av sine sifre etter en slik amputasjon av Terminal falanks (P3)1,2,3. I mus, den regenerering responsen er amputasjon-nivå-avhengig; stadig proksimale siffer amputasjoner vise en gradvis svekket regenererende respons til fullstendig regenererende svikt på amputasjoner transecting og proksimale til P3 Nail Matrix4,5,6 , 7 andre er , 8. P3 regenerering er formidlet av dannelsen av en blastema, definert som en befolkning på voksende celler som gjennomgår morphogenesis å regenerere amputert strukturer9. Dannelsen av en blastema å regenerere strukturene tapt ved amputasjon, en prosess betegnes epimorphic gjenfødelse, skiller multi-vev-nivå P3 regenerering respons fra tradisjonelle vev reparasjon etter skade6, 10. P3 regenerering er en reproduserbar og Prosedyremessig enkel modell for å undersøke komplekse regenererende prosesser inkludert såret healing11,12, Bone histolysis11,12, revaskularisering13, perifere nerve regenerering14, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening15.

Tidligere studier bruker immunhistokjemi har vist at blastema er heterogen, Avascular, hypoxic, og svært proliferativ11,13,15,16. Etter den begynnende P3 amputasjon, er den tidlige blastema i utgangspunktet knyttet til P3-periosteum og endosteum og kjennetegnes av robust spredning og gryende Osteogenesis ved siden av bein overflaten15. Etter bein degradering og sår lukking, dannes den heterogene blastema ved sammenslåing av periostal og endosteal celler, etterfulgt av differensiering av blastemal komponenter, inkludert bein via Intramembranous forbening 15av dem.

Bone reparasjon som svar på skade vanligvis oppstår ved endokondral forbening, dvs via en innledende cartilaginous Callus som danner en mal for påfølgende bein formasjon17,18. Lange ben Intramembranous forbening, dvs., beindannelse uten cartilaginous mellomliggende, er vanligvis indusert ved hjelp av komplekse distraksjon enheter eller kirurgisk fiksering19,20. Den sifrede regenerering responsen er en pre-klinisk modell som gir fordeler fremfor konvensjonelle Intramembranous forbening modeller: 1) det krever ikke ekstern eller intern fiksering etter skade for å stimulere Intramembranous forbening, 2) det er utført benytter 4 sifre fra hver dyr, således maksimere eksemplar stund minimere dyr bruk, og 3) sammenhengende inne vivo microcomputed tomografi (Benvolum) analyse kan utført med lette og fart.

I denne studien viser vi standardisert P3 amputasjon flyet for å oppnå en reproduserbar og robust regenerering respons. I tillegg viser vi en optimalisert fluorescens immunhistokjemi protokoll ved hjelp av para fin seksjoner for å visualisere blastema formasjon, revaskularisering i sammenheng med regenerering, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening. Vi demonstrerer også bruken av sekvensielle in-vivo Benvolum for å identifisere endringer i bein morfologi, volum og lengde i samme siffer i løpet av regenerering. Målet med denne protokollen er å undersøke pattedyr blastema formasjon etter amputasjon og å demonstrere 2 teknikker, fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in vivo Benvolum, for studiet av Intramembranous bein gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr bruk og teknikker var inne medgjørlighet det målestokk fungerer prosedyrer av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité av Texas en & M universitet.

1. voksen mus hind lem og så P3 amputasjon

  1. Bedøve en 8 til 12 uke gamle CD-1 mus (tabell av materialer) ved hjelp av isoflurane gass i oksygen; utgangspunktet bedøve på 3% i et kammer, etterfulgt av 2% isoflurane levert av en nosecone over varigheten av operasjonen. Påfør øye salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
    Merk: Den voksne P3 amputasjon studier standardisert i laboratoriet vårt er utført på 8 til 12 uker gamle mus, og regenerering responsen er bevart i alle testede stammer.
  2. Under et 10x disseksjon mikroskop, sterilisere sifrene i bakben lem med kirurgisk povidon-jod og 70% etanol. Trim håret vekk fra operasjonsstedet ved hjelp av mikro-saks. Påfør 1 μL av aktuell Bupivakain lokalt for å bedøve operasjonsstedet.
  3. Amputere falanks (P3) på sifrene 2 og 4 i hver bakben med en steril #10 skalpell (figur 1a). Amputasjon må utføres under aseptisk forhold, inkludert sterilisering av kirurgiske instrumenter. Under disseksjon mikroskop, forsiktig splay bakben for å avdekke den midtre siffer overflaten. Hold skalpell i en vinkel parallelt med fatpad for å utføre amputasjon vist i figur 1B. Påfør 1 μL av aktuell Bupivakain til amputasjon stedet.
    Merk: Amputasjon transects spiker organ, dermis, P3 benet, blodkar, og nerver, men ikke kontinuerlig margen hulrom eller siffer fett pad. Hvis blødning er observert, Påfør direkte trykk ved hjelp av en steril bomulls tupp applikator.
  4. Standard P3-Fjern amputasjon Plane fjerner ca. 15% – 20% av P3-bein volumet21. MicroCT skanning (se nedenfor) kan utføres for å bekrefte riktig amputasjon lengde.
  5. Returner musen til en ren bur og la såret til å helbrede uten sår dressing. Overvåk musen i 3 dager for å sikre at musen går tilbake til normal aktivitet.

2. siffer samling og vevs forberedelser

  1. Euthanize musen ved hjelp av karbondioksid (CO2) i et lukket kammer, etterfulgt av cervical forvridning.
  2. Bruk en skalpell til å bryte sifferet midtveis gjennom det tilstøtende Ben segmentet, det midtre falanks (P2) benet, på omtrent det andre ventrale fett pute innrykket. Overfør sifferet (e) til et 20 mL scintillation hetteglass som inneholder 10 mL fersk bufret sink formalin bindemiddel, en 18% formaldehyd løsning (se tabell over materialer). Bindemiddel volum bør være minst 20x volumet av vevet stede.
    Merk: Sifre er samlet på ulike tidspunkter etter amputasjon å undersøke full regenerering respons. Generelt, for tidlig blastema dannelse, bein histolysis, og såret nedleggelse samlingen tidspunkter er 4-8 dager etter amputasjon (DPA). For å undersøke tidlig osteogen blastema samlingen tidspunkter er 9 og 10 DPA, og å visualisere fortsatt bein regenerering og mineralisering, samlingen tidspunkter er 14, 21 og 28 DPA. Unamputated sifre hentes også.
  3. Fest sifferet for 24 – 48 timer ved romtemperatur med skånsom blanding på en shaker.
  4. Fjern bindemiddel og vask sifferet 2x i 5 min i 5 mL av 1x fosfat bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur.
  5. Plasser 10 mL fersk Decalcifier I (se tabell over materialer), en 10% maursyre yre løsning, i scintillation hetteglass og bland forsiktig på en shaker for 2 t ved romtemperatur. Etter 2 h, Erstatt Decalcifier I med frisk løsning og avkalke siffer over natten ved romtemperatur med skånsom miksing på shaker.
  6. Fjern Decalcifier i og vask siffer 2x i 5 min i 5 mL 1x PBS ved romtemperatur.
  7. Behandle sifferet gjennom en gradert etanol-serie. Denne prosessen kan utføres manuelt i et 20 mL scintillation hetteglass, med 10 mL hver væske hvis mindre enn 40 totalt sifre.
    1. Begynn med 2 immersions i fersk 70% etanol ved romtemperatur med skånsom miksing på en shaker, 1 time hver, etterfulgt av 2 immersions i frisk 95% etanol ved romtemperatur med mild miksing på en shaker, 1 time hver.
    2. Fullfør siffer dehydrering med 2 vasker av fersk 100% etanol ved romtemperatur med skånsom miksing på en shaker, 1 time hver. Den endelige 100% etanol vask kan være igjen over natten.
  8. I samme scintillation hetteglass, Bytt ut 100% etanol med 10 mL fersk xylenes, og plasser hetteglasset i en kjemisk avtrekks hette for 1,5 h ved romtemperatur. Gjenta med en fersk vask av xylenes i en kjemisk avtrekks hette for 1,5 h ved romtemperatur i totalt 2 vasker.
  9. Sett på xylenes med flytende parafinvoks smeltet til 68 ° c, og plasser hetteglasset i en inkubator ved 68 ° c i 2 timer, 2 ganger. Etter 4 total h nedsenking i parafinvoks, Legg inn sifferet for para fin snitting.
    Merk: Siffer behandling for histologi kan utføres i en automatisert prosessor, etter de samme retningslinjene.
  10. Seksjons sifre ved tykkelse på 4 – 5 μm ved hjelp av en mikrotomen. Plasser delt prøver på selvklebende lysbilder, ved hjelp av en 38-41 ° c vannbad supplert med en histologiske lim løsning for å sikre at prøvene holder seg til raset. Plasser lysbildene på et 37 ° c-lysbilde varmere for å tørke.

3. immunhistokjemiske farging av voksen Mouse sifre å undersøke blastema formasjon og Intramembranous forbening

  1. Heat delt lysbilder ved 65 ° c for 45 min, etterfulgt av oppvarming ved 37 ° c for ikke mindre enn 15 min for å sikre at prøvene holder seg til raset.
  2. Deparaffinize og rehydrate glir 2x med 5 min vasker av xylenes, en gradert etanol-serien, og nedsenking i vann. Plasser lysbildene i en 50 – 100 mL kapasitet farge krukke og hold nedsenket i 1x Tris bufret Saline med mellom 20 (TBST).
    Merk: Ikke la prøvene tørke i hele fargeprosessen. For alle TBST steg, lysbilder kan inkubert til 2 h.
  3. Forbered et fukte kammer. En 1-tommers dypt dekket plast skyve boks med fuktet papir ved basen er tilstrekkelig.
  4. Klargjør løsningen for varme henting for Runx2, Osterix (OSX) og voksende Cell Nuclear antigen (PCNA). For antigen gjenfinning av tidlig osteoprogenitor markør, Runx2, utarbeide en 1x løsning av Tris-EDTA, pH 8. For osteoblast markør, OSX, utarbeide en 1x løsning av citrate buffer, pH 6. PCNA immunostaining kan utføres i begge løsninger.
  5. Forbered proteinase K antigen henting løsning for blastema markør CXCR422 og endothelial celle markør von Willebrand faktor 8 (vWF) ved å plassere 100 ΜL av proteinase K løsning per lysbilde i et mikrosentrifugen rør og oppvarming til 37 ° c (ca. 5 min).
    Merk: Antigen henting for Runx2, OSX og PCNA utføres ved hjelp av varme henting, og CXCR4 og vWF antigen henting utføres via proteinase K behandling.
  6. For antistoff henting krever varme, dyppe lysbilder i en farge krukke i riktig antigen henting løsning. Heat glir til 95 ° c i 25 min, slik at koking ikke oppstår. Fjern flekker jar fra varmekilde og la avkjøles ved romtemperatur i 35 min.
  7. For proteinase K antigen gjenfinning, lå lysbilder flatt i fukte kammeret, og plasser 100 μL av pre-varmet proteinase K på lysbildet. Dekk til lysbildene med en liten stripe parafilm for å sikre at lysbildene ikke blir tørre. Ruge lysbilder i 12 min ved 37 ° c.
  8. Vask lysbildene 3 ganger i 5 min i 1x TBST i farging jar etter antigen henting.
  9. Fjern lysbilder fra farging jar og sted i fukte kammer. Plasser 6 – 7 dråper blokkerende oppløsning (tabell over materialer) på lysbildet, og dekk til lysbildet med fersk para fin film for å sikre at lysbildet ikke blir tørt. Ruge glir for 1 time ved romtemperatur.
  10. Klargjør de primære Antistoffene ved å fortynne antistoffer i antistoff fortynningsmiddel (tabell av materialer). Vortex hver primære antistoff løsning for 3 s. primære antistoffer avledet fra ulike verts arter kan kombineres.
    Merk: Immunhistokjemiske farging for Runx2 (kanin anti-Runx2 antistoff, 1:250 fortynning, ved en endelig konsentrasjon av 4 μg/mL) kombinert med PCNA (monoklonale mus anti-PCNA antistoff, 1:2000 fortynning, ved en endelig konsentrasjon av 0,5 μg/mL), og OSX (kanin anti-OSX antistoff, 1:400 ved en endelig konsentrasjon på 0,125 μg/mL) kombinert med PCNA, vises i figur 2. Musen anti-PCNA antistoff som brukes i denne studien er svært spesifikke og krever ingen ekstra blokkerende skritt utover de som er skissert i denne protokollen. Immunhistokjemiske farging ved hjelp av CXCR4 (rotte anti-CXCR4 antistoff, 1:500 fortynning ved en endelig konsentrasjon på 2 μg/mL) og vWF (kanin anti-humant vWF VIII antistoff, 1:800 fortynning, ved en endelig konsentrasjon på 41,25 μg/mL) er vist i figur 2. Primære antistoffer ble optimalisert og testet av vår lab under betingelsene i denne protokollen, og er oppført i tabellen av materialer.
  11. Fjern para fin filmen forsiktig, og tapp forsiktig av glidebryteren på papir for å fjerne overflødig blokkerings løsning. Plasser 100 – 200 μL av primær antistoff løsning på lysbildet, Bytt parafilm deksel og gå tilbake til fukte kammeret. Ruge lysbildene i det lukkede fukte kammeret over natten ved 4 ° c.
    Merk: Ikke la lysbildene bli tørre under tømming av blokkerings løsningen. Dette trinnet utføres raskt.
  12. Fjern forsiktig parafilm, og tapp forsiktig den primære antistoff løsningen fra lysbildet. Plasser lysbildet i en farge krukke med friskt 1X TBST. Vask med friskt 1x TBST i 5 min 3 ganger.
  13. Klargjør sekundære antistoffer ved å kombinere med antistoff fortynningsmiddel (tabell av materialer). Vortex den sekundære antistoff løsning for 3 s. sekundære antistoffer som bøyes likt til ulike fluorophores avledet fra ulike arter kan kombineres.
    Merk: Fluorescerende sekundære antistoffer er lysfølsomme. Alexa fluor 488-bøyd geit anti-kanin IgG (H + L) for Runx2, OSX, og vWF, Alexa fluor 568-bøyd geit anti-rotte IgG (H + L) for CXCR4, og Alexa fluor 647-bøyd geit anti-mus IgG (H + L) for PCNA, fortynnet ved 1:500 med en endelig konsentrasjon av 4 μg/mL , ble brukt i figur 2.
  14. Plasser 200 μL av sekundær antistoff løsning på lysbildet, dekk lysbilde med fersk para fin film, og gå tilbake til fukte kammer. Ruge lysbildene i det lukkede fukte kammeret i 45 min. ved romtemperatur. Sørg for at fukte kammeret er lukket for å unngå lys.
  15. Fjern para fin filmen forsiktig og tapp forsiktig den sekundære antistoff løsningen fra lysbildet. Plasser lysbildet i en farge krukke med friskt 1x TBST. Vask med friskt 1x TBST i 5 min 3x. Unngå lys.
  16. Forbered kjernefysisk beis. Tilsett 20 μL av DAPI (lager DAPI oppløsning er 5 mg/mL i H2O) til 200 ml 1x PBS og rist kraftig for å sikre homogenitet. Dypp lysbildene i 5 minutter i DAPI-PBS-løsning. Unngå lys.
  17. Vask lysbildene i dH2O i 3 min. Dekanter vannet og la lysbildene lufttørke eller forsiktig aspirer vannet fra lysbildet, slik at prøvene ikke forstyrres under støvsuging. Unngå lys.
  18. Forsiktig dekkglass tørr lysbilder med 100 μL av anti-fade montering medium (tabell av materialer); Unngå dannelse av luftbobler på lysbildet under monterings trinnet. Oppbevar lysbildene flatt og la festemiddelet tørke over natten ved romtemperatur i en lys bestandig beholder. Etter at monterings mediet er tørt, må du oppbevare dem flatt i en lys bestandig beholder i 4 ° c til det er klart til visning.
    Merk: Hvis uakseptable nivåer av luftbobler er til stede etter montering, kan den monterte Raset plasseres forsiktig i 1x PBS, dekkglass kan fjernes, og når lysbildet skylles igjen i vann og re-tørket, kan monteres på nytt.

4. mikroskopi og bildeanalyse

Merk: Imaging og analyse ved hjelp av et fluorescens deconvolution mikroskop og tilhørende programvare, utstyrt med 3 fluorescerende filtre (for å visualisere Alexa fluor 488, 568 og 647 NM signaler), pluss DAPI (419 NM) brukes i dette eksperimentet.

  1. Bilde lysbildet med 10x forstørrelse for å fange hele blastema regionen.
    Merk: Voksende osteoblast primære antistoff deteksjon utnytter sekundære antistoffer (Alexa fluor 488 og 647) med ikke-overlappende utslipp Spectra å minimere feilidentifisering av co-merket celler. Bakgrunns subtraksjon av autofluorescent signal kan utføres ved hjelp av 568 NM filter for å sikre integriteten til 488 eller 647 signaler. Blastema primære antistoff deteksjon utnytter sekundære antistoffer (Alexa fluor 488 eller 568). Bakgrunns subtraksjon av autofluorescent signal kan utføres med 568-filteret ved bruk av 488-bøyd antistoff, og 488-filter bruker det 568-bøyd antistoff. Autofluorescent signalet er vanligvis forbundet med spiker plate og erytrocytter gjennom sifferet, og er observert i 488, 568 og 647 filtre.

5. sekvensiell in vivo Microcomputed tomografi (Benvolum)

  1. Regenererer sifre av samme dyr skannet til 1 dag før amputasjon (unamputated), 1 DPA, og på ulike tidspunkt før fullstendig regenerering på 28 DPA ved hjelp av vivaCT 40 (tabell over materialer) er utført i dette eksperimentet og vist i Figur 3A.
  2. Utstyr Benvolum med slange for å muliggjøre oksygentilførsel inn og ut av Benvolum dyre kammer, slik at det ut-strømmer oksygen er utstyrt med et aktivt kullfilter for å felle isoflurane.
    Merk: Sørg for at Benvolum er tett lukket; på denne måten er et dyr nese-kjegle ikke nødvendig for å forsyne isoflurane til musen under skanningen.
  3. Klargjør skanne parameterne Benvolum. Sifre skannes med en Voxel størrelse på 10,5 μm, ved 55 kVp, 145 uA med 1000 anslag per 180 ° ved hjelp av kontinuerlig rotasjon, og med en integrasjons tid på 200 MS, noe som resulterer i maksimalt 213 skiver per skanning. Skanninger utført i dette eksperimentet er ca 9 min lang. En redusert elektrisk strøm kan kompenseres med proporsjonalt økt integrasjons tid, men vil resultere i lengre skanne tider.
  4. Bedøve den voksne musen ved hjelp av isoflurane; i starten bedøve for 3% inne en kammeret, føle etter av 1,5% isoflurane forsynt å det Benvolum dyr kammeret over varigheten av skanningen. Forsiktig sted musa inne det Benvolum dyr kammeret med det hindlimb bentap sifre avtalt inne slutte forening, leilighet, ventrale side-opp med igjen pote opp på igjen side og rett pote opp på rett side på skanning plattform, føle etter av mildt sikringen det sifre på plass benytter inngrep Tape. Påfør øye salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
  5. Returner musen til en ren bur og overvåke musen til våken. Fortsett å skanne den samme musen på bi-ukentlig til ukentlig tid poeng å visualisere hele benet gjenfødelse respons.
  6. Etter skanning, tillate opp til adskillige timene for Benvolum image rekonstruksjon å finnes. Ved hjelp av programvaren som følger med Benvolum, konvertere filene til en rekke DICOM-filer; hver DICOM-fil vil tilsvare en skive av skanningen, derfor, hvis 213 skiver har blitt skannet, 213 DICOM-filer vil bli generert og lastet opp til selskapets server.
  7. Last ned DICOM-serien i en enkelt mappe ved hjelp av en satsvis fil Downloader i en nettleser.
  8. Last ned BoneJ plugin23 og dra filen inn i ImageJ plugin folder. I ImageJ, åpne DICOM fil serien som en stabel ved å dra og slippe mappen til ImageJ bar. En 16-biters bildestakk som viser alle de grå verdiene, åpnes. For å vise bein bare, utføre bilde terskelverdi (Image > justere > terskel).
    Merk: Når du ser på ImageJ-filer, vil ImageJ-utdataene tilsvare et invertert bilde av sifrene; i.e., sifre avtalt inne skanningen plattform ventrale side-opp, med igjen pote opp på igjen side av plattform og rett pote på rett side av plattform, ville komme idet rygg-opp, rett pote opp på igjen side og igjen pote på rett side av det ImageJ image stabel.
  9. Når terskelen dialogboksen er åpnet, skyver den nederste linjen, tilsvarende den øvre terskelen, helt til høyre, og justere den øverste linjen, som tilsvarer den nedre terskelen, til bare benet er uthevet rødt. Den nedre terskelverdien vil være omtrent 10000 – 13000 med en maksimal signal intensitet på 32 767. Klikk Bruk, og klikk svart bakgrunni den nye dialogboksen. Klikk på OK.
  10. Et 8-bits bilde som viser svarte og hvite verdier vil bli generert, med hvit tilsvarende bein. Velg P3 benet ved å tegne et rektangel rundt det, og duplisere stabelen. Generer et 3D-bilde (Plugins ≫ 3D Viewer). For å beskjære unødvendige bein fra bildet, klikker du på markeringsverktøyet og sirkler benet som skal slettes. Høyreklikk, og velg Fyll utvalg å slette bein.
    Merk: Fremgangsmåten beskrevet ovenfor gjelder for ImageJ 1.52 h, Java 8 og kan avvike noe når du bruker en annen versjon av ImageJ. For terskelverdi, anbefaler vi fastsettelse av en optimal verdi og bruke denne verdien konsekvent.
  11. Kvantifisere bein volum fra 3D-gjengivelsen ved hjelp av BoneJ Volume brøk plugin (Plugins > BoneJ > Volume brøk). Et resultat vindu vises, og bein volumet (BV) vises i mm3.
  12. Kvantifisere beinlengde fra 3D-gjengivelsen ved hjelp av ImageJ multipunkt verktøyet.
    Merk: Bone lengden er dynamisk i løpet av P3 regenerering; lengden avtar mellom 7-10 DPA assosiert med osteoclast-mediert Ben degradering11, og etterfølges av en periode med opp-mot bein gjenvekst mellom 14-28 DPA (figur 3b). Lengden måles fra den sentrale bunnen av den P2/P3 felles til lengst punktet av mineralisering på den fjerne Ben Apex, men inkluderer ikke degradert bein som er helt løsrevet (figur 3b). BoneJ gjør det mulig for den komplette 3D-vurderingen av Ben arkitekturen; Dermed vil vinkelen der benet er skannet ikke endre evnen til å måle lengde.
  13. Ta bilde av 3D-gjengivelsen ved å klikke på Vis, og ta øyeblikksbilde. Lagre bildet som en tif-eller JPEG-fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voksen mus regenererer P3 sifre på 6/7 DPA (figur 2a-D), 9 DPA (figur 2e-H), og 10 DPA (figur 2i-L) ble immunostained med antistoffer mot Runx2, OSX og PCNA å visualisere Intramembranous bein regenerering, og immunostained med antistoffer mot CXCR4 og vWF for å visualisere blastema dannelse. Representative Benvolum gjengivelser av sifre skannet før amputasjon og ved ulike tidspunkter i løpet av regenerering (figur 3a, B) og identifisering av landemerkene som brukes til å identifisere lengdemålinger (figur 3b) er også vist.

Figure 1
Figur 1: siffer nummer og identifisering av voksen mus som skal Det voksen musen rett bakben pote er vist med sifre nummererte 1-5; amputasjoner som utføres i denne studien, utføres på siffer 2 og 4 (A). Det ikke-spesifikke amputasjon-flyet vises (stiplet linje) på siffer 2 og 4 (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: tidlig Intramembranous forbening og blastema formasjon i den regenererende voksen musen P3 siffer. Runx2 (grønn) og PCNA (magenta) dobbelt immunofluorescence viser at voksende osteoprogenitors er i utgangspunktet lokalisert til periostal og endosteal bein overflater på 6/7 DPA, og utvide til den flate blastema ved 9 og 10 DPA (A, E, i). OSX (grønn) og PCNA (magenta) dobbel immunofluorescence viser få OSX-positiv osteoblaster og bred spredningen for 6/7 (B), og forsterket OSX immunostaining distally avgrenset av voksende celler for 9 og 10 DPA (F, J). CXCR4 (rød) immunofluorescence identifiserer tidlig blastema formasjon ved 6/7 DPA (C), etterfulgt av robuste CXCR4 immunostaining i 9 og 10 DPA regenererende sifre (G, K). vWF (grønn) immunostaining identifiserer intakt blodkar i margen med amputert sifre, og få positive celler knyttet til Avascular blastema (D, H, L). Prøver counterstained med DAPI. Rygg er til toppen, som er til høyre. Bl = blastema, m = marg. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: P3 bein regenerering som er i en sekvensiell in-vivo benvolum-skanning. Representative Benvolum gjengivelser av ett siffer skannet før amputasjon (unamp), og ved 1, 7, 10, 14, 21 og 28 DPA. Benvolum skanning demonstrerer P3 regenerering er preget av en innledende bein histolysis respons, etterfulgt av bein øya formasjon på 14 DPA og robust bein gjenfødelse på 21 og 28 DPA (A). Representative Benvolum gjengivelser av ett siffer skannet før amputasjon og på 1, 7, 10, 14, 21 og 28 DPA illustrerer regionene der siffer lengde måles på hvert tidspunkt. (B) grønne prikker angi den totale lengden målt, mens den røde X betegner regionen av utvist bein utelukket fra lengden måling. Individuelle siffer bilder opprettet av ImageJ kan beskjæres for å standardisere siffer størrelsen for å muliggjøre etablering av bilder sett i dette tallet. Det er helt til høyre, og rygg er til topps. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en standardisert prosedyre av voksen mus som er i ferd P3 amputasjon, fluorescerende immunhistokjemiske farging for å visualisere og undersøke blastema formasjon og Intramembranous forbening, og sekvensiell in-vivo Benvolum skanning til identifisere bein morfologiske, volum og lengde endringer etter amputasjon. P3 amputasjon er en unik, Prosedyremessig enkel, og reproduserbar modell for å analysere en Pro-regenererende sår miljø som utløser blastema formasjon. Videre, det P3 tall modell tilbyder tallrik fordelene over tradisjonell Ben skaden modeller å etterforske Intramembranous forbening.

For å sikre suksess for denne protokollen, må komplett sifret Avkalking utføres. I tilfelle sifferet ikke er helt decalcified, vil den smuldre og makulere under skjære prosessen. I tillegg kan varme gjenfinning immunhistokjemi være problematisk i at vevet kan løsne litt eller bli helt forskyves fra lysbildet. For å lindre dette problemet, bør prøvene monteres på selvklebende lysbilder ved hjelp av et vannbad supplert med en histologiske lim agent, samt bakervarer den tørre lysbilder til 65 ° c før bruk. Til slutt, musa sifrene er relativt liten; Derfor, for å nøyaktig visualisere morfologi og kvantifisere endringer i bein volum og lengde, må Benvolum være av tilstrekkelig oppløsning til å fungere på riktig skanning parametere.

En begrensning av denne metoden er at ikke alle primære antistoffer er kompatible med vev fiksering og parafin behandling. I dette tilfellet kan standard frosset vev kryosnitt utføres for å sikre integriteten til den primære antistoff antigen11. Kryosnitt eliminerer også behovet for Avkalking trinnet, men vi har funnet ut at kryosnitt av sifre er teknisk mer utfordrende enn para fin snitting.

Hele blastema kan bli avbildet ved 10x forstørrelse av deconvolution mikroskopi, og ved hjelp av riktig bilde kvantifisering programvare, immunostaining resultatene kan lett kvantifisert. Fluorescerende immunhistokjemi undersøkelser for osteogen markører for regenererende siffer gir en unik visning av blastemal differensiering via Intramembranous forbening. Immunhistokjemiske flekker avslører at P3-benet gjenfødelse responsen er polarisert og resulterer i organisert proksimale beindannelse (figur 2). Ved senere gjenfødelse stadier, ikke-proliferativ osteoblaster avledet fra blastema er lokalisert ved siden av benet stump og er distally avgrenset av voksende osteoblaster. Den voksende osteoblaster i sin tur er distally avgrenset av voksende udifferensierte blastemal celler. Fluorescerende immunhistokjemi undersøkelser for blastema markør CXCR4 identifiserer tidlig blastema celler knyttet til skadet bein overflaten etterfulgt av forbedret immunostaining ved senere regenerering stadier (figur 2). Blastema er Avascular13 og immunofluorescence for endothelial celle markør vWF identifiserer få positive celler i blastema regionen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Muneoka Lab og Texas Institute for genomisk Medicine (TIGM). Dette arbeidet ble støttet av Texas A & M University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Tags

Utviklingsbiologi siffer amputasjon epimorphic regenerering Intramembranous forbening osteoprogenitors blastema Avkalking fluorescens immunhistokjemi microcomputed tomografi
Voksen mus siffer amputasjon og regenerering: en enkel modell for å undersøke pattedyr blastema formasjon og Intramembranous forbening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, … More

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y. L., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter