Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.
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Artículo de método
En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
El flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en roedores se ha estudiado en gran medida utilizando la cuantificación ex vivo de los trazadores. Técnicas como la microscopía de dos fotones y la resonancia magnética (RM) han permitido la cuantificación in vivo del flujo de LSN, pero están limitadas por la reducción de los volúmenes de imágenes y la baja resolución espacial, respectivamente. Trabajos recientes han encontrado que el LCH entra en el parénquima cerebral a través de una red de espacios perivasculares que rodean las arterias pial y penetrantes de la corteza de roedores. Esta entrada perivascular del LIF es un factor principal del sistema ginfotico, una vía implicada en el aclaramiento de solutos metabólicos tóxicos (p. ej., amiloide). Aquí, ilustramos una nueva técnica de imagen macroscópica que permite imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazadores fluorescentes de CSF a través del cráneo intacto de ratones vivos. Este método mínimamente invasivo facilita una multitud de diseños experimentales y permite realizar pruebas únicas o repetidas de la dinámica del CSF. Los macroscopios tienen una alta resolución espacial y temporal y su gran pórtico y distancia de trabajo permiten la creación de imágenes mientras realizan tareas en dispositivos de comportamiento. Este enfoque de imagen ha sido validado utilizando mediciones de imágenes y fluorescencia de dos fotones obtenidas a partir de esta técnica se correlacionan fuertemente con la fluorescencia ex vivo y la cuantificación de trazadores radiomarcados. En este protocolo, describimos cómo se pueden utilizar imágenes macroscópicas transcraneales para evaluar el transporte ginfogático en ratones vivos, ofreciendo una alternativa accesible a las modalidades de imagen más costosas.
Introducción
El líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el cerebro y la médula espinal y participa en el mantenimiento de la homeostasis, el suministro de nutrientes y la regulación de la presión intracraneal1. El LESO en el espacio subaracnoideo entra en el cerebro a través de una red de espacios perivasculares (PVS) que rodean las arterias cortales corticales y luego fluye a lo largo de las arterias penetrantes2. Una vez en el parénquima, el Líquido Cefalrea (CSF) intercambia con fluido intersticial (ISF), llevando metabolitos nocivos como el amiloide y los agregados de proteína tau del cerebro a través de vías de materia blanca de baja....
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales (UCAR, Protocolo No. 2011-023) en la Universidad de Rochester y realizados de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de la cánula cisterna magna, la placa de la cabeza y el soporte para la cabeza
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y placas de cabeza antes de la cirugía.
NOTA: Los trazadores fluorescentes se entregan directamente en el CSF a través de una cannulación cisterna magna. Para obtener instrucciones detalladas sobre este procedimiento, consulte Xavier et al
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Resultados
La afluencia de LSF se muestra en un macroscopio epifluorescente (Figura1A),que permite la toma de imágenes mesoscópicas del transporte del trazador de LSF en la corteza murina. La placa de cabeza de cráneo entero permite la visualización de los huesos nasales rostrales, tanto los huesos frontales como parietales en el centro, y la porción rostral del hueso interparietal caudalmente (Figura1B). Durante las imágenes, las suturas nasofrontal, sagital, coronal y la.......
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Discusión
Hemos descrito un protocolo detallado para realizar imágenes transcraneales de LSC en ratones vivos utilizando macroscopios y trazadores fluorescentes disponibles comercialmente. Esta técnica es simple y mínimamente invasiva, pero cuantitativa. La imagen in vivo se correlaciona bien con métodos sensibles como el recuento de centelleo líquido de tracdores radiomarcados, incluidos 3H-dextran y 14C-inulin después de la administración de CM, y con cuantificación de sección coronal ex vivo
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos; R01NS100366 y RF1AG057575 a MN), el Programa de Redes Transatlánticas de Excelencia De la Fundación Leducq y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE (concesión no 666881; SVDs-target). También nos gustaría dar las gracias a Dan Xue por la asistencia de expertos con ilustraciones gráficas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% Bupivacaína HCl | Universidad de Rochester Vivarium | ||
| 100 µ L Jeringa hermética al gas modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Cemento dental en polvo | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofeno | Universidad de Rochester Vivarium | ||
| Clorhexidina | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Cámara | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Placa de cabeza | Universidad de Rochester | Sin catálogo # | Hecho a medida en el taller mecánico de la Universidad de Rochester |
| Cauterio de alta temperatura | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurano - Fluriso | Vet One | 502017 | Universidad de Rochester Vivarium |
| Ketamina | Fuerte Memorial Hospital Farmacia | ||
| Krazy Pegamento | Elmer's Products, Inc | Sin catálogo #, ver enlace en comentarios | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Cinta quirúrgica | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehído | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polietileno .011" x .024" por pie, 100 ft. continuo | Braintree Scientific | PE10 Bomba de 100 pies | |
| 11 Elite Solo infusión Jeringa doble | Aparato Harvard | 70-4501 | |
| PURALUBE UNGÜENTO VETERINARIO | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Palitos de limpieza con punta de algodón | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Microscopio de investigación con zoom macro | Olympus | MVX10 | |
| Placa de soporte de cabeza simple (para ratones) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Agujas de un solo uso, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Almohadillas estériles de preparación de alcohol | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | Universidad de Rochester Vivarium |
Referencias
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemi....
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Reimpresiones y permisos
