Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Katherine Chan; Amy  Hin Yan Tong; Kevin  R Brown; Patricia Mero; Jason Moffat

doi:10.3791/59780

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Artículo de método

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

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DOI:

10.3791/59780

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4 de septiembre de 2019

Katherine Chan^*¹ , Amy Hin Yan Tong^*¹ , Kevin R Brown¹ , Patricia Mero¹ , Jason Moffat¹^,²^,³

¹Donnelly Centre, University of Toronto, ²Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ³Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Resumen

La edición del genoma utilizando el sistema CRISPR-Cas ha avanzado enormemente la capacidad de editar con precisión los genomas de varios organismos. En el contexto de las células de los mamíferos, esta tecnología representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma para estudios genómicos funcionales. Las bibliotecas de ARN guía (sgRNA) dirigidas a todos los marcos de lectura abiertos permiten la generación fácil de miles de perturbaciones genéticas en un solo grupo de células que se pueden analizar para fenotipos específicos para implicar la función génica y los procesos celulares en un manera imparcial y sistemática. Las pantallas CRISPR-Cas proporcionan a los investigadores un método simple, eficiente y económico para descubrir los planos genéticos de los fenotipos celulares. Además, el análisis diferencial de las pantallas realizadas en varias líneas celulares y de diferentes tipos de cáncer puede identificar genes que son esenciales desde el punto de vista contextual en las células tumorales, revelando objetivos potenciales para terapias específicas contra el cáncer. Realizar pantallas de todo el genoma en células humanas puede ser desalentador, ya que esto implica el manejo de decenas de millones de células y requiere el análisis de grandes conjuntos de datos. Los detalles de estas pantallas, como la caracterización de líneas celulares, las consideraciones de la biblioteca CRISPR y la comprensión de las limitaciones y capacidades de la tecnología CRISPR durante el análisis, a menudo se pasan por alto. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento exitoso de las pantallas basadas en CRISPR-Cas9 en todo el genoma agrupado.

Introducción

CRISPR-Cas, abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas y nucleasas asociadas a CRISPR, consiste en una única proteína de nucleasa (por ejemplo, Cas9) en complejo con un ARN guía sintético (sgRNA). Este complejo de ribonucleoproteínas se dirige a la enzima Cas9 para inducir roturas de ADN de doble cadena en un locus genómico específico¹. Los cortes de doble cadena se pueden reparar mediante reparación dirigida por homología (HDR) o, más comúnmente, a través de unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo de reparación propenso a errores que da como resultado la inserción y/o deleciones (INDELS) que con frecuencia interrumpe....