Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

12.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/59830

⸱

17 de julio de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, 3School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 4Department of Tissue and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease, Wuhan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Resumen

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína desempeñan un papel importante en procesos biológicos como la transcripción, la recombinación y el metabolismo del ARN. Los métodos experimentales para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos requieren el uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radiactivos u otras etiquetas para detectar y analizar moléculas diana específicas. La biotina, una etiqueta de ácido nucleico no radiactivo, se utiliza comúnmente en los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), pero no se ha empleado regularmente para controlar la actividad proteica durante los procesos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra la utilidad del etiquetado de la biotina durante las reacciones enzimáticas in vitro, demostrando que esta etiqueta funciona bien con una gama de diferentes ensayos bioquímicos. Específicamente, en consonancia con los hallazgos anteriores utilizando sustratos marcados con radioisótopos 32P, se confirma a través de EMSA etiquetada con biotina que MEIOB (una proteína específicamente implicada en la recombinación meiótica) es una proteína de unión al ADN, que MOV10 (una Helicase de ARN) resuelve estructuras dúplex de ARN etiquetadas con biotina, y ese MEIOB corta ADN de cadena única etiquetado por biotina. Este estudio demuestra que la biotina es capaz de sustituir 32P en diversos ensayos bioquímicos relacionados con el ácido nucleico in vitro.

Introducción

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína están involucradas en muchos procesos celulares esenciales, como la reparación del ADN, la replicación, la transcripción, el procesamiento de ARN y la traducción. Las interacciones proteicas con secuencias de ADN específicas dentro de lacromatina son necesarias para el control estricto de la expresión génica en el nivel de transcripción 1. La regulación posttranscripcional precisa de numerosos ARN de codificación yno codificación requiere interacciones extensas y complicadas entre cualquier proteína y ARN 2. Estas capas de mecanismo regulador de la expresión génica comprenden una cascada de eventos intermoleculares dinámicos, que se coordinan mediante interacciones de factores de transcripción/epigenética o proteínas de unión al ARN con sus objetivos de ácido nucleico, así como interacciones proteína-proteína. Para diseccionar si las proteínas in vivo están asociadas directa o indirectamente con ácidos nucleicos y cómo tales asociaciones se producen y culminan, se llevan a cabo ensayos bioquímicos in vitro para examinar la afinidad de unión o la actividad enzimática de las proteínas de interés sustratos diseñados de ADN y/o ARN.

Se han desarrollado muchas técnicas para detectar y caracterizar complejos de ácido-proteína nucleico, incluido el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de retardo de gel o ensayo de cambio de banda3,4,5 . EMSA es un método bioquímico versátil y sensible que se utiliza ampliamente para estudiar la unión directa de proteínas con ácidos nucleicos. EMSA se basa en el cambio electroforético de gel en las bandas, que se visualizan rutinariamente utilizando quimioluminiscencia para detectar etiquetas de biotina6,7, la fluorescencia de las etiquetas de fluoróforo8,9,o por autoradiografía de etiquetas radiactivas de 32P10,11. Otros propósitos de los estudios bioquímicos son la identificación y caracterización de la actividad de procesamiento de ácido snúcleo de proteínas, tales como reacciones basadas en nucleasas para evaluar los productos de escisión a partir de sustratos de ácido nucleico12, 13 , 14 y ensayos de desenredado de estructura ADN/ARN para evaluar las actividades de helicaso15,16,17.

En tales ensayos de actividad enzimática, los ácidos nucleicos etiquetados con radioisótopos o con etiqueta de fluoróforo se utilizan a menudo como sustratos debido a su alta sensibilidad. Se ha encontrado que el análisis de radiografías de reacciones enzimáticas con 32Radiosondas con etiqueta P son sensibles y reproducibles18. Sin embargo, en un número cada vez mayor de laboratorios en el mundo, el uso de radioisótopos está restringido o incluso prohibido debido a los riesgos para la salud asociados con la exposición potencial. Además de los problemas de bioseguridad, otros inconvenientes son el equipo necesario para llevar a cabo el trabajo con radioisótopos, la licencia de radiactividad requerida, una vida media corta de 32P (alrededor de 14 días) y un deterioro gradual de la calidad de la sonda debido a radiolisis. Por lo tanto, se han desarrollado métodos alternativos no isotópicos (es decir, el etiquetado de la sonda con fluoróforos permite la detección por imágenes fluorescentes19). Sin embargo, se necesita un sistema de imágenes de alta resolución cuando se utilizan sondas etiquetadas fluorescentemente. La biotina, una etiqueta de uso común, se une fácilmente a macromoléculas biológicas como proteínas y ácidos nucleicos. El sistema Biotin-streptavidin funciona de manera eficiente y mejora la sensibilidad de detección sin aumentar los antecedentes no específicos20,21. Además de EMSA, la biotina es ampliamente utilizada para la purificación de proteínas y el extracción de ARN, entre otros22,23,24.

Este protocolo utiliza con éxito ácidos nucleicos etiquetados con biotina como sustratos para ensayos bioquímicos in vitro que incluyen EMSA, además de reacciones enzimáticas en las que no se ha utilizado comúnmente la biotina. El dominio MEIOB OB está construido y dos mutantes (truncamiento y mutación puntual) se expresan como proteínas de fusión GST25,26,27,así como ratón MOV10 proteína de fusión FLAG recombinante16. Este informe destaca la eficacia de este protocolo combinado para la purificación de proteínas y ensayos etiquetados con biotina con fines experimentales diversos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación de proteínas

  1. Construcciones de expresión MEIOB y MOV10
    1. Generar construcciones de expresión cDNA codificando el mouse MEIOB-A, C y E (Figura1A)y MOV10.
      1. Configure las reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada fragmento. Mezclar 1 l de ADNc del ratón (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 l de dNTP, 2 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 2 ml de imprimación inversa de 10 m, 1 l de polimerasa de ADN, 25 ml de 2 x tampón de PCR y 18 ml de H 2 O destilado doble (ddH 2 O) en una fase final de 2O de ADN y 18 o L de H2O (ddH2O) en una volumen de 50 l.
        NOTA: Las imprimaciones para la amplificación de fragmentos de genes Meiob y Mov10 se enumeran en la Tabla 1.
      2. Realizar reacciones de PCR utilizando los siguientes programas: 95 oC durante 5 min, 35 ciclos de calentamiento a 95 oC durante 15 s, recocido a 64 oC durante 15 s, extensión a 72 oC para 20 s (2 min para extender la longitud completa MOV10), y extensión final a 68 oC durante 7 min.
        NOTA: Utilice el par de imprimación MEIOB-E (F1) y MEIOB-E-mut (R1) y MEIOB-E-mut (F2) y MEIOB-E (R2) para amplificar dos segmentos que contienen la secuencia mutante dentro de una secuencia superpuesta en los extremos 3' y 5', respectivamente, para generar una plantilla de PCR mutante.
    2. Analizar el ADN de PCR amplificado por electroforesis de gel, cortar la banda del tamaño requerido del gel rápidamente bajo una lámpara UV, y colocar en un tubo centrífugo.
      NOTA: Los tamaños de producto esperados visibles en el gel de agarosa para MEIOB-A es de 536 bp, MEIOB-C es de 296 bp, MEIOB-E son 312 bp y 229 bp, y MOV10 es 3015 bp.
    3. Purificar el ADN PCR con un kit de extracción de gel siguiendo el protocolo del fabricante.
      1. Añadir un volumen igual de tampón de disolución en el tubo centrífugo del paso 1.1.2 y fundir el gel en un baño de agua de 50-55 oC durante 5-10 min, asegurando que las piezas de gel se derritan por completo. Centrifugar brevemente para recoger las gotas de la pared del tubo.
        NOTA: La concentración de masa/volumen del gel y el tampón de disolución es de 1 mg/L.
      2. Coloque la columna de adsorción en el tubo de recogida, transfiera la solución que contiene el fragmento de gel disuelto a la columna de adsorción y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min.
      3. Deseche el filtrado en la parte inferior de los tubos de recogida. Añadir 600 l del tampón de lavado a la columna, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y desechar el filtrado.
      4. Repita el paso 1.1.3.3 una vez.
      5. Vuelva a colocar la columna en el tubo de recogida y centrifugar a 12.000 x g durante 2 min para eliminar todo el tampón de lavado restante.
      6. Colocar la columna de adsorción en un tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 ml, añadir 50 l de ddH2O al centro de la columna de adsorción y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min. Medir la concentración de ADN del eluido utilizando el espectrofotómetro.
    4. Restricción de la digestión de plásmidos
      1. Digerir el vector pGEX-4T-1 con BamHI y NotI. Para ello, mezcle 4 g de vector pGEX-4T-1, 5 ml de tampón de digestión 10x, 1 l de BamHI y 1 l de NotI y ddH2O a un volumen de reacción final de 50 ml. Incubar a 37oC durante 2 h.
      2. Digerir el vector pRK5 con BamHI y XhoI mezclando 4 g de vector pRK5, 5 l de tampón de digestión 10x, 1 l de BamHI y 1 l de XhoI y ddH2O a un volumen de reacción final de 50 l. Incubar a 37oC durante 2 h.
    5. Analizar el ADN vectorial por electroforesis de gel, cortar la banda de tamaño deseado del gel rápidamente con un bisturí debajo de una lámpara UV y colocarlo en un tubo centrífugo.
    6. Purificar el ADN vectorial con un kit de extracción de gel como 1.1.3 siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La longitud de los plásmidos linealizados: pGEX-4T-1, 4.4 kb; pRK5, 4,7 kb.
    7. Establecer una reacción de ligadura recombinante estándar combinando 0,03 pmol de vector linealizado, 0,06 pmol de fragmento de ADNc, 2 ml de ligasa y 4 l de tampón de ligasa de 5x y ddH2O en un volumen de reacción final de 10 l.
      NOTA: Clonar MEIOB-A, C y E en un vector pGEX-4T-1 y MOV10 en un vector pRK5.
    8. Incubar la mezcla a 37 oC durante 30 minutos, y luego enfriar la reacción inmediatamente durante 5 minutos sobre hielo. Transforma los plásmidos recombinantes MEIOB en bacterias BL21 y plásmidos recombinantes MOV10 en bacterias DH5.
      NOTA: Verifique todas las construcciones recombinantes mediante la secuenciación de Sanger.
    9. Preparar las reservas de glicerol de cultivos bacterianos que contengan plásmidos recombinantes verificados añadiendo un volumen igual de 50% de glicerol a cultivos líquidos, y almacenar a -80 oC.
      NOTA: Para cada experimento posterior, exhala rallar las bacterias de las existencias de glicerol en una placa de agar fresca y utilizar una sola colonia para la expansión como se describe en el paso 1.2.
  2. Extractos de proteína MEIOB de bacterias
    1. Escoge una colonia de cada cepa BL21 transllenada con el plásmido pGEX-4T-1 vacío o recombinante verificado por secuenciación e inocular en 3 ml de LB que contenga 100 g/ml de ampicilina. Crecer durante la noche a 37oC con agitación a 220 rpm.
    2. Inocular 300 ml lb que contiene 100 g/ml de ampicilina a partir de 3 ml de cultivo nocturno (a partir del paso 1.2.1). Cultivar los cultivos con temblores a 37 oC durante 2 h hasta que OD600 alcance 0.5-1.0.
    3. Inducir la expresión de proteína añadiendo isopropilo beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a una concentración final de 0,2 mM. Incubar los cultivos durante 3 h adicionales con agitación a 180 rpm y 18oC.
    4. Centrifugar el cultivo bacteriano a 3.500 x g y 4 oC durante 20 min.
    5. Resuspenda el pellet en 20 ml del tampón de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco helado (DPBS). Sonicar la suspensión bacteriana sobre hielo durante 25 ciclos en ráfagas cortas de 10 s (potencia de salida 20%) seguido de 2-3 s descansando sobre hielo.
    6. Centrifugar el lisado a 12.000 x g y 4 oC durante 15 minutos. Transfiera todo el sobrenadante a un tubo nuevo.
    7. Prelavado de cuentas.
      1. Añadir 300 sl de cuentas de glutatión-sepharose a un tubo fresco de 15 ml y lavar las perlas con 10 ml de tampón PBS helado.
      2. Centrifugar a 750 x g y 4 oC durante 1 min para peletizar las perlas y desechar la solución de lavado.
    8. Añadir el lisado a las cuentas lavadas e incubar a 4oC durante 2 h. Centrífuga a 750 x g y 4oC durante 1 min para peletizar las perlas. Enjuague las perlas en 10 ml de PBS 8x helado.
    9. Elite las perlas con 1 mL del tampón de elución (10 mM de glutatión en Tris-HCl de 50 mM a pH 8.0) 6x, incubando a 4oC durante 10 minutos antes de cada paso de elución. Centrífuga a 750 x g y 4 oC durante 1 min para peletizar las perlas. Recoger y agrupar las 6 fracciones.
    10. Transfiera las proteínas eluted asadas en un filtro centrífugo y concentre por centrifugación a 7.500 x g para obtener un volumen final de 100-200 l.
  3. Extractos de proteína MOV10 de células HEK293T
    1. Expresar transitoriamente las proteínas MOV10 en células HEK293T cultivadas.
      1. Preparar el plásmido MOV10-pRK5 a una concentración >500 ng/L.
      2. Células de semilla HEK293T en platos de 15 cm. Cuando la densidad celular alcance el 70%-90%, sustituya el medio de cultivo celular por el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contenga un 10% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
      3. Para una transfección, diluir 60 g de ADN plásmido MOV10-pRK5 en 3 ml del medio sérico reducido, luego añadir 120 l del reactivo potenciador de la transfección, y mezclar bien.
      4. En un tubo separado diluir 90 l del reactivo de transfección con 3 ml de medio sérico reducido (sin penicilina-estreptomicina) y mezclar bien.
      5. Añadir el ADN diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
      6. Agregue la mezcla de transfección al cultivo celular y las células de cultivo por 36-48 h.
    2. Después de 36-48 h, recoger las células de cada placa en un tubo de 50 ml. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4oC. Lave cada pellet con 10 ml de PBS helado y recoja las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 oC.
    3. Resuspenda el pellet en 3 ml de tampón de lisis celular que contenga un cóctel completo de inhibidor de proteasa libre de ácido ehylenediaminetetraacético (EDTA). Incubar durante 30 minutos sobre hielo. Centrifugar el lisado a 20.000 x g y 4oC durante 20 min.
    4. Añadir 100 l de perlas magnéticas anti-FLAG por plato de células en un tubo de 1,5 ml.
    5. Lave las perlas magnéticas 2x con tampón K150 (50 mM HEPES a pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).
      1. Resuspenda las perlas magnéticas en 1 ml de tampón K150 helado.
      2. Incubar las perlas magnéticas durante 2 minutos a 4 oC con rotación suave y peletizar las cuentas magnéticas con la ayuda de un imán. Retire y deseche el sobrenadante.
    6. Añadir las perlas magnéticas a la célula lisado sobrenadante desde el paso 1.3.3 e incubar a 4 oC durante 2 h.
    7. Lave las perlas magnéticas unidas a proteínas 3veces con el tampón K150, luego 2x con K150 que contiene 250 mM de NaCl, luego 3x con tampón K150 como 1.3.5.
    8. Resuspender las perlas en 300 l de tampón de elución FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), añadir péptido FLAG a una concentración final de 0,5 g/l, e incubar con perlas en un rotador a 4 oC durante 1 h durante 1 h , a continuación, pellet las cuentas magnéticas con la ayuda de un imán.
    9. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas MOV10 elued, determinar la concentración, y almacenar a -80 oC para su uso futuro.

2. Preparación de ácido nucleico

  1. Comprar ADN y ARN oligonucleótidos (oligos) con o sin etiquetas de biotina de una fuente adecuada. Diluir cada oligo en ddH libre de RNase2O a 20 m y mantenerlo a -80 oC para su uso futuro.
    NOTA: Las secuencias oligodeantes de sustratos de ADN/ARN utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla2.
  2. Preparar la siguiente mezcla para la reacción de recocido de ARN de doble cadena (dsRNA) para el ensayo de actividad de helicaso MOV10: mezclar 60 mM N-2-hidroxietiloganazina-N-ácido sulfonónico (HEPES) a pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 y ddH 2 sin rnalosa O en un volumen de reacción final de 20 l.
  3. Arn oligo formar ARN dúplex calentando una mezcla de la hebra superior etiquetada con biotina (2 m, concentración final) y 1,5 veces su hebra inferior complementaria sin etiquetar en el tampón de recocido (paso 2.2) a 95 oC durante 5 min, y luego enfriarla lentamente hasta la habitación (RT).

3. Ensayos bioquímicos in vitro

  1. EMSA y reacciones enzimáticas
    1. Para el ensayo MEIOB EMSA, mezclar 50 mM Tris HCl a pH 7.5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% NP-40, 0.8 mM (u otras concentraciones relevantes como se muestra en la Figura 2 y Figura 3)MEIOB oligonucleótidos etiquetados con biotina y ddH2O en un volumen de reacción final de 20 l. Incubar a RT durante 30 minutos, y añadir 5x tampón de parada (125 mM EDTA, 50% glicerol) para detener la reacción.
    2. Configure las reacciones de actividad de nucleasa MEIOB como se describe en el paso 3.1.1 pero sin la adición de 10 mM EDTA.
    3. Para el ensayo de actividad de helicase MOV10, mezcle 50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U / L RNase inhibidor, 10 nM biotina-etiquetado ARN sustrato, 2 mM trifosfato de adenosina (ATP), 100 nM trampa de ARN, y 20 ng de proteína MOV10 y ddH2O en un volumen de reacción final de 20 l. Incubar la mezcla de reacción a 37oC durante 10 min, 30 min y 60 min. Añadir el tampón de parada 5x para detener la reacción.
      NOTA: Trampa de ARN, un oligo sin etiqueta biotina con secuencia, complementariedad al oligo etiquetado, que evita que el dsRNA desenrollado se retenga de nuevo.
  2. Geles de poliacrilamida
    1. Lavar las placas de gel (16 cm x 16 cm) y los peines de 1,5 mm. Montar las unidades de electroforesis de gel.
    2. Para preparar un gel de poliacrilamida nativo al 10%, mezcla 14 ml de ddH2O, 1,25 mL de 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8,3 mL de 30% de acrilamida, 1,25 ml de 50% de glicerol, 187,5 l de persulfato de amonio recién preparado al 10% (APS) y 12,5 ml de glicerol al 50%, 187,5 l de persulfato de amonio recién preparado (APS) y 12,5 tetrametiletilendiamina (TEMED).
    3. Para preparar un gel de poliacrilamida 20% nativo, mezclar 5,5 ml de ddH2O, 1,25 ml de 10x TBE, 1,25 ml de 50% de glicerol, 16,7 ml de 30% de acrilamida, 187,5 ml de 10% APS y 12,5 oL de TEMED.
    4. Vierta la solución de acrilamida inmediatamente en el gel e inserte el peine. Deje que la mezcla se polimerice durante aproximadamente 30 minutos.
  3. Gel running
    1. Retire el peine, llene los tanques con el tampón de electroforesis en funcionamiento (0,5x TBE).
    2. Enjuague los pozos de muestra con un tampón TBE de 0,5x y, a continuación, ejecute previamente el gel a 100 V sobre hielo durante 30 minutos.
    3. Cargue muestras de 20-25 l en cada poca.
    4. Usa un gel de acrilamida nativo al 10% para el ensayo EMSA y un gel de acrilamida nativo al 20% para los ensayos enzimáticos. Ejecute la electroforesis a 100 V en el baño de hielo hasta que el marcador azul del bromofenol haya migrado al cuarto inferior del gel.
  4. Desmontar las placas de gel, recortar el gel quitando los pozos de carga y los carriles no utilizados. Coloque el gel en un tampón TBE de 0,5x.
  5. Corte el papel filtrante y la membrana de nylon al tamaño del gel. Humedezca previamente el papel de filtro limpio y la membrana de nylon.
  6. Montar la pila para transferirla.
    1. Coloque la membrana prehúmeda en el papel de filtro prehúmedo.
    2. Coloque el gel sobre la membrana.
    3. Cubra el gel con otra capa de papel de filtro prehúmedo.
    4. Retire todas las burbujas de aire rodando una pipeta limpia de centro a borde.
  7. Transfiera las muestras del gel a la membrana en un aparato electroforético semiseco a 90 mA durante 20 min.
  8. Detenga la transferencia y, a continuación, seque la membrana en un nuevo papel de filtro durante 1 min.
  9. Reticule las muestras irradiando la membrana a 120 mJ/cm2 para 45-60 s en un reticulante de luz UV equipado con bombillas de 254 nm (función de enlace cruzado automático). Seque al aire la membrana a RT durante 30 min.
  10. Detección de quimioluminiscencia
    1. Protocolo 1: Utilice un volumen estándar de kit comercial de detección de ácido nucleico quimioluminiscente.
      1. Añadir 20 ml de tampón de bloqueo a la membrana e incubar durante 15-30 min con un suave temblor en un rotador a 20-25 rpm.
      2. Prepare la solución de tampón conjugado/bloqueo añadiendo 66,7 ml de conjugado de peroxidasa de estripaviovidina-baramán estabilizado de 66,7 l a 20 ml de tampón de bloqueo.
      3. Retire suavemente el búfer de bloqueo y reemplácelo con el búfer conjugado/bloqueo. Incubar durante 15 minutos en un rotador a 20-25 rpm.
      4. Lavar la membrana 4x con agitación a 40-45 rpm durante 5 min cada una.
      5. Añadir 30 ml de tampón de equilibrio de sustrato a la membrana. Incubar la membrana durante 5 min con agitación a 20-25 rpm.
      6. Preparar la solución de trabajo del sustrato añadiendo 6 ml de solución luminol/enhancer a 6 ml de solución estable de peróxido. Evite la luz.
      7. Cubrir toda la superficie de la membrana con solución de trabajo de sustrato e incubar durante 5 min.
      8. Escanee la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscente durante 1-3 s.
    2. Protocolo 2: Utilice 2 x kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente comercial diluido 2 veces y siga los pasos 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protocolo 3: Utilice reactivos autofabricados6.
      1. Prepare el tampón de bloqueo: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2y 3% de albúmina sérica bovina Fracción V. AP 7,5 buffer: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 7,5, 0,1 M NaCl y 2 mM MgCl2. Búfer AP 9.5: mezclar 0,1 M Tris-HCl a pH 9,5, 0,1 M NaCl y 50 mM MgCl2. Tampón TE: mezclar 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 1 mM EDTA a pH 8.0.
      2. Remoje la membrana en tampón de bloqueo a 30 oC durante 1 h.
      3. Añadir 8,5 ml de fosfatasa alcalina de estreptavidina a 10 ml de AP 7,5 Tampón. Agitar suavemente la membrana en esta solución a RT durante 10 min. A continuación, lave la membrana 2x en 15 ml de tamón AP 7.5 durante 10 min.
      4. Lave la membrana una vez más en 20 ml de tampón AP 9.5 durante 10 min. Añadir 20 ml de tampón TE para detener la reacción.
      5. Añadir 7,5 ml de solución de desarrollo a la membrana, y escanear la membrana en un sistema de imágenes quimioluminiscente durante 1-3 s.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La estructura proteica de MEIOB y las construcciones de expresión utilizadas en este estudio se ilustran en la Figura 1A. Los pliegues OB en MEIOB son estructuras compactas similares a barriles que pueden reconocer e interactuar con ácidos nucleicos de una sola cadena. Uno de los dominios OB (aa 136-307, construir A) une ADN trenzado único (ssDNA), la proteína truncada (aa 136-178 truncamientos, construcción C) y la forma mutante de punto (mutación R235A, construcción E) de ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Investigar las interacciones proteína-ácido nucleico es fundamental para nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a diversos procesos biológicos. Por ejemplo, MEIOB es una proteína específica para la meiosis y la fertilidad en mamíferos25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB que se une al ADN de una sola cadena y exhibe una actividad de exonucleasa de 3' a 5'26,que se relaciona directa...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a P. Jeremy Wang (Universidad de Pensilvania) por ediciones y discusiones útiles. También agradecemos a Sigrid Eckardt por la edición de idiomas. K. Z. contó con el apoyo del Programa Nacional Clave de I+D de China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) y la National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81471502, 31871503) y el Programa Innovador e Empresarial de la Provincia de Jiangsu. J. N. contó con el apoyo de Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771588) y el 1000 Youth Talent Plan.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

TM
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipment
Imágenes QuimioluminiscentesTanon, China5200
Sonífero digitalBranson, EE. UU.BBV12081048A450 vatios; 50/60 HZ
Revólver de tubo Cristal, EE. UU3406051
reticulante de luzUVP UVP, EE. UUCL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Milipore, EE. UU.UFC801096de 4 ml/10 K
Thermo Scientific, EE. UU
Plato de cultivo tratado con TCCorning, EE. UU430167100 mm 
Plato de cultivo tratado con TCCorning, EE. UU430597150 mm 
Microtubostubos AXYGEN, USAMCT-150-C1.5 mL 
Tubos Corning, EE. UU43079115 mL
Reactivos 
desarrollo de color de fosfatasa alcalinaBeyotime, ChinaC3206
Reactivo Sigma, EE. UU107M4071V
ClonExpress II kit de clonación de un solo paso Vazyme, ChinaC112
Kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscenteThermo Scientific, EE. UU.T1269950
dNTPSigma-Aldrich, EE. UU.DNTP100-1KT
DMEMGibco, EE. UU.10569044
tampón DPBSGibco, EE. UU.14190-136
EDTA Invitrogen, EE. UU.AM9260G0,5 m
cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTARoche, EE. UU.04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit Vazyme, China 
DC202
FastPure Gel Mini Kit de Extracción de ADNVazyme, ChinaDC301-01
FBSGibco, Estados Unidos10437028
FLAG péptidoSigma, Estados UnidosF4799
GlicerolSigma, Estados UnidosSHBK3676
GST Bulk KitGE Healthcare, Estados Unidos27-4570-01
Tampón HEPESSigma, Estados UnidosSLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific, EE. UU34060
KoAcSangon Biotech, China127-08-02
Reactivo de transfección Lipofectamin 3000Thermo Scientific, EE. UU.L3000001
MgCl2Invitrogen, EE. UU.AM9530G1 M
NaClInvitrogen, EE. UU. AM9759
 		5 M 
NP-40Amresco, EE. UU.M158-500ML
Medio Opti-MEMGibco, EE. UU.31985062
PBSGibco, EE. UU.10010023PH 7.4
Inhibidor de la RNasaPromega, EE. UU.N251B
Estreptavidina fosfatasa alcalinaPromega, EE. UUV5591
TBEInvitrogen, EE. UU15581044
Tampón Tris-HCI Invitrogen, EE. UU.155670271 M, PH 7.4
Tampón Tris-HCI Invitrogen, EE. UU.155680251 M, PH 8.0
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560
Centrífuga Eppendorf, Alemania 5242R Sistema de Secante electroforético semiseco Hoefer, EE. UU. TE77XP . . Membrana de nailon . TG263940A . . . Ampicilina SunShine Bio, China 8h288h28 Perlas magnéticas Anti-FLAG M2 Sigma, EE. UU. M8823 ATP Thermo Scientific, EE. UU. 591136 BCIP/NBT Kit de CelLytic M Cell Lysis . . . .

Referencias

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788(2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Marcaje con biotinaEnsayo de desplazamiento de movilidad electroforéticaUnión al ADN de MEIOBActividad helicasa de MOV10Ácidos nucleicos marcados con biotinaDetección por quimioluminiscenciaAnálisis por Western blotTinción con azul de Coomassie
Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.