Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Resumen

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Resumen

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína desempeñan un papel importante en procesos biológicos como la transcripción, la recombinación y el metabolismo del ARN. Los métodos experimentales para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos requieren el uso de etiquetas fluorescentes, isótopos radiactivos u otras etiquetas para detectar y analizar moléculas diana específicas. La biotina, una etiqueta de ácido nucleico no radiactivo, se utiliza comúnmente en los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), pero no se ha empleado regularmente para controlar la actividad proteica durante los procesos de ácido nucleico. Este protocolo ilustra la utilidad del etiquetado de la biotina durante las reacciones enzimáticas in vitro, demostrando que esta etiqueta funciona bien con una gama de diferentes ensayos bioquímicos. Específicamente, en consonancia con los hallazgos anteriores utilizando sustratos marcados con radioisótopos ³²P, se confirma a través de EMSA etiquetada con biotina que MEIOB (una proteína específicamente implicada en la recombinación meiótica) es una proteína de unión al ADN, que MOV10 (una Helicase de ARN) resuelve estructuras dúplex de ARN etiquetadas con biotina, y ese MEIOB corta ADN de cadena única etiquetado por biotina. Este estudio demuestra que la biotina es capaz de sustituir ³²P en diversos ensayos bioquímicos relacionados con el ácido nucleico in vitro.

Introducción

Las interacciones entre ácido sulfúrico y proteína están involucradas en muchos procesos celulares esenciales, como la reparación del ADN, la replicación, la transcripción, el procesamiento de ARN y la traducción. Las interacciones proteicas con secuencias de ADN específicas dentro de lacromatina son necesarias para el control estricto de la expresión génica en el nivel de transcripción 1. La regulación posttranscripcional precisa de numerosos ARN de codificación yno codificación requiere interacciones extensas y complicadas entre cualquier proteína y ARN 2. Estas capas de mecanismo regulador de la expresión génica compr....

Protocolo

1. Preparación de proteínas

1. Construcciones de expresión MEIOB y MOV10
   1. Generar construcciones de expresión cDNA codificando el mouse MEIOB-A, C y E (Figura1A)y MOV10.
      1. Configure las reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada fragmento. Mezclar 1 l de ADNc del ratón (a partir de C57BL/6 mouse testis), 1 l de dNTP, 2 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 2 ml de imprimación inversa de 10 m, 1 l de polimerasa de ADN, 25 ml de 2 x tampón de PCR y 18 ml de H 2 O destilado doble (ddH 2 O) en una fase final de 2O de ADN y 18 o L de H₂O (ddH₂O) en una volumen ....

Resultados

La estructura proteica de MEIOB y las construcciones de expresión utilizadas en este estudio se ilustran en la Figura 1A. Los pliegues OB en MEIOB son estructuras compactas similares a barriles que pueden reconocer e interactuar con ácidos nucleicos de una sola cadena. Uno de los dominios OB (aa 136-307, construir A) une ADN trenzado único (ssDNA), la proteína truncada (aa 136-178 truncamientos, construcción C) y la forma mutante de punto (mutación R235A, construcción E) de .......

Discusión

Investigar las interacciones proteína-ácido nucleico es fundamental para nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a diversos procesos biológicos. Por ejemplo, MEIOB es una proteína específica para la meiosis y la fertilidad en mamíferos^25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB que se une al ADN de una sola cadena y exhibe una actividad de exonucleasa de 3' a 5'^26,que se relaciona directa.......

Materiales

^TM

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipment
Imágenes Quimioluminiscentes	Tanon, China	5200
Sonífero digital	Branson, EE. UU.	BBV12081048A	450 vatios; 50/60 HZ
Revólver de tubo	Cristal, EE. UU	3406051
reticulante de luz	UVP UVP, EE. UU	CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter	Milipore, EE. UU.	UFC801096	de 4 ml/10 K
	Thermo Scientific, EE. UU
Plato de cultivo tratado con TC	Corning, EE. UU	430167	100 mm
Plato de cultivo tratado con TC	Corning, EE. UU	430597	150 mm
Microtubos	tubos AXYGEN, USA	MCT-150-C	1.5 mL
Tubos Corning	, EE. UU	430791	15 mL
Reactivos
desarrollo de color de fosfatasa alcalina	Beyotime, China	C3206
Reactivo	Sigma, EE. UU	107M4071V
ClonExpress II kit de clonación de un solo paso	Vazyme, China	C112
Kit de detección de ácido nucleico quimioluminiscente	Thermo Scientific, EE. UU.	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, EE. UU.	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, EE. UU.	10569044
tampón DPBS	Gibco, EE. UU.	14190-136
	EDTA Invitrogen, EE. UU.	AM9260G	0,5 m
cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA	Roche, EE. UU.	04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit	Vazyme, China	DC202
FastPure Gel Mini Kit de Extracción de ADN	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, Estados Unidos	10437028
FLAG péptido	Sigma, Estados Unidos	F4799
Glicerol	Sigma, Estados Unidos	SHBK3676
GST Bulk Kit	GE Healthcare, Estados Unidos	27-4570-01
Tampón HEPES	Sigma, Estados Unidos	SLBZ2837	1 M
IPTG	Thermo Scientific, EE. UU	34060
KoAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
Reactivo de transfección Lipofectamin 3000	Thermo Scientific, EE. UU.	L3000001
MgCl2	Invitrogen, EE. UU.	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, EE. UU	. AM9759	5 M
NP-40	Amresco, EE. UU.	M158-500ML
Medio Opti-MEM	Gibco, EE. UU.	31985062
PBS	Gibco, EE. UU.	10010023	PH 7.4
Inhibidor de la RNasa	Promega, EE. UU.	N251B
Estreptavidina fosfatasa alcalina	Promega, EE. UU	V5591
TBE	Invitrogen, EE. UU	15581044
Tampón Tris-HCI	Invitrogen, EE. UU.	15567027	1 M, PH 7.4
Tampón Tris-HCI	Invitrogen, EE. UU.	15568025	1 M, PH 8.0
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560

Centrífuga Eppendorf, Alemania 5242R Sistema de Secante electroforético semiseco Hoefer, EE. UU. TE77XP . . Membrana de nailon . TG263940A . . . Ampicilina SunShine Bio, China 8h288h28 Perlas magnéticas Anti-FLAG M2 Sigma, EE. UU. M8823 ATP Thermo Scientific, EE. UU. 591136 BCIP/NBT Kit de CelLytic M Cell Lysis . . . .