Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).
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Artículo de método
Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos
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Resumen
Resumen
Los fibroblastos adultos primarios se han convertido en una herramienta importante para estudiar la fibrosis, las interacciones con los fibroblastos y la inflamación en todos los tejidos del cuerpo. Dado que los fibroblastos primarios no pueden dividirse indefinidamente debido a la diferenciación de miofibroblastos o a la inducción de la senescencia, se deben establecer periódicamente nuevos cultivos. Sin embargo, hay varios obstáculos que superar durante los procesos de desarrollo de un protocolo de aislamiento fiable y el aislamiento primario de fibroblastos en sí: el grado de dificultad del método (especialmente para principiantes), el riesgo de contaminación bacteriana, el tiempo necesario hasta que los fibroblastos primarios se puedan utilizar para experimentos, y la posterior calidad celular y viabilidad. En este estudio, se proporciona un protocolo rápido, confiable y fácil de aprender para aislar y cultivar fibroblastos adultos primarios del corazón del ratón, pulmón, hígado y riñón combinando digestión enzimática y agitación ultrasónica.
Introducción
Los fibroblastos son células planas en forma de husillo con múltiplesprocesos estelares y un extenso retículo endoplasmático áspero 1,2. Un fibroblasto medio mide 30 - 100 m y tiene una vida útil de 57 a 3 días1,3. La duración media del ciclo celular de los fibroblastos humanos oscila entre 16 y 48 h dependiendo de las condiciones de cultivo4. Existe evidencia de que la capacidad replicativa y la calidad funcional de los fibroblastos primarios cultivados se correlacionan negativamente con la edad del donante, lo que sugiere que se debe preferir a los donantes más jóvenes (animales o pacientes) si es posible5,6 .
Los fibroblastos constituyen un tipo celular predominante de la mayoría de los tejidos corporales de mamíferos. A pesar de su presencia omnipresente, la identificaciónmolecular de los fibroblastos sigue siendo un desafío 7. Los fibroblastos migran a desarrollar tejidosy órganos de diferentes fuentes durante el desarrollo embrionario 8. Por esta razón, hay una plétora de proteínas marcadoras que se pueden encontrar en los fibroblastos, mientras que las proteínas marcadoras únicas, que están presentes en cada población de fibroblastos y exclusivas de los fibroblastos, todavía faltan. Por lo tanto, los patrones de expresión de varios marcadores reconocidos se utilizan generalmente para identificar fibroblastos. Entre los marcadores más reconocidos se encuentran la vimentina, la proteína superficial de fibroblastohumano humano (hFSP), el receptor de dominio de discoicina 2 (DDR2) y la actina muscular alfa suave (SMA).
Los fibroblastos son el tipo de célula que produce la matriz extracelular principal (ECM). De este tipo, los fibroblastos mantienen una arquitectura de tejido ordenada y proporcionan soporte mecánico para las células vecinas1. El equilibrio entre la síntesis y la degradación de ECM es un proceso bien regulado. Los cambios hacia la síntesis marcan el comienzo de una deposición excesiva de ECM que, si no se termina, conduce a la fibrosis. La fibrosis está mediada por miofibroblastos, que se originan a partir de fibroblastos activados sometidos a cambios moleculares y fenotípicos. Una característica distintiva de los miofibroblastos es la secreción mejorada de ECM y citoquinas y la expresión de microfilamentos ordenados de la ACM9.
Los fibroblastos primarios han estado en el centro de atención de investigaciones recientes centradas en la fibrosis, la inflamación de los tejidos y las interacciones fibroblastos-cáncer-células10,11. Sin embargo, para estudiar eficazmente las propiedades de los fibroblastos en la salud y la enfermedad, es necesario aislar los fibroblastos adultos primarios viables de forma regular. Existen varios métodos disponibles para aislar fibroblastos12,13,14. Los tres principales métodos de aislamiento de fibroblastos son el crecimiento de los trozos de tejido12,la digestión de tejido enzimático15,y la perfusión enzimática de órganos huecos9,13,16. La ventaja del crecimiento es un proceso de aislamiento suave sin degradación celular enzimática. Por otro lado, los cultivos de crecimiento generalmente requieren períodos de cultivo prolongados hasta que las células se pueden utilizar para experimentos. La digestión enzimática común es rápida, pero conlleva un riesgo de contaminación con otros tipos de células (por ejemplo, células endoteliales) o bacterias en el proceso de agitación, que es necesario para disolver mecánicamente el tejido. Además, estos métodos a menudo son elaborados y requieren tiempo y habilidad para aprender.
En cuanto a la importancia de los fibroblastos primarios en la investigación, todavía es necesario optimizar los enfoques de aislamiento celular existentes en términos de rapidez, simplicidad y fiabilidad. Aquí, se proporciona un nuevo método de aislamiento de fibroblastos enzimáticos a base de ultrasonidos que proporciona células de alta calidad.
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Protocolo
El siguiente protocolo sigue las directrices institucionales de cuidado de animales de la Universidad Tecnológica de Dresde, Alemania (Número de fichero: T 2014/4), así como las directrices de cuidado animal internacionalmente aceptadas (FELASA)17. La Figura 1 visualiza el proceso de aislamiento de celda.
1. Preparación de la configuración, material y medios de
- Preparar el medio de cultivo celular, solución de PBS, solución de mezcla de colagenasa (reconstituir 50 mg de mezcla de colagenasa liofilizada en 12 ml de agua ultrapura estéril) y 0.25% de solución de trippsina.
- Calentar el medio, el PBS y la solución de trippsina a 37 oC.
- Precalentar el baño de agua ultrasónica a 37 oC.
- Desinfecte fórceps, una espátula de acero inoxidable, bisturíes (2 x bisturíes por órgano) y 2 vasos de vidrio con 70% de etanol y coloque estos materiales debajo de la campana de cultivo celular.
- Llene un vaso de precipitados con 70% de etanol y el otro con agua estéril o solución de PBS. Estos vasos son necesarios para desinfectar y lavar el instrumento después de cada procesión de órgano.
- Coloque tubos de plástico estériles de 15 ml que contengan PBS frío sobre hielo húmedo. El número de tubos depende del número de órganos de los que desea aislar los fibroblastos.
2. Disección del ratón y extracción de órganos
- Use dos pares de guantes uno encima del otro, por lo que el primer par se puede quitar tan pronto como el animal ha sido diseccionado.
NOTA: Este procedimiento evita que las bacterias del pelaje y la piel del animal se propaguen sobre los órganos. - Eutanasia el ratón (p. ej., luxación cervical) y clava la carcasa con agujas en cada extremidad a una almohadilla de poliestireno.
- Desinfecte la carcasa del ratón con un 70% de pulverización de etanol. Asegúrese de que el pelaje esté empapado en etanol para que el cabello no se arremolina.
- Cortar el pelaje justo por encima del tracto urogenital usando fórceps quirúrgicos y tijeras atraumáticas. Cortar la piel junto a la línea media desde el punto de la incisión inicial hasta el cuello (3 - 4 cm) y añadir cortes de alivio en las extremidades.
ADVERTENCIA: ¡No perfore la capa muscular en este paso para evitar la contaminación bacteriana! - Anclar la piel a la almohadilla de espuma de poliestireno para tener un acceso óptimo a la musculatura que cubre la cavidad abdominal.
- Desinfectar la musculatura abdominal dos veces con 70% de etanol. Deje que el etanol se seque antes de continuar con el siguiente paso.
- Retire el primer par de guantes. Usa un nuevo conjunto estéril de fórceps y tijeras.
- Abra la cavidad abdominal y el tórax inclinando la capa muscular con tijeras quirúrgicas para eliminar suavemente los órganos de elección. Por lo tanto, sostenga el órgano suavemente con fórceps quirúrgicos (no perfore el órgano, use una presión mínima) y corte los vasos sanguíneos suministradores cerca del punto de entrada en el órgano con tijeras.
- Coloque los órganos en los tubos estériles que contienen PBS frío. Cierre bien los tubos. Coloque los tubos sobre hielo húmedo hasta que continúe con el paso 3.1.
3. Picado de tejido, digestión y extracción celular
- Transfiera los tubos debajo de la campana de cultivo celular estéril.
ADVERTENCIA: Use un par de guantes frescos y desinfecte los tubos con 70% de etanol antes de transferirlos bajo el capó! - Saque el órgano del tubo de 15 ml con fórceps estériles. Coloque el órgano en la mitad de una placa estéril de 6 cm de Petri y lave el órgano brevemente con PBS para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el órgano a la segunda mitad de la placa de Petri, elimine el exceso de PBS.
- Mince el tejido usando dos bisturíes estériles. Los fragmentos de tejido restantes no deben ser mayores de 1 - 2 mm.
- Transfiera el tejido picado a un nuevo tubo estéril de 15 ml utilizando la espátula estéril y agregue 2 ml de solución de trippsina al 0,25%. Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular a 37 oC durante 5 minutos.
- Vortex el tubo suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Detenga la reacción de trippsina bajo el capó del cultivo celular agregando un medio de cultivo celular que contiene FCS de 4 ml (medio de águila modificado (DMMEM) de Dulbecco, por ejemplo).
- Añadir 250 l de solución de mezcla de colagenasa a cada tubo que contenga tejido cardíaco o pulmonar y 100 l para riñón o hígado, respectivamente.
- Colocar los tubos en un baño de agua ultrasónico (37 oC) y activar el sonicador ultrasónico durante 10 minutos.
NOTA: El baño de agua ultrasónico utilizado en este protocolo tiene una frecuencia de funcionamiento de 35 kHz y una potencia máxima de 320 W. - Vortex los tubos suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Coloque los tubos de nuevo en el baño de agua ultrasónico durante 10 minutos.
- Vórtice suavemente (circa 1400/min) durante 10 s.
- Desinfectar los tubos con 70% de etanol y transferirlos bajo la campana de cultivo celular estéril.
- Filtrar la solución con una malla de 40 m en un nuevo tubo estéril de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio fresco.
- Transfiera las células a un recipiente de cultivo celular adecuado (p. ej., placa de 6 pocillos) ycoloque el recipiente en la incubadora de cultivo celular durante la noche a 37 oC y 5% CO 2.
- Al día siguiente, retirar el medio, lavar 3 veces con PBS, a continuación, añadir medio fresco (el volumen añadido depende del recipiente de cultivo celular de elección, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos, etc.).
- Cambia el medio cada dos días.
NOTA: Los fibroblastos se pueden dividir después de alcanzar una confluencia óptica del 90% (generalmente después de 5-7 días).
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Resultados
Se demostró la capacidad de este protocolo para aislar los fibroblastos adultos del tejido murino sólido. Se obtuvieron fibroblastos viables que podrían utilizarse para experimentos posteriores, como la tinción de inmunofluorescencia o experimentos de proliferación (Figura2D-F, Figura 5A).
Los fibroblastos adultos son células planas en forma de husillo con múltiples procesos celulares que normalmente ...
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Discusión
En comparación con las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas, los fibroblastos primarios ofrecen varias ventajas. Pueden ser aislados de manera rentable en alta calidad y cantidad. Además, los cultivos primarios ofrecen la posibilidad de estudiar células de múltiples individuos, lo que aumenta la fiabilidad de los resultados obtenidos y disminuye la probabilidad de estudiar simplemente los artefactos de cultivo celular. La generación continua de nuevos cultivos primarios previene las alteraciones genéticas que ...
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Sra. Romy Kempe y a la Sra. Annett Opitz el apoyo técnico de expertos. También damos las gracias al Sr. Bjoern Binnewerg por el apoyo de TI. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de a) el Dresdedrner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsf-rderprogramm f'r Frauen", Facultad de Medicina Carl Gustav Carus Dresden y c) Else Kr'ner-Forschungskolleg (EKFK) Facultad de Medicina Carl Carus Dresden. Agradecemos la financiación y el apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.25% Tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | T4049-100ML | |
| Antibióticos | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, EE. UU | . Gibco LS15140148 | Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL) |
| Campana de cultivo celular | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Incubadora de cultivo celular | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 50049176 | BBD 6220 |
| Placas de cultivo celular | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | depende del buque | de 6, 12 y 24 pocillos Superficie Nunclon Aspiración |
| de cultivo celular | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Alemania | 20727400 | BVC Filtro de células de succión profesional |
| (malla) | Corning, Tewksbury, EE. UU | 431750 | 40 µ m |
| Centrífuga de | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 75007213 | Megafuge 8R |
| Controlador de pipeteo inalámbrico | Hirschmann, Eberstadt, Alemania | 9907200 | Pipetus |
| Puntas de pipeta desechables | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | depende del volumen | Puntas SafeSeal para pipetas (10 y micro; L, 20 y micro; L, 100 y micro; L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L) |
| Pipetas de plástico desechables | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | depende del volumen | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL |
| Bisturí estéril desechable | Myco Medical, Cary, EE. UU | N.A.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | Tubos |
| Eppendorf de | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | depende del volumen | 50 y micro; L, 500 y micro; L, 1.500 y micro; L, 2.000 y micro; L |
| Suero fetal para terneros (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | F2442-50ML | |
| Mezcla de colagenasa | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | 5401020001 | grado de investigación Liberase TL |
| 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | P5481-500EA | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU. | D8537-500ML | 500 mL |
| kit de detección de senescencia | Abcam, Cambridge, Reino Unido | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Alemania | n.a.MS2 | Minishaker (modelo posterior: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Tubos de plástico estériles | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | Tubos Falcon 352095 | BD Falcon (15 mL, 50 mL) |
| Baño de agua ultrasónico | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlín, Alemania | 312 | Sonorex RK100H |
| Tijeras quirúrgicas (atraumáticas) | Aesculap AG, Tuttlingen, Alemania | NR 82 | |
| Tijeras quirúrgicas | Aesculap AG, Tuttlingen, Alemania | eq 1060.09 | |
| Pinza quirúrgica | Aesculap AG, Tuttlingen, Alemania | BD577 |
Referencias
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
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