Method Article

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

DOI:

10.3791/59875

⸱

June 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La espectrometría de masas de una sola célula (SCMS) permite la detección sensible y el análisis preciso de amplios rangos de especies celulares a nivel de células individuales. La sonda única, un dispositivo de muestreo e ionización a microescala, se puede acoplar con un espectrómetro de masas para el análisis Rápido y en línea de SCMS de componentes celulares en condiciones ambientales. Anteriormente, la técnica SCMS de una sola sonda se utilizaba principalmente para medir las células inmovilizadas en un sustrato, limitando los tipos de células para los estudios. En el estudio actual, la tecnología SCMS de una sola sonda se ha integrado con un sistema de manipulación celular, normalmente utilizado para la fertilización in vitro. Esta plataforma integrada de manipulación y análisis de células utiliza una sonda de selección de células para capturar células flotantes individuales identificadas y transferir las células a la punta de una sola sonda para la lisis de microescala, seguida de un análisis inmediato de espectrometría de masas. Este proceso de captura y transferencia elimina las células de la solución circundante antes del análisis, minimizando la introducción de moléculas de matriz en el análisis de espectrometría de masas. Esta configuración integrada es capaz de analizar SCMS de células aisladas por pacientes dirigidas presentes en muestras de fluidos corporales (por ejemplo, orina, sangre, saliva, etc.), lo que permite posibles aplicaciones de análisis SCMS a la medicina humana y la biología de enfermedades.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biología humana, especialmente la biología de la enfermedad, se entiende cada vez más como el resultado de actividades a nivel de células individuales, pero los métodos analíticos tradicionales, como la espectrometría de masas de cromatografía líquida (LCMS), se utilizan generalmente para analizar muestras preparadas a partir de poblaciones de células, mientras que la información molecular adquirida no puede representar con precisión los procesos químicos a nivel de células individuales. Estos métodos tradicionales estándar son incapaces de discernir los efectos de la heterogeneidad celular en una medición analítica, y el proceso de destrucción y mezcla de las células para preparar el lisado potencialmente conduce a la alteración o pérdida de la componentes1,2. Estas limitaciones de los métodos tradicionales son especialmente importantes en el análisis de las células del paciente, en el que las muestras obtenidas pueden contener una mezcla compleja de muchos tipos de células diferentes. Para superar estas deficiencias, los métodos de análisis molecular de una sola célula, incluidos los métodos de espectrometría de masas de una sola célula (SCMS), se están desarrollando y aplicando cada vez más al bioanálisis, especialmente de metabolitos celulares y bajo peso molecular biomoléculas3,4.

Las primeras técnicas SCMS desarrolladas utilizaron técnicas basadas en vacío para realizar los análisis en condiciones no ambientales2,5,6,7,8,9, 10,11. Las técnicas SCMS no ambientales son capaces de analizar lípidos celulares y metabolitos, pero requieren pretratamiento de muestras en condiciones artificiales, y por lo tanto no son adecuadas para el análisis en tiempo real. El proceso de preparación de muestras para el análisis no ambiental incluye la adición de componentes de matriz, y esta preparación puede alterar los componentes celulares de su entorno natural12. Por lo tanto, las técnicas de espectrometría de masas ambientales (MS), que no requieren un vacío para el entorno de muestreo, se utilizan para analizar las células en un entorno casi nativo. No tener un entorno de vacío permite versatilidad en el diseño experimental; cámaras se pueden agregar para monitorear el proceso celular y las técnicas de ionización más suaves se pueden combinar con técnicas de separación para recibir mejor información de cada experimento de una sola célula4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

El método SCMS de una sola sonda es una técnica ambiental que analiza líneas celulares de cáncer de mamíferos vivos en un entorno casi nativo21,43,44,45,46. Además, el dispositivo de una sola sonda se ha utilizado para otras aplicaciones de espectrometría de masas, incluyendo el análisis de moléculas extracelulares en esferoides multicelulares e imágenes de EM de tejidos47,48,49 ,50,51,52. Sin embargo, dado que la inmovilización celular en sustratos es necesaria para este método, las células de suspensión no se pueden analizar directamente utilizando esta técnica3,53. Por lo tanto, el sistema SCMS de una sola sonda no se podía utilizar directamente para muestrear células individuales no adherentes, como líneas celulares no adherentes o células de suspensión aisladas de la sangre de un paciente u otros fluidos corporales54. En este trabajo, se combina una plataforma de manipulación de células integrada (ICMP) con la técnica SCMS de una sola sonda para analizar células de suspensión en línea en vivo con una preparación mínima de la muestra (Figura 1)46. El ICMP consiste en un microscopio invertido para monitorear la selección celular, una sonda de selección de celdas de vidrio, un microinyector para capturar células flotantes individuales, una placa calentada para mantener la temperatura celular, dos sistemas de manipulación celular para controlar el espacio movimientos tanto de la sonda de selección de células de vidrio como de una sola sonda, y un microscopio digital para observar la transferencia celular desde la punta de la sonda de selección de células a la punta de una sola sonda. La fabricación de la sonda única se detalla en publicaciones anteriores y no se abordará aquí21,48. El sistema ICMP/de una sola sonda está acoplado a un espectrómetro de masas de alta resolución. Esta configuración integrada permite el muestreo de células únicas identificadas a partir de muestras biológicas complejas con efectos mínimos de moléculas de matriz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricación de la sonda de selección de celdas de vidrio

  1. Convierta tubos de vidrio de un solo diámetro en una sonda cónica con una punta afilada.
    1. Coloque un tubo de vidrio de un solo orificio (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) en las abrazaderas de un soporte de pipeta vertical, centrando el vidrio con respecto a la bobina de calentamiento y apriete para fijar el tubo en su lugar. La bobina de calentamiento se compone de un alambre de resistencia al níquel-cromo de calibre 18 (60 mm de longitud) enrollado alrededor de una varilla metálica (diámetro de 3,90 mm) 2,5 veces.
    2. Ajuste el tubo de vidrio con el programa de temperatura 19.5 (unidad del fabricante). Este parámetro se puede modificar para un instrumento en particular.
    3. Ajuste el émbolo solenoide a 4 (unidad del fabricante). Este parámetro se puede modificar para un instrumento en particular.
    4. Activa el solenoide para tirar del tubo de vidrio. Este paso crea dos sondas fusionadas en la punta.
    5. Utilice pinzas para cortar 1 mm de distancia de la punta de cada sonda, creando un orificio de 10 m de diámetro en la punta de la sonda.
  2. Doble la sonda de vidrio para facilitar el acoplamiento a la configuración SCMS ICMP/de una sola sonda.
    1. Coloque una sonda de vidrio tirado en la microforja, colocando la punta de 3 mm por encima del cable de calentamiento de platino.
    2. Gire el calor del cable de platino al 30% de la temperatura máxima.
    3. Doble la sonda a 45o desde la posición original (Figura2).

2. Ensamblaje integrado de la plataforma de manipulación celular

  1. Coloque el microscopio invertido, el microinyector y dos sistemas de manipulación celular en una mesa motorizada para facilitar el acoplamiento con el espectrómetro de masas.
    1. Modifique uno de los sistemas de manipulación celular para acomodar una sola sonda reemplazando el extremo por una abrazadera de brazo.
    2. Utilice una jeringa de plástico con una aguja para llenar el microinyector con aceite mineral. Evite las burbujas en el tubo, ya que esto afectará la succión.
    3. Sustituya la inserción del escenario del microscopio invertido por la placa calentada. Fije la placa calentada a 37 oC antes del análisis.
  2. Configure el dispositivo de selección de celdas de vidrio.
    1. Inserte la sonda de selección de celda de vidrio dentro del soporte metálico del microinyector colocando el lado largo (no doblado) en el soporte capilar y apretando el tornillo para fijar la sonda en su lugar. Coloque el ángulo de la punta de la sonda paralelo a la placa calentada.
      ADVERTENCIA: La sonda de vidrio es muy afilada y frágil, y se rompe fácilmente. Proteja sus ojos y tenga mucho cuidado al insertar la sonda en el microinyector.
    2. Fije el soporte metálico del microinyector en el sistema de manipulación celular. Coloque la punta de la sonda cerca del centro de la luz invertida del microscopio.

3. Cree un tubo de transferencia de iones extendido para la entrada del espectrómetro de masas

  1. Utilice una cortadora de metal para cortar una pieza de tubo de acero inoxidable (OD: 0.0625 (1/16) in, ID: 0.021 in) a 250 mm de longitud.
  2. Mida 135 mm desde el extremo y coloque un asco metálico para que 135 mm se exponga a la atmósfera y 115 mm estarán dentro del espectrómetro de masas. Asegure el asco usando dos llaves para apretarla.

4. Acople el ICMP con una configuración de una sola sonda

  1. Fije la corredera de vidrio que contiene la sonda única en la abrazadera del brazo del sistema de manipulación celular.
    NOTA: Las sondas individuales se fabrican de acuerdo con un protocolo48 publicado anteriormente con dos cambios menores en el estudio actual: el emisor nano-ESI se hace más largo para facilitar el acoplamiento al espectrómetro de masas, y las sondas individuales se pegan al vidrio lado en el lado derecho para evitar interferir con el movimiento espacial del dispositivo de selección de celda de vidrio (Figura 2).
  2. Conecte el capilar que proporciona disolvente a una unión conductora colocando el capilar en el manguito (1/16 x .005 pulg.) de la férula de plástico y apretando el accesorio con los dedos.
    1. Conectar el otro lado de la unión conductora a un capilar (ID: 40 m, OD: 150 m), que se conecta a una jeringa que contiene el disolvente de muestreo, colocando el capilar en el manguito (1/32 x .007 pulg.) y apretando el accesorio. Utilice acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico como disolvente de muestreo en estos experimentos.
      NOTA: El disolvente de muestreo es flexible, pero debe contener principalmente acetonitrilo (o acetonitrilo con ácido fórmico para una mejor ionización) para una lisis celular de microescala rápida.
    2. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa en el espectrómetro de masas.
    3. Coloque el cable de tensión de ionización en un cable de cobre conectado a la unión conductora.
  3. Coloque el emisor nano-ESI a 1 mm en el orificio del tubo de transferencia de iones extendido.
    1. Utilice el sistema de manipulación celular para controlar los movimientos espaciales de la sonda única y colocar el emisor nano-ESI centralmente delante del tubo de transferencia de iones extendido.

5. Preparación de muestras de células suspendidas

  1. El día antes del análisis (-18-24 h), las células de salida de semillas para su prueba en un matraz de cultivo celular (T25). K562 células de leucemia mieloide humana se utilizan como modelos en este estudio.
    1. Caliente 1x fosfato tamponado salino (PBS) y Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio complementado con 10% suero bovino fetal sintético (FBS) y 1% penicilina-estreptomicina a 37 oC durante 30 min.
    2. Semilla s 1 x 106 células en un volumen total de 10 ml mediante la combinación de células con medio cálido. En general, utilice una pipeta de 10 ml para colocar 8 ml de medio RPMI en un matraz de cultivo celular. A continuación, utilice una pipeta de 2 ml para poner 2 ml de células K562 confluentes en el medio para 1 x 106 células.
    3. Incubar las células a 37oC y 5%co2 hasta su análisis.
  2. Prepare las células para el análisis.
    1. Pipetear las células del matraz de cultivo celular en un tubo centrífugo de 15 ml.
    2. Gire las células hacia abajo a 400 x g y 37 oC durante 5 min y deseche el sobrenadante.
    3. Resuspender las células en 4 ml de medio RPMI que contiene el compuesto del fármaco a la concentración de tratamiento deseada.
      NOTA: Para el análisis de celdas de control, vuelva a suspender las celdas en 4 ml de medio RPMI y vaya al paso6.
    4. Incubar las células durante el tiempo de tratamiento a37oC y 5% co2 .
    5. Esgire las células a 400 x g y 37 oC durante 5 min.
    6. Las células se resuspenden en 10 ml de PBS, y centrífugan a 400 x g y 37 oC durante 5 min. Después de girar, descarte el sobrenadante. Repita este paso 3 veces para minimizar la detección de fármacos de componentes extracelulares.
    7. Resuspender celdas en 4 ml de PBS para su análisis.

6. Realice mediciones SCMS utilizando la configuración ICMP/de una sola sonda

  1. Personalice los parámetros para el espectrómetro de masas para el experimento.
    1. En el encabezado Modo de escaneado del software del instrumento, seleccione Definir escaneado. Utilice una resolución de 60.000 m/m a m/z 400, 1 microescaneado, tiempo máximo de inyección de 100 ms y control automático de ganancia (AGC) activado. Para los experimentos se utilizó un rango de masa (m/z) de 100-1000. Los parámetros se pueden modificar en función del modelo de instrumento.
    2. En Bomba de jeringa, seleccione un caudal de 150 nL/min. El caudal debe optimizarse para cada experimento.
    3. Seleccione la fuente NSI y aplique una tensión de 4,5 kV. Este parámetro también debe optimizarse para cada experimento.
  2. Encienda el microscopio invertido (con aumento de 40x seleccionado tanto para la placa superior como para la lente inferior) y conéctelo al puerto USB de un portátil para capturar fuentes de vídeo en directo. Encienda la placa calentada y establézala a 37 oC.
  3. En el equipo, vaya a la pestaña Adquirir datos y seleccione Continuamente en Tiempo de adquisición .
  4. Prepare la muestra para el análisis.
    1. Pipeta de 2-3 ml de muestra en la tapa de una pequeña placa Petri (35 mm x 12 mm).
    2. 6.4.2 Coloque la muestra en el centro de la luz del microscopio invertido en la parte superior de la placa calentada.
  5. Prepare la sonda de selección de celdas de vidrio para su análisis. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la sonda para que su punta se enfoque bajo el microscopio invertido en el mismo plano que las células.
  6. Seleccione una celda individual para el análisis.
    1. Utilice el sistema de manipulación de celdas para mover la punta de la sonda de selección de celda a una celda de destino. Este proceso se supervisa mediante el microscopio invertido.
      NOTA: Si la punta de la sonda de selección de celda no se puede enfocar en el mismo plano que las celdas, es posible que la parte doblada de la sonda no esté en ángulo adecuada. Ajuste la posición de la sonda de selección de células hasta que ambas puntas de la sonda se puedan enfocar junto con las células bajo el microscopio.
    2. Gire suavemente el mango del microinyector para ajustar la posición del aceite mineral dentro del tubo. El microinyector proporciona una succión suave para fijar la célula objetivo a la punta de la sonda de selección de células.
      NOTA: Si la sonda de selección de celdano no puede capturar la célula a través de la fuerza de aspiración, compruebe la sonda de selección de celda para asegurarse de que está completamente insertada en el soporte capilar. Además, inspeccione los niveles de aceite mineral en el microinyector y la tubería, y expulse el aire si los hay.
    3. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la celda en la punta de la sonda de selección de celda a la punta de una sola sonda, utilizando un microscopio digital centrado en la punta de una sola sonda para monitorear este proceso. Al tocar, una pequeña gota de acetonitrilo en la punta de una sola sonda induce una silda rápida de la célula, y luego el lisato celular se ioniza inmediatamente para el análisis en línea de la EM.
      NOTA: Debido a que la celda seleccionada está asegurada a la punta de la sonda de selección de celda a través de una succión suave, esta celda se puede separar potencialmente durante su transferencia a la punta de una sola sonda. Por lo tanto, si las señales iónionas de lípidos celulares típicos (ver resultados representativos a continuación) no se observan dentro de 5 s, es posible que la célula se desató, y se necesita la selección de una célula diferente.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En primer lugar, las células K562 no tratadas se utilizan para establecer el método experimental. En un experimento típico de SCMS, se pueden observar cambios obvios de espectros de masa mediante la transferencia de una célula, durante la detección de contenido celular y después de finalizar la medición (FiguraS1). Tres picos celulares comunes de lípidos (fosfatidilcolina, PC), incluyendo PC(34:4)(m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567), y PC(38:5) (m/z 808.583), se monitorean para asegurarse de que la célula se transfiere con éxito celular y celular y celular y celular se detectan contenidos (FiguraS2)21,43,46,55,56. Si no se observan picos de lípidos dentro de 5 s, el nivel de aceite mineral en el microinyector se altera para reducir la succión que sostiene la célula en la punta de la sonda de selección celular; se debe tener precaución para que no se expulse ningún aceite mineral de la sonda de selección celular. La identidad de muchos PC en el rango de masa de m/z 750-850 se confirma utilizando MS/MS en muestras de lisato celular no tratadas (Figura3, Figura S2, Tabla 1)46.

Las células K562 también se someten a tratamiento con varios compuestos farmacológicos para ampliar la versatilidad del método. Las células K562 se incuban con gemcitabina (1 m) y taxol (1 m) durante 1 h y OSW-1 (100 nM, 1 m) durante 4 h y 2 h, respectivamente. Las células se lavan con PBS para minimizar la detección de compuestos farmacológicos a partir de contenido extracelular. La contribución de la matriz (por ejemplo, iones del medio de cultivo celular, PBS y disolvente) a espectros de masa de contenido celular puede eliminarse a través de la resta de datos, debido a sus señales iónicas significativamente diferentes (FiguraS3). Los tres compuestos farmacológicos se detectan utilizando la configuración ICMP/de una sola sonda MS (Figura S4)46. Estos resultados sugieren que este método se puede utilizar para estudiar lípidos intracelulares, medicamentos y metabolitos en el nivel de una sola célula de las células en solución en un entorno casi nativo.

figure-results-1
Figura 1. Configuración experimental para experimentos de MS de células de suspensión única. (A) La plataforma de manipulación de células integrada (ICMP) junto con un espectrómetro de masas. (B) Esquema para el análisis de celdas suspendidas. (C) Vista experimental de las celdas K562 que se seleccionarán mediante la sonda de selección de celdas. Reimpreso con permiso de Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2. Fotos de una sonda única modificada y una sonda de selección de celda sin usar para experimentos de MS de una sola célula de suspensión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3. Espectro de masa ampliado desde una sola célula que muestra las especies representativas (m/z 750-850). Las estructuras químicas se confirman mediante el análisis MS/MS (FiguraS1). Reimpreso con permiso de Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Molécula de fármaco*m/zError de masa (ppm)
[Gemcitabina + H] + 264.07611.32
[Taxol + Na] + 876.3182.74
[OSW-1 + Na] + 895.4450.89
Lípidos celulares
[PC(34:4) + H] + 754.5353.71
[PC(34:3) + H] + 756.5513.44
[PC(34:2) + H] + 758.5690.66
[PC(36:5) + H] + 780.5513.07
[PC(36:4) + H] + 782.5682.17
[PC(36:3) + H] + 784.5850.64
[PC(38:7) + H] + 804.5514.1
[PC(38:6) + H] + 806.5672.48
[PC(38:5) + H] + 808.5832.72
[PC(38:4) + H] + 810.6010
[PC(40:7) + H] + 832.5833.12

Tabla 1. Se identificaron componentes celulares mediante la configuración ICMP/Single-probe. La detección de todos los compuestos farmacológicos se confirmó comparando los resultados de la EM/MS con el compuesto estándar.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plataforma integrada de manipulación y análisis celular está construida para ampliar la versatilidad del método de Ep de una sola sonda, permitiendo el análisis rápido y en línea de células no adherentes en un entorno casi nativo. Una ventaja importante de la técnica es que se requiere una preparación mínima de la muestra, por lo que las células se analizan en condiciones que imitan su estado estándar. Particularmente, las células individuales de interés pueden ser identificadas y seleccionadas visualmente, minimizando la influencia del efecto de la matriz en la eficiencia de la ionización de la EM mientras se mantienen las células en su entorno natural, por lo que los resultados son más representativos de las células nativas de las células nativas estado (Figura S3). Esta técnica se puede utilizar potencialmente para estudiar las células del paciente suspendidas en biofluidos en estudios futuros. Otra ventaja de esta técnica es la selección flexible del disolvente de muestreo. Es importante incluir acetonitrilo como el disolvente de muestreo principal para que la lisis en microescala pueda ocurrir rápidamente. Potencialmente, las normas internas (por ejemplo, compuestos farmacológicos etiquetados isotópicamente) pueden añadirse al disolvente de muestreo para cuantificar moléculas de interés (por ejemplo, moléculas de fármacos) de células individuales, incluidas aquellas que pueden desempeñar un papel clave en la revolución personalización de tratamientos farmacológicos en el futuro54.

Aunque este sistema integrado se puede utilizar convenientemente para analizar amplios rangos de celdas, una limitación del método es que ni la sonda de una sola sonda ni la sonda de selección de celda está disponible comercialmente; dictando la necesidad de optimización de muchos parámetros (por ejemplo, caudal, voltaje, longitud entre el emisor nano-ESI y el tubo de transferencia iónico, etc.) antes de cada experimento. Además, debido a la pequeñez de la sonda de selección de una sola sonda y de la célula, la perturbación ambiental (por ejemplo, el flujo de aire) puede dar lugar a dificultades para establecer una unión entre las dos sondas. Una solución a corto plazo es la flexión de la sonda de selección de celda cerca del final para minimizar la longitud del estrechado. El trabajo futuro incluye el desarrollo de una carcasa para encerrar las partes críticas de la configuración para minimizar los efectos ambientales. Debido a la cantidad limitada de contenido celular y el corto tiempo de adquisición (2-3 s) de una célula, el análisis de EmS/MS sólo se puede llevar a cabo para especies relativamente abundantes. Otros factores que influyen en la sensibilidad de detección incluyen la eficiencia de ionización suprimida debido a la introducción de la matriz junto con la célula y la posible pérdida de iones a través del tubo de transferencia de iones extendido.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Naga Rama Kothapalli por su trabajo en el desarrollo de la preparación de muestras para células de suspensión y experimentos de lisato celular. Además, los autores agradecen a los NIH (R01GM116116 y R21CA204706) por su financiación.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetontriloMillipore Co.AX0145-1Disolvente de muestreo
CellTram VarioEppendorf6221ICMP
Alambre de cobrestores.ebay.com/jewelerheavenMuerto blando, redondo, calibre 20, 25 piesConfiguración de unión conductora
Microscopio estereoscópico digitalShenzhen D& F Co.Supereyes T004Analysis
Micropipeta desechable, 1-5 y micro; LRochester Scientific5065Fabricación de sonda de selección celular
Tubo de cuarzo de doble orificio, 1.120 "x0.005" x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QFabricación de una sola sonda
Resina epoxiDevconNº de pieza 20945Fabricación de una sola sonda
Sistema de manipulación de células EppendorfEppendorfTransferman NK517800397-U.R.Icmp
Tuerca externaVALCO*CHEMINERTEN1Fabricación de tubos de transferencia de iones
Ácido fórmicoSigma-Aldrich399388-500MLDisolvente de muestreo
Capilar de sílice fundida, ID: 40 y micro; m, OD: 100 y micro; mPolymicro TechnologiesTSP040105Fabricación de una sola sonda, configuración de unión conductora
Capilar de sílice fundida, ID: 50 y micro; m, OD: 150 y micro; mPolymicro Technologies1068150015Configuración de unión conductora
HyClone Suero fetal bovino sintético (FBS)Fischer SciSH3006603Microfiltro
en líneaIDEX Health & Science LLCM-520 Configuración deunión conductora
Extractor láserSutter Instrument Co.Modelo P-2000Fabricación de una sola sonda
Lámpara LED UVFoshan Liang Ya Equipo dentalLY-C240Fabricación de una sola sonda
LTQ Espectrómetro de masas OrbitrapThermo ScientificLTQ Orbitrap XLAnálisis
MicroforgeNarishige, Co.MF-9Fabricación de sondas de selección celular
MicrounionIDEX Health & Science LLCM-539 Tubo dePEEK de unión conductora
, 1/32x0.005x 5 piesIDEX Health & Science LLC1576Configuración de unión conductora
Tubo PEEK, 1/32x0.007x 5ftIDEX Health & Science LLC1577Configuración de unión conductora
Penicilina/EstreptomicinaGibco/Life Technologies15140-122 Placa decultivo celular
, 35x10 mmVWR25382-334 Preparación demuestras
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)VWR0780-50LCultivo celular
Alambre de platinoNarishige, Co.Modelo PT-A Microforge
Fuente de alimentaciónNikonPSM-2120ICMP
RPMI, 1X con Corning glutagroCorning10-104-CVCultivo
celular Tubos de un solo orificioBoralex5065Fabricación de sondas de selección de células
Casquillos de acero inoxidable, para 1/16" de diámetro exteriorIDEX Health & Science LLCVHP-200-01x Fabricación de tubos detransferencia de iones
Tubos de acero inoxidable, 1/32x 205 y micro; m x30 cmIDEX Salud & Science LLCU-1128 Fabricación de tubos detransferencia de iones
Jeringa, 250 y micro; LHamilton1725LTN250ULJeringa de muestreo Matraz
T25CellStar690160Cultivo celular
Brida de interfaz de fuente de iones Thermo LTQ XLNuevo objetivoPB5500Análisis
ThermoPlateTokaiHit55R30NICMP
TrypLE ExpressGibco12605-010Cultivo celular
Cortador de tubos, para 1/16" acero inoxidableSUPELCO58692-UFabricación de tubos de transferencia de iones
Microscopio de fotografía digital USBdx.comSO2 25~500XAnálisis
Resina de curado UVPrimeDental N.º de artículo 006.030Fabricación de una sola sonda
Extractor de pipetas verticalDavid Kopf InstrumentsModelo 720Fabricación de sondas de selección de celdas
Carcasa de voltajePicoChipPCH-A00120Interfaz ICMP/MS
Cortador de alambreCraftsman4 1/2 en extremoConfiguración de unión conductora
para cultivo celular Petri de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111(2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445(2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101(2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891(2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201(2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT - Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981(2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173(2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6545 LP-6550 (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911(2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

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