Artículo de método
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Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.
Uno de los principales obstáculos en el campo de la investigación de vesículas extracelulares (EV) hoy en día es la capacidad de lograr preparaciones de EV purificadas en un entorno de infección viral. El método presentado está destinado a aislar los vehículos eléctricos lejos de los viriones (es decir, VIH-1), lo que permite una mayor eficiencia y rendimiento en comparación con los métodos de ultracentrifugación convencionales. Nuestro protocolo contiene tres pasos: precipitación EV, separación de gradiente de densidad y captura de partículas. Los ensayos aguas abajo (es decir, Western blot y PCR) se pueden ejecutar directamente después de la captura de partículas. Este método es ventajoso sobre otros métodos de aislamiento (es decir, ultracentrifugación) ya que permite el uso de volúmenes de inicio mínimos. Además, es más fácil de usar que los métodos alternativos de aislamiento EV que requieren múltiples pasos de ultracentrifugación. Sin embargo, el método presentado está limitado en su alcance de ensayos de EV funcionales, ya que es difícil eluir los vehículos eléctricos intactos de nuestras partículas. Además, este método se adapta a un entorno estrictamente basado en la investigación y no sería comercialmente viable.
La investigación centrada en vesículas extracelulares (EV), específicamente exosomas, un tipo de EV que va de 30-120 nm y se caracteriza por la presencia de tres marcadores de tetraspanrina CD81, CD9 y CD63, ha sido moldeada en gran medida por el desarrollo de métodos para aislar y purificar las vesículas de interés. La capacidad de diseccionar mecanismos multifacéticos se ha visto obstaculizada debido a técnicas complejas y que consumen mucho tiempo que generan muestras compuestas por una población heterogénea de vesículas generadas a través de diferentes vías con una amplia gama de contenidos, tamaños y Densidades. Si bien esto es un problema para casi todas las inv....
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1. Filtración y precipitación de vesículas extracelulares (EV)
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La precipitación DE PEG aumenta el rendimiento de EV
Nuestro enfoque combinado para el aislamiento EV es significativamente más eficiente en términos de recuperación de EV en comparación con la ultracentrifugación tradicional, como lo demuestra la reducción del 90% en el volumen de material de partida requerido. La ultracentrifugación, el estándar de oro actual en aislamiento EV, requiere aproximadamente 100 ml de sobrenadante de cultivo para producir una preparación d.......
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El método descrito permite mejorar el rendimiento de los vehículos eléctricos y la separación del virus de los vehículos eléctricos mediante un enfoque combinado para el aislamiento. Las cantidades relativamente grandes de material de partida (es decir, sobrenadante celular) se pueden filtrar antes del aislamiento del EV por precipitación, separación DG y enriquecimiento de nanopartículas, lo que resulta en un volumen final de 30 ol, lo que permite un uso inmediato en una variedad de ensayos aguas abajo. El uso del enriq.......
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B.L. está afiliada a Ceres Nanosciences inc. que produce reactivos y/o instrumentos utilizados en este artículo. Todos los demás autores no declaran posibles conflictos de intereses.
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Kashanchi, especialmente a Gwen Cox. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 y NS099029 a F.K.).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células CEM CD4+ | Programa de reactivos para el SIDA | NIH | 117 |
| CEM DPBS sin Ca y Mg (1x) | Calidad Biológico | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | Reactivo de precipitación PEG |
| FBS Thermo | Fisher Scientific | A2720801 | |
| Suero fetal bovino | Suero | pico PS-FB3 | Suero |
| VIH-1 infectado con células U937 NIH Programa | de reactivos para el SIDA | 165 | U1 |
| Filtro de jeringa Nalgene 0.2 y micro; m SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrampa (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Rojo reactivo 120 núcleo |
| Nanotrampa (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA |
| core Optima XE-980 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Gradiente de densidad medio | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Rotor de cuchara oscilante | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tubo ultratransparente, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
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