Este protocolo aísla las vesículas extracelulares (EV) lejos de los viriones con alta eficiencia y rendimiento mediante la incorporación de precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas para permitir un flujo de trabajo simplificado y una reducción del inicio requisitos de volumen, lo que resulta en preparaciones reproducibles para su uso en todas las investigaciones de vehículos eléctrico.
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Artículo de método
Purificación de preparaciones de vesícula extracelular de alto rendimiento lejos del virus
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Resumen
Resumen
Uno de los principales obstáculos en el campo de la investigación de vesículas extracelulares (EV) hoy en día es la capacidad de lograr preparaciones de EV purificadas en un entorno de infección viral. El método presentado está destinado a aislar los vehículos eléctricos lejos de los viriones (es decir, VIH-1), lo que permite una mayor eficiencia y rendimiento en comparación con los métodos de ultracentrifugación convencionales. Nuestro protocolo contiene tres pasos: precipitación EV, separación de gradiente de densidad y captura de partículas. Los ensayos aguas abajo (es decir, Western blot y PCR) se pueden ejecutar directamente después de la captura de partículas. Este método es ventajoso sobre otros métodos de aislamiento (es decir, ultracentrifugación) ya que permite el uso de volúmenes de inicio mínimos. Además, es más fácil de usar que los métodos alternativos de aislamiento EV que requieren múltiples pasos de ultracentrifugación. Sin embargo, el método presentado está limitado en su alcance de ensayos de EV funcionales, ya que es difícil eluir los vehículos eléctricos intactos de nuestras partículas. Además, este método se adapta a un entorno estrictamente basado en la investigación y no sería comercialmente viable.
Introducción
La investigación centrada en vesículas extracelulares (EV), específicamente exosomas, un tipo de EV que va de 30-120 nm y se caracteriza por la presencia de tres marcadores de tetraspanrina CD81, CD9 y CD63, ha sido moldeada en gran medida por el desarrollo de métodos para aislar y purificar las vesículas de interés. La capacidad de diseccionar mecanismos multifacéticos se ha visto obstaculizada debido a técnicas complejas y que consumen mucho tiempo que generan muestras compuestas por una población heterogénea de vesículas generadas a través de diferentes vías con una amplia gama de contenidos, tamaños y Densidades. Si bien esto es un problema para casi todas las investigaciones de vehículos eléctricos, es de particular importancia cuando se estudian los vehículos eléctricos en el contexto de la infección viral, ya que los viriones y partículas similares a virus (VLP) pueden ser similares en diámetro a las vesículas de interés. Por ejemplo, el Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1) tiene aproximadamente 100 nm de diámetro, que es aproximadamente del mismo tamaño que muchos tipos de vehículos eléctricos. Por esta razón, hemos diseñado un nuevo flujo de trabajo de aislamiento EV para abordar estos problemas.
El estándar de oro actual de aislamiento EV es ultracentrifugación. Esta técnica hace uso de las diversas densidades vesículas, lo que permite separar las vesículas por centrifugación con sedimentación diferencial de partículas de mayor densidad frente a partículas de menor densidad en cada etapa 1,2. Se requieren varias etapas de centrifugación de baja velocidad para eliminar las células intactas (300-400 x g durante 10 min), los desechos celulares (2.000 x g durante 10 min) y los cuerpos apoptóticos/vesículas grandes (10.000 x g durante 10 min). Estas purificaciones iniciales son seguidas por la ultracentrifugación de alta velocidad (100,000-200,000 x g para 1.5-2 h) a los vehículos eléctricos sedimentados. Los pasos de lavado se realizan para asegurar aún más la pureza ev, sin embargo, esto resulta en la reducción del número de vehículos eléctricos aislados, reduciendo así el rendimiento total 3,4. La utilidad de este método está limitada aún más por el requisito de un gran número de celdas (aproximadamente 1 x 108) y un gran volumen de muestra (> 100 ml) para lograr resultados adecuados.
Para abordar las crecientes preocupaciones, la precipitación de vesículas con polímeros hidrófilos se ha convertido en una técnica útil en los últimos años. El polietilenglicol (PEG), u otros reactivos de precipitación relacionados, permite al usuario bajar las vesículas, virus y agregados de proteína o proteína-ARN dentro de una muestra simplemente incubando la muestra con el reactivo de elección, seguido de un solo valor de baja velocidad centrifugación1,2,5. Hemos informado previamente que el uso de PEG o métodos relacionados para precipitar los vehículos eléctricos en comparación con los resultados tradicionales de ultracentrifugación en un rendimiento significativamente mayor6. Esta estrategia es rápida, fácil, no requiere equipos caros adicionales, es fácilmente escalable y retiene la estructura EV. Sin embargo, debido a la naturaleza promiscua de este método, las muestras resultantes contienen una variedad de productos, incluyendo proteínas libres, complejos proteicos, una gama de vehículos eléctricos y viriones que requieren una mayor purificación para obtener la población deseada1 ,2,7,8.
Para superar la heterogeneidad de los vehículos eléctricos obtenidos a partir de diversos métodos de precipitación, la ultracentrifugación de gradiente de densidad (DG) se utiliza para separar mejor las partículas en función de su densidad. Este método se lleva a cabo utilizando un gradiente escalonado utilizando un medio de gradiente de densidad, como iodixanol o sacarosa, que permite la separación de los vehículos eléctricos de proteínas, complejos proteicos y partículas similares a virus (VLP). Es importante señalar que, si bien una vez se pensó que la DG permitía una separación más precisa de las subpoblaciones de vehículos eléctrico, ahora se sabe que los tamaños y densidades de varias vesículas pueden superponerse. Por ejemplo, se sabe que los exosomas tienen densidades de flotación de 1,08-1,22 g/mL9,mientras que las vesículas aisladas del Golgi (COPI+ o clathrin+) tienen densidades de 1,05-1,12 g/ml y las del retículo endoplasmático (COPII+ ) sedimento sin 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Además, si uno desea comparar fracciones exosomales con fracciones que contienen partículas virales, esto puede llegar a ser más difícil dependiendo de la densidad del virus de interés, hay virus distintos del VIH-1 que probablemente se equilibran al mismo tiempo densidades como fracciones positivas exosómicas2.
Por último, el enriquecimiento de los preparativos de EV para la visualización posterior y los ensayos funcionales es vital para la investigación de vehículos eléctrico. El uso de nanopartículas enriquecedoras de EV, específicamente partículas de hidrogel multifuncionales que miden 700-800 nm de diámetro, son un paso crítico para lograr preparaciones concentradas del EV. Poseen un cebo aromático de alta afinidad que encapsulado por una concha de tamizado exterior poroso para promover la selectividad. Las nanopartículas utilizadas en este estudio incluyen dos preparaciones distintas con diferentes cebos de núcleo (Reactivo Rojo 120 NT80; y Cibacron Azul F3GA NT82) que han demostrado aumentar la captura de vehículos eléctricos de diversos reactivos y biofluidos (ver la Tabla de Materiales )6,10,11,12,13,14,15. Las partículas ofrecen un fácil enriquecimiento de los vehículos eléctricos de numerosos materiales de partida, incluyendo fracciones de iodixanol, sobrenadante de cultivo celular, así como biofluidos del paciente como plasma, suero, fluidos cefalorraquídeos (CSF) y orina6,13 .
El método presentado aquí mejora la eficiencia de las técnicas actuales de purificación de EV mediante la combinación de varias tecnologías; Precipitación EV, ultracentrifugación de gradiente de densidad y captura de partículas, para agilizar el flujo de trabajo, reducir los requisitos de la muestra y aumentar el rendimiento para obtener una muestra de EV más homogénea para su uso en toda la investigación ev. Este método es particularmente útil en la investigación de los vehículos eléctricos y su contenido durante la infección viral, ya que incluye un paso de filtración de 0,22 m para excluir vesículas y VLP grandes y no deseadas y la separación de la población total de vehículos eléctricos en función de la densidad para aislar los vehículos eléctricos de los viriones.
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Protocolo
1. Filtración y precipitación de vesículas extracelulares (EV)
- Para preparar el sobrenadante de cultivo a partir de células infectadas o transfectó (es decir, líneas celulares y/o células primarias), el cultivo de aproximadamente 10 ml de células de registro tardío durante 5 días a 37 oC y 5% de CO2 en un medio de cultivo adecuado (es decir, RPMI o DMEM con 10% de suero [FBS]).
NOTA: Todos los reactivos de medios de cultivo deben estar libres de vehículos eléctricos, y pueden adquirirse (ver Tabla de Materiales)o prepararse internamente mediante la preultracentrifugación del suero a 100.000 x g durante 90 min. Este protocolo ha tenido éxito para varias líneas celulares de uso común, incluyendo: CEM, Jurkat, 293T, U937 (líneas no infectadas), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (líneas infectadas por VIH-1 y HTLV-1), múltiples células infectadas y células mieloides y T primarias (ambas infectados y no infectados); sin embargo, este protocolo se puede utilizar para cualquier tipo de celda, incluidos aquellos que requieren medios especializados o condiciones de referencia cultural. Es posible que sea necesario optimizar la densidad de las células para diferentes tipos de celdas. Se recomienda utilizar la densidad más alta con una muerte celular mínima después de 5 días. - Centrifugar el cultivo a 3.000 x g durante 5 min a las células de pellets y desechar el pellet.
- Filtrar el sobrenadante de cultivo utilizando un filtro estéril de 0,22 m y recoger el filtrado en un tubo limpio.
- Agregue el mismo volumen de reactivo de precipitación PEG (relación 1:1) al sobrenadante filtrado. Invierta el tubo varias veces para asegurar una mezcla homogénea.
NOTA: NO vórtice. - Incubar la mezcla a 4oC durante la noche (O/N).
- Mezcla de centrífuga a 1.500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para producir un pellet de EV heterogéneo.
NOTA: El pellet EV debe aparecer de color blanco o blanquecino. - Desechar el sobrenadante de cultivo agotado por EV.
- Resuspende el pellet EV en 150–300 l de solución salina 1x con fosfato sin calcio y magnesio (PBS) y manténgalo en hielo.
2. Construcción de un Gradiente de Densidad
- Mezclar el medio gradiente de densidad de iodixanol con 1x PBS para crear 11 fracciones de densidad de 1 ml diferentes de 6 a 18% de iodixanol en incrementos de 1,2% en tubos de microcentrífuga separados como se muestra en la Figura 1A.
- Vórtice cada tubo para mezclar.
- Las fracciones de densidad de capa en un tubo de ultracentrífuga de cubo de balanceo prelimpiado y seco que comienzan con la fracción #18 y terminan con #6 fracción como se indica en la Figura 1B.
NOTA: Todos los tubos deben desinfectarse utilizando un spray de lejía del 10% seguido de un enjuague 3vecero con agua desionizada y un lavado final de agua desionizada estéril antes de cargar las fracciones de gradiente. - Añadir pellets EV resuspendidos (300 l) a la parte superior del gradiente en capas en el tubo de ultracentrífuga.
- Ultracentrifugar a 100,00 x g a 4 oC durante 90 min.
- Retire cuidadosamente las fracciones de 1 ml del tubo ultracentrífugo y transfiera cada fracción a nuevos tubos de microcentrífuga.
3. Enriquecimiento de fracciones EV uUsing Nanoparticles
- Cree una suspensión del 30% de nanopartículas utilizando volúmenes iguales de NT80, NT82 y 1x PBS.
NOTA: La mezcla debe ser vórtitada antes de su uso para garantizar la homogeneidad. - Añadir 30 sl de la suspensión a cada tubo de microcentrífuga que contenga las fracciones de densidad y pipetearlas/invertirlas varias veces para mezclarlas.
- Gire los tubos de microcentrífuga de fracción de densidad que contienen nanopartículas enriquecedoras de EV O/N a 4 oC a aproximadamente 20 rpm.
- Tubos de microcentrífuga de fracción de densidad centrífuga a 20.000 x g durante 5 min a RT.
- Deseche el líquido y lave el pellet EV dos veces con 1pbS.
NOTA: Los pellets de nanopartículas pueden congelarse a -20 oC o utilizarse inmediatamente para varios ensayos posteriores (es decir, PCR, mancha occidental, espectrometría de masas y otros ensayos).
4. Preparación recomendada de pellets de nanopartículas para ensayos aguas abajo
-
Para el aislamiento de ARN
- Resuspenda el pellet en 50 ml de agua desionizada autoclave tratada con pirocarbonato de dietil (DEPC) al 0,001% filtrada a través de un filtro de 0,2 m y aísle el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit.
-
Para electroforesis de gel
- Resuspenda el pellet directamente en 15 s de tampón Laemmli.
- Muestra de calor 3x a 95oC durante 3 min. Vortex suavemente y girar hacia abajo entre cada ciclo de calor.
- Muestra de centrífuga para 15 s a 20.000 x g y cargue todo el material elulado directamente en el gel.
NOTA: Para obtener mejores resultados, limite la cantidad de partículas cargadas en el gel y ejecute el gel a 100 V para asegurarse de que las partículas restantes estén contenidas en los pozos.
-
Para la digestión de la trippsina
- Resuspenda el pellet en 20 ml de urea antes de la alquilación y la trippsinización de la muestra. Las nanopartículas pueden ser peletizadas por una centrifugación de 14.000 x g a RT durante 10 minutos.
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Resultados
La precipitación DE PEG aumenta el rendimiento de EV
Nuestro enfoque combinado para el aislamiento EV es significativamente más eficiente en términos de recuperación de EV en comparación con la ultracentrifugación tradicional, como lo demuestra la reducción del 90% en el volumen de material de partida requerido. La ultracentrifugación, el estándar de oro actual en aislamiento EV, requiere aproximadamente 100 ml de sobrenadante de cultivo para producir una preparación d...
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Discusión
El método descrito permite mejorar el rendimiento de los vehículos eléctricos y la separación del virus de los vehículos eléctricos mediante un enfoque combinado para el aislamiento. Las cantidades relativamente grandes de material de partida (es decir, sobrenadante celular) se pueden filtrar antes del aislamiento del EV por precipitación, separación DG y enriquecimiento de nanopartículas, lo que resulta en un volumen final de 30 ol, lo que permite un uso inmediato en una variedad de ensayos aguas abajo. El uso del enriq...
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Divulgaciones
B.L. está afiliada a Ceres Nanosciences inc. que produce reactivos y/o instrumentos utilizados en este artículo. Todos los demás autores no declaran posibles conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Kashanchi, especialmente a Gwen Cox. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud (NIH) (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 y NS099029 a F.K.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células CEM CD4+ | Programa de reactivos para el SIDA | NIH | 117 |
| CEM DPBS sin Ca y Mg (1x) | Calidad Biológico | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | Reactivo de precipitación PEG |
| FBS Thermo | Fisher Scientific | A2720801 | |
| Suero fetal bovino | Suero | pico PS-FB3 | Suero |
| VIH-1 infectado con células U937 NIH Programa | de reactivos para el SIDA | 165 | U1 |
| Filtro de jeringa Nalgene 0.2 y micro; m SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrampa (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Rojo reactivo 120 núcleo |
| Nanotrampa (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA |
| core Optima XE-980 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Gradiente de densidad medio | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Rotor de cuchara oscilante | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tubo ultratransparente, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
Referencias
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
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