इस प्रोटोकॉल माउस rabdomyosarcoma प्राथमिक कोशिकाओं, tumorsphere गठन और उपचार, और allograft प्रत्यारोपण tumorspheres संस्कृतियों से शुरू के अलगाव के लिए एक reproduible विधि का वर्णन करता है.
Rhabdomyosarcoma (RMS) बच्चों में सबसे आम नरम ऊतक सार्कोमा है. हालांकि महत्वपूर्ण प्रयासों आरएमएस के साथ जुड़े आम उत्परिवर्तनों की पहचान सक्षम है और विभिन्न RMS subtypes के भेदभाव की अनुमति दी, प्रमुख चुनौतियों अभी भी उपन्यास उपचार के विकास के लिए मौजूद आगे रोग का पूर्वानुमान में सुधार. हालांकि myogenic मार्करों की अभिव्यक्ति से पहचान की, वहाँ अभी भी है कि RMS myogenic या गैर-myogenic मूल है पर महत्वपूर्ण विवाद है, मूल की कोशिका के रूप में अभी भी खराब समझ में आ गया है. वर्तमान अध्ययन में, एक विश्वसनीय विधि माउस RMS के लिए tumorsphere परख के लिए प्रदान की जाती है. परख ट्यूमर कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों पर आधारित है और tumorigenic कार्यों के साथ ट्यूमर में दुर्लभ आबादी की पहचान की अनुमति देता है. इसके अलावा वर्णित पुनः संयोजक प्रोटीन के परीक्षण के लिए प्रक्रियाओं रहे हैं, ट्यूमर के साथ transfection प्रोटोकॉल को एकीकृत परख, और ट्यूमर के विकास और विकास में शामिल उम्मीदवार जीन का मूल्यांकन. आगे बताया गया है कि ट्यूमर के ट्यूमर के प्रत्यारोपण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में एक प्रक्रिया है जो विवो मेंट्यूमरीजेनिक समारोह को मान्य करती है . कुल मिलाकर, वर्णित विधि विश्वसनीय पहचान और दुर्लभ RMS tumorigenic आबादी है कि विभिन्न संदर्भों में उत्पन्न होने वाले RMS के लिए लागू किया जा सकता है के परीक्षण की अनुमति देता है. अंत में, प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग और चिकित्सकीय के भविष्य के विकास के लिए एक मंच के रूप में उपयोग किया जा सकता है.
कैंसर एक विषमांगी बीमारी है; इसके अलावा, ट्यूमर का एक ही प्रकार के विभिन्न रोगियों में विभिन्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों पेश कर सकते हैं, और एक रोगी के भीतर एक ट्यूमर कोशिकाओं की कई आबादी से बना है1. Heterogeneity शुरू करने और कैंसर के प्रचार के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं की पहचान में एक चुनौती प्रस्तुत करता है, लेकिन उनके लक्षण कुशल उपचार के विकास के लिए आवश्यक है. ट्यूमर प्रचार कोशिकाओं की धारणा (टीपीसी), कोशिकाओं की एक दुर्लभ आबादी है कि ट्यूमर के विकास में योगदान, पहले बड़े पैमाने पर2की समीक्षा की गई है. तथ्य यह है कि TPCs कैंसर के कई प्रकार में विशेषता है के बावजूद, उनके विश्वसनीय अलगाव के लिए मार्करों की पहचान कई ट्यूमर प्रकार3,4,5,6 के लिए एक चुनौती बनी हुई है , 7 , 8 , 9. इस प्रकार, एक विधि है कि आणविक मार्करों पर निर्भर नहीं करता है बल्कि टीपीसी कार्यात्मक गुणों पर भरोसा नहीं करता है (उच्च आत्म नवीनीकरण और कम लगाव की स्थिति में विकसित करने की क्षमता), tumorsphere गठन परख के रूप में जाना जाता है, व्यापक रूप से के लिए लागू किया जा सकता अधिकांश ट्यूमर से टीपीसी की पहचान। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख को टीपीसी के विस्तार के लिए भी नियोजित किया जा सकता है और इस प्रकार सीधे कैंसर दवा स्क्रीनिंग और कैंसर प्रतिरोध1,10पर अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है .
Rabdomyosarcoma (RMS) नरम ऊतक सार्कोमा का एक दुर्लभ रूप है जो छोटे बच्चों में सबसे आम11. Althoug RMS myogenic मार्करों की अभिव्यक्ति के आकलन के माध्यम से histologically पहचान ासाकीय हो सकता है, मूल के आरएमएस सेल को कई ट्यूमर उपप्रकारों और ट्यूमर विकासात्मक उत्तेजनाओं की उच्च विषमता के कारण एकात्मक विशेषता नहीं की गई है। दरअसल, हाल के अध्ययनों के बारे में महत्वपूर्ण वैज्ञानिक चर्चा उत्पन्न की है कि RMS myogenic या गैर-myogenic मूल का है, सुझाव है कि RMS विभिन्न कोशिकाओं के संदर्भ के आधार पर विभिन्न प्रकार से प्राप्त कर सकते हैं12,13, 14 , 15 , 16 , 17आरएमएस सेल लाइनों पर कई अध्ययन ट्यूमर के विकास और अत्यधिक आत्म नवीनीकरण आबादी के साथ जुड़े मार्करों के लक्षण में शामिल रास्ते की पहचान के लिए ट्यूमर मंडल गठन परख को रोजगार प्रदर्शन किया गया है 18 , 19 , 20 , 21|
हालांकि, मूल के RMS कोशिकाओं की पहचान करने के लिए tumorsphere गठन परख की क्षमता के बावजूद, एक विश्वसनीय तरीका है कि प्राथमिक RMS कोशिकाओं पर नियोजित किया जा सकता है अभी तक वर्णित नहीं किया गया है. इस संदर्भ में, हमारे समूह से हाल ही में एक अध्ययन एक Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) माउस मॉडल22में मूल के RMS कोशिकाओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित tumorsphere गठन परख कार्यरत हैं. एकाधिक पूर्व tumorigenic सेल प्रकार, मांसपेशियों के ऊतकों से अलग, उनकी क्षमता के लिए परीक्षण कर रहे हैं कम लगाव की स्थिति में विकसित करने के लिए, dystrophic संदर्भों में RMS के लिए मूल की कोशिकाओं के रूप में मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं की पहचान की अनुमति. यहाँ वर्णित tumorsphere गठन परख के लिए एक reproduible और विश्वसनीय प्रोटोकॉल है (चित्र 1),जो सफलतापूर्वक अत्यंत दुर्लभ सेल आबादी है कि माउस RMS विकास के लिए जिम्मेदार हैं की पहचान के लिए नियोजित किया गया है.
कई तरीकों अलगाव और ट्यूमर विषम कोशिका आबादी से TPCs की विशेषता के लिए नियोजित किया गया है: ट्यूमर clonogenic परख, FACS अलगाव, और ट्यूमर मंडल गठन परख. ट्यूमर क्लोनोजेनिक परख पहले 1971 में वर्णित किया गया था, स्टेम सेल के ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एलिसन मेडिकल फाउंडेशन अनुदान एजी-एनएस-0843-11 द्वारा समर्थित किया गया था, और एनसीआई कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30CA030199 के भीतर NIH पायलट अनुदान ए एस करने के लिए।
Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |