이 프로토콜은 마우스 횡문근 육종 1차 세포의 분리, 종양구 형성 및 치료, 및 종양구배양으로부터 시작되는 동종 이식이식에 대한 재현가능한 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
횡문근육종 (RMS)은 어린이에게 가장 흔한 연조직 육종입니다. 상당한 노력이 RMS와 관련되었던 일반적인 돌연변이의 확인을 가능하게 하고 다른 RMS 특수형의 차별을 허용했더라도, 중요한 도전은 예후를 더 향상시키기 위하여 새로운 처리의 발달을 위해 아직도 존재합니다. myogenic 마커의 발현에 의해 확인되더라도, 기원의 세포가 아직도 제대로 이해되지 않는 때문에 RMS가 myogenic 또는 비 myogenic 기원이 있는지 여부에 대한 중요한 논쟁이 아직도 있습니다. 본 연구에서는, 마우스 RMS에 대한 종양구법 분석법에 대해 신뢰할 수 있는 방법이 제공된다. 분석법은 종양 세포의 기능적 특성에 기초하고 종양 성 기능을 가진 종양에 있는 희소한 인구의 확인을 허용합니다. 또한 재조합 단백질을 테스트하고, 형질전환 프로토콜을 종양 권 분석실험과 통합하고, 종양 발달 및 성장에 관여하는 후보 유전자를 평가하기 위한 절차도 기술되어 있다. 추가로 기재된 종양이식이식은 생체내에서종양발생 기능을 검증하기 위해 수용자 마우스로 이식하는 절차이다. 전반적으로, 기술된 방법은 다른 문맥에서 발생하는 RMS에 적용될 수 있는 희소한 RMS 종양성 집단의 신뢰할 수 있는 식별 및 시험을 허용한다. 마지막으로, 프로토콜은 약물 스크리닝 및 치료제의 향후 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.
서론
암은 이질적인 질병입니다. 게다가, 종양의 동일 모형은 다른 환자에 있는 다른 유전 돌연변이를 제출할 수 있고, 환자 내의 종양은 세포의 다중 인구에 의해 구성됩니다1. 이질성은 암을 시작하고 전파하는 세포의 식별에 도전을 제시합니다, 그러나 그들의 특성은 능률적인 처리의 발달을 위해 필수적입니다. 종양 발달에 기여하는 세포의 희소한 인구인 종양 전파 세포 (TPC)의 개념은 이전에 광범위하게 검토되었습니다2. TPC가 여러 유형의 암을 특징으로한다는 사실에도 불구하고, 신뢰할 수있는 격리를위한 마커의 식별은 여러 종양 유형3,4,5및6에 대한 도전으로 남아 있습니다. , 7명 , 8개 , 따라서,분자 마커에 의존하지 않고 오히려 TPC 기능적 특성 (높은 자기 재생 및 낮은 부착 조건에서 성장하....
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프로토콜
마우스의 주택, 처리 및 희생은 샌포드 번햄 프리디스 의학 발견 연구소의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 시약 준비
- 세포 절연 배지 100 mL준비: F10 배지에 10% 말 세럼(HS)을 보충하였다.
- 콜라게나아제 타입 II 용액 50 mL 준비: 콜라게나아제 타입 II 파우더 1 g을 세포 분리 매체 50 mL에 용해시십시오(로트에 따라 단위 수가 변하기 때문에 1 mL당 효소 단위를 주목하십시오). 용액을 Aliquot하고 사용할 준비가 될 때까지 -20 °C 냉동고에 보관하십시오.
참고: 효소 활성은 여러 가지 로트에 걸쳐 변경될 수 있기 때문에 콜라게나아제를 사용하기 전에 모든 콜라게나제를 테스트해야 합니다. - 두 번째 소화 용액 샘플 당 10 mL 준비: 콜라게나제 타입 II 용액 100 단위/mL와 디스파제 II 의 2 단위/mL를 새로 가중한 세포 분리 매체. 사용하기 직전에 준비하십시오.
- 종양 세포 매체의 500 mL준비: DMEM 고혈당20% FBS 와 1% 펜/스트렙으로 보충하였다.
- FACS 완충액 500 mL 준비: 2.5% v/v 일반 염소 세럼과 1 mM EDTA로 보충된 1x PBS.
- ....
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결과
종양구 검출
세포 격리는 종양 조직에 존재하는 세포 집단의 최대 이질성을 얻기 위해 최적화되었다. 첫째, 단리조직이 형태학적으로 이질적인 영역을 제시한 이후, 균일한 희귀 세포 집단을 분리할 가능성을 높이기 위해, 샘플링은 종양의 여러 부위로부터 수행되었다(도1A,왼쪽의 첫 번째 패널). 둘째, 수확된 시료의 기계적 해리는 다진 조직 크기에서 균질성을 유지하면서 수행되었으며, 샘플 전반에 걸쳐 존재할 수 있는 상이한 저항에도불구하고(도 1A,왼쪽에서 제3 및 제4 패널) ). 시작 물질 (종양 공격성, 마우스의 연령 및 유전자형, 종양 위치)에 따라, 격리 과정의 기계적 스트레스로부터 세포의 회복은 3-7 일(그림 1A,오른쪽의 마지막 패널)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다........
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토론
종양 이질성 세포 집단으로부터의 TPC의 격리 및 특성화: 종양 투종 분석법, FACS 격리 및 종양구 형성 분석법에서 여러 가지 방법이 채택되었다. 종양 투동성 분석은 1971년에 처음 기술되었으며, 줄기 세포 연구에 사용되었으며, 이후 암 생물학29,30에만적용되었다. 이 방법은 연겔배양물(31)에서제약 없이 확장되는 암 줄기세포 본질적 성질을 기반으로 한다. 이 방법은 개발 이래 종양 세포 이질성 연구, 호르몬 치료의 세포 성장에 미치는 영향, 및 종양 내성 연구31을포함한 여러 목적으로 암 연구에 널리 사용되어 왔다. 현재까지, 이 분석제는 아직도 다중 유형의암32에대한 종양 발신 세포의 식별을 위해 사용된다.
FACS 격리는 관심있는 세포의.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 엘리슨 의료 재단 보조금 AG-NS-0843-11, 그리고 NCI 암 센터 지원 교부금 P30CA030199 A.S. 내에서 NIH 파일럿 교부금에 의해 지원되었다.
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참고문헌
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890....
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