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Artículo de método

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

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DOI:

10.3791/60002

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22 de julio de 2019

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1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

En este artículo

Resumen

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Resumen

Las técnicas de limpieza óptica hacen que el tejido sea transparente equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para imágenes tridimensionales posteriores (3-D). Han recibido gran atención en todas las áreas de investigación por el potencial de analizar estructuras microscópicas multicelulares que se extienden a lo largo de distancias macroscópicas. Dado que los túbulos renales, la vasculatura, los nervios y los glomérulos se extienden en muchas direcciones, que sólo han sido capturados parcialmente por técnicas bidimensionales tradicionales hasta el momento, la limpieza de tejidos también abrió muchas nuevas áreas de investigación renal. La lista de métodos de compensación óptica está creciendo rápidamente, pero sigue siendo difícil para los principiantes en este campo elegir el mejor método para una pregunta de investigación dada. Aquí se proporciona un método simple que combina el etiquetado de anticuerpos de rebanadas gruesas de riñón de ratón; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar; e imágenes confocales. Este protocolo describe cómo perfumar los riñones y utilizar un paso de recuperación de antígenos para aumentar la unión de anticuerpos sin necesidad de equipos especializados. Su aplicación se presenta en imágenes de diferentes estructuras multicelulares dentro del riñón, y se aborda cómo solucionar la mala penetración de anticuerpos en el tejido. También discutimos las posibles dificultades de la toma de imágenes de fluoróforos endógenos y la adquisición de muestras muy grandes y cómo superarlas. Este sencillo protocolo proporciona una herramienta completa y fácil de configurar para estudiar el tejido en tres dimensiones.

Introducción

El creciente interés en estudiar órganos enteros o grandes estructuras multicelulares ha llevado al desarrollo de métodos de limpieza óptica que implican imágenes de tejido transparente en tres dimensiones. Hasta hace poco, los mejores métodos para estimar el número de células, la longitud o el volumen de estructuras enteras han sido la estereología o la sección serial exhaustiva, que se basa en el muestreo sistémico de tejido para su posterior análisis en dos dimensiones1, 2 , 3. Sin embargo, estos métodos consumen mucho tiempo y necesitan un alto nivel de formación y experiencia4. Los métodos de limpieza óptica superan estos problemas equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para hacer que el tejido sea translúcido para imágenes 3D5,6,7.

Se han desarrollado varios métodos de compensación óptica que se dividen en dos categorías principales: métodos basados en disolventes y acuosos. Los métodos acuosos se pueden dividir aún más en una inmersión simple8,9, hiperhidratación10,11,e hidrogel incrustando12,13. Los métodos a base de disolventes deshidratan el tejido, eliminan los lípidos y normalizan el índice de refracción a un valor alrededor de 1,55. Las limitaciones de la mayoría de los métodos basados en disolventes son el enfriamiento de la fluorescencia endógena de proteínas de reportero de uso común como GFP, toxicidad de disolventes, capacidad para disolver los pegamentos utilizados en algunas cámaras de imágenes u lentes objetivas, y contracción del tejido durante deshidratación14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, los métodos basados en disolventes son simples, eficientes en el tiempo y pueden funcionar en varios tipos de tejidos diferentes.

Los métodos acuosos se basan en la inmersión del tejido en soluciones acuosas que tienen índicesrefractivos en el rango de 1,38-1,52 8,11,12,22,23,24 . Estos métodos fueron desarrollados para preservar la emisión de proteínas fluorescentes endógenas de reportero y prevenir la contracción inducida por la deshidratación, pero las limitaciones de la mayoría de los métodos de limpieza a base acuosa incluyen una mayor duración del protocolo, expansión de tejidos y modificación proteica (es decir, desnaturalización parcial de proteínas por urea en protocolos hiperhidratantes como ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS abordó la expansión del tejido mediante la combinación de urea con sorbitol, que contrarresta por deshidratación la expansión del tejido inducida por la urea, y preserva la ultraestructura del tejido según lo evaluado por la microscopía electrónica10. La contracción o expansión del tejido afecta a los tamaños absolutos de las estructuras, las distancias entre los objetos o la densidad celular por volumen; por lo tanto, la medición de los cambios de tamaño al limpiar el tejido puede ayudar a interpretar los resultados obtenidos7,26.

En general, un protocolo para la compensación óptica consta de múltiples pasos, incluyendo pretratamiento, permeabilización, inmunoetiquetado (si es necesario), coincidencia de índices de refracción e imágenes con microscopía de luz avanzada (por ejemplo, bitótno, confocal o microscopía de fluorescencia de láminas de luz). La mayoría de los enfoques de limpieza se han desarrollado para visualizar el tejido neuronal, y estudios emergentes han validado su aplicación en otros órganos5. Esta completa herramienta se ha demostrado previamente para permitir un análisis fiable y eficiente de las estructuras renales, incluyendo glomérulos27,28, infiltrados inmunes28, vasculatura28,y segmentos de túbulos 29, y es un enfoque ideal para mejorar la comprensión de la función glomerular y la remodelación de túbulos en salud y enfermedades.

Aquí se resume un método a base de disolvente que combina inmunomanchado de túbulos renales; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar (ECi); y la imagen por microscopía confocal que permite la visualización y cuantificación completa de los túbulos. Este método es simple, combina la recuperación de antígenos de rodajas de riñón con la tinción de anticuerpos comerciales, y no requiere equipo especializado, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU., y las autoridades locales pertinentes en Aquisgrán, Alemania.

1. Perfusión aórtica abdominal retrógrada y fijación de riñones de ratón

  1. Prepare las soluciones el mismo día o la noche anterior y guárdelas en una nevera durante la noche. Soluciones cálidas a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  2. Haga un lote nuevo de 3% de paraformaldehida (PFA) en 1 salina con búfer de fosfato (PBS). Se necesitan alrededor de 50-100 mL PFA por ratón.
    1. Para hacer 1 L de 3% PFA: Pesar 30 g de PFA y añadir 800 mL de agua destilada en la campana de humo. Revuelva y caliente a 50-60 oC. No calentar por encima de 70 oC.
      ADVERTENCIA: La PFA es tóxica. Prepare PFA en la campana de humos.
    2. Agregue lentamente varias gotas de 2N NaOH. Espere unos minutos hasta que el PFA entre en la solución o agregue algunas gotas más. Algunos trozos pequeños no se disolverán.
    3. Retire la solución del fuego. Agregue 50 mL de 20pbS. Enfríe en hielo a RT.
    4. Ajuste el pH a 7.3-7.4 con HCl. Añadir agua destilada a 1 L.
    5. Elimine las partículas no disueltas filtrando 1 x PBS y 3% de PFA con un filtro de 0,22 m.
  3. Agregue 1.000 unidades de Heparina a 1 L de 1x PBS. Transfiera 1 PBS que contenga heparina y 3% de PFA en 1pbS en jeringas de plástico separadas de 50 ml.
    NOTA: Si está disponible, la bomba a presión controlada a 80-100 mmHg o la presión hidrostática (método de goteo, la altura de las soluciones de perfusión: 160-200 cm por encima del animal) se puede utilizar para la perfusión renal.
  4. Conecte el PBS, pfA y una aguja de mariposa de 21 G con contundente a una aguja de tres vías. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en todo el sistema.
  5. Etiquetar un tubo cónico de 15 ml y dispensar 10 ml de PFA en él.
  6. Anestesia profundamente un ratón C57BL/6 masculino o femenino de 12-24 semanas de edad usando 120 mg/kg de ketamina corporal y 16 mg/kg de xilazina de peso corporal. El animal debe ser revisado para la ausencia completa de capacidad de respuesta pellizcando los reflejos antes de proceder a la cirugía (por ejemplo, reflejo de pellizcar del dedo del dedo del tiempo).
  7. Una vez que el animal haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, colóquelo en su espalda bajo el microscopio de disección. Abra quirúrgicamente el abdomen con una incisión abdominal de línea media con unatijera de funcionamiento y exponga la aorta abdominal.
  8. Sujeta la aorta abdominal justo encima de la ramificación hasta la arteria ilíaca con un hemostat curvo. Luego sujeta la aorta abdominal justo debajo de las arterias renales con un micro serrefine. Hacer una pequeña incisión (1 mm) en la aorta abdominal entre las dos abrazaderas con tijeras de vannas. Inserte la aguja de mariposa en la incisión lentamente y tenga cuidado de no abrir la aorta abdominal.
  9. Ligar la arteria renal derecha con una sutura de seda 5-0 y extraer el riñón derecho para otros análisis si sólo se necesita un riñón para la perfusión y la fijación.
  10. Retire el micro serrefine, transborde la vena porta con tijeras de vannas e persiga inmediatamente con 50 ml de PBS que contenga heparina, luego cambie y persiga con 50 ml de 3% de PFA.
    NOTA: Se requiere una alta presión de perfusión a través de la aorta abdominal para abrir los túbulos renales para una mejor difusión de anticuerpos a través del tejido. La perfusión a través del corazón puede no abrir los túbulos renales.
  11. Recoja el riñón perfundido cuidadosamente y evite pinzar o apretar el tejido.
  12. Retire la cápsula y corte el riñón en rodajas coronales de 1 mm de espesor. Utilice una matrizdesegmentación de datos (Tabla de materiales) para estandarizar el espesor de la rebanada.
    NOTA: Alternativamente, considere el uso de un vibratome.
  13. Sumerja las rodajas renales con el PFA preparado en el tubo cónico de 15 ml etiquetado.
  14. Dispensar 10 ml de PFA a otro tubo cónico de 15 ml etiquetado. Enjuague la aguja de la aguja de la aguja de la aguja del tapón y la mariposa de tres vías con PBS antes de pasar al siguiente ratón.
  15. Lleve a cabo la post-fijación durante la noche en RT protegido de la luz.

2. Preparación e inmunofinación de tejidos

  1. Después de la post-fijación, lave la rebanada de riñón dos veces con 1x tampón de lavado (Tablade Materiales)durante 1 h en un balancín horizontal en RT.
  2. Realizar la recuperación de antígenos. Calentar 300 ml de 1x solución de desenmascaramiento de antígeno (Tcapaz de Materiales)en un vaso de precipitados de 500 ml a 92-98 oC. Encierre la rebanada en el cassette de incrustación permeable al tampón calentado con agitación durante 1 h a 92-98 oC. Retire el vaso de precipitados del fuego y déjelo enfriar a RT.
    NOTA: Algunos proveedores prueban sus anticuerpos para la aplicación de inmunohistoquímica e incluirán un método de recuperación de antígenos sugerido en la hoja de datos. Por lo tanto, algunos epítopos pueden requerir un tampón más básico (por ejemplo, pH 9).
  3. Transfiera la rebanada en 10 ml de tampón de lavado 1x con 0,1% De Tritón X-100 y roca durante la noche en RT. Lavar las rodajas 2x con 10 ml de tampón de lavado fresco 1x durante 1 h al día siguiente.
  4. Diluir el anticuerpo primario en 500 ml de diluyente normal de anticuerpos (Tablade materiales). Comience con una concentración de 1:50-1:100. Mezcle suavemente la rodaja renal en anticuerpoprimario diluido durante 4 d a 37 oC.
    NOTA: Dado que cada anticuerpo tiene propiedades únicas, la temperatura durante la incubación de anticuerpos y las diluciones de anticuerpos deben optimizarse para sondas individuales. Para controles secundarios solo de anticuerpos, incubar tejido renal en diluyente sin anticuerpo primario. En lugar de diluyente de anticuerpos comerciales, se puede utilizar 1 pbS con 0,1% de tritón X-100 y 0,01% de azida sódica.
  5. Lave la rodaja renal en 10 ml de tampón de lavado 1x durante la noche en RT con un cambio de tampón de lavado después de 8 h.
  6. Diluir los anticuerpos secundarios (p. ej., 1:100 para anticuerpos secundarios conjugados por Alexa Fluor) en 500 l de diluyente de anticuerpos normal. Incubar las rodajas renales en anticuerpos secundarios diluidos durante 4 días a 37 oC. A partir de este paso, proteja las rodajas renales de la luz.
  7. Lave las rodajas renales en 10 ml de tampón de lavado 1x durante la noche en RT con un cambio de tampón de lavado después de 8 h.

3. Limpieza de tejidos

  1. Transfiera la rebanada renal a 5 ml de etanol de alto grado 100% (Tablade Materiales)durante 2 h a RT con balanceo suave (con un cambio a etanol fresco después de 1 h). Este paso es para la deshidratación de los tejidos.
    NOTA: Se requiere etanol de alto grado para lograr una alta translucidez tisular en el siguiente paso. El metanol o el tetrahidrofurano son reactivos alternativos de deshidratación con alto potencial de deslipidación.
  2. Sumerja la rodaja renal en 2 ml de ECi (Tablade Materiales)con un suave balanceo a RT (con un cambio a ECi fresco después de 2 h) durante la noche.
    NOTA: El punto de congelación/fusión de ECi es de 6-8 oC. Por lo tanto, no guarde las muestras en la nevera. Llevar a cabo la inmersión en una campana de humo adecuadamente ventilada y evitar el contacto directo con la ropa y la piel (ECi es un compuesto no tóxico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos, pero tiene un fuerte olor). Utilice tubos eppendorf regulares o recipientes de vidrio (sin recipientes de poliestireno).
  3. La translucidez tisular se puede lograr después de la inmersión en ECi y cuando las rodajas renales están listas para la toma de imágenes.

4. ConfocalImaging y análisis de imágenes

NOTA: Para la toma de imágenes, se pueden utilizar otras técnicas de microscopía siempre que la solución de coincidencia de índice de refracción sea compatible con la lente objetivo. Este protocolo utiliza un microscopio confocal invertido.

  1. Añadir 600-1,000 l de ECi en el plato inferior de vidrio (Tablade materiales).
    NOTA: Evitar el uso de platos regulares de cultivo celular, porque ECi es un disolvente orgánico que disolverá los platos de plástico. Del mismo modo, ECi podría atacar piezas de plástico / anillos de aislamiento en lentes objetivas. Consulte los informes adecuados para obtener una visión general de las placas de imagen compatibles30 y las cámaras impresas 3D hechas a sí mismas28.
  2. Transfiera la rebanada renal translúcida al plato. Coloque un cubreobjetos redondo en la rodaja renal para aplicar una ligera presión sobre el fondo de cristal. Selle el plato con película de parafina (Tablade Materiales)para evitar fugas de ECi.
    NOTA: Los órganos enteros o varias rebanadas de tejido de milímetro pueden requerir un borde (cemento dental o elastómero de silicona; ver Tabla de Materiales)alrededor del tejido para hacer una piscina ECi para la muestra.
  3. Coloque el plato en la plataforma de imágenes del microscopio.
  4. Tome varias pilas z y realice costuras. Comience con un tamaño de paso z de 5 m.
    NOTA: Considere la posibilidad de utilizar objetivos de larga distancia de trabajo (>5 mm) y alta apertura numérica (>0.9) para la toma de imágenes de rebanadas u órganos de tejido muy gruesos. Después de la toma de imágenes, transfiera el tejido de nuevo al etanol y guárdelo en tampón de lavado o PBS con 0.02% de azida sódica.
  5. Analice la imagen utilizando renderizado 3D con software (Tablade materiales).

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Resultados

Los riñones son órganos complejos compuestos por 43 tipos de células diferentes31. La mayoría de estas células forman grandes estructuras multicelulares como glomérulos y túbulos, y su función depende en gran medida de las interacciones entre sí. Las técnicas histológicas 2D clásicas capturan parcialmente estas grandes estructuras y pueden pasar por alto los cambios focales dentro de las estructuras intactas31. Por lo tanto, el análisis 3D utilizando técnicas de limpieza óp...

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Discusión

Las técnicas de limpieza óptica han recibido una amplia atención para la visualización tridimensional y la cuantificación de la microanatomía en diversos órganos. Aquí, el método de limpieza a base de disolventes (ECi) se combinó con el inmunoetiquetado para imágenes tridimensionales de túbulos enteros en rodajas renales. Este método es simple, barato y rápido. Sin embargo, otras preguntas de investigación pueden ser mejor respondidas con otros protocolos de compensación5. También es importante te...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

T. S. cuenta con el apoyo de subvenciones de la DFG German Research Foundation (332853055), Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) y la Facultad de Medicina de la RWTH Aachen (Programa de Retorno RWTH). V. G. P. cuenta con el apoyo de becas de investigación de Deutsche Gesellschaft fur Nephrologie, la Fundación Alexander von Humboldt y el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. D. H. E es apoyado por la Fundación LeDucq. R. K. cuenta con el apoyo de subvenciones del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), el Estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Universidad RWTH Aachen (O3-11).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m filtroFisher Scientific09-761-112
15 mL tubo cónicoFisher Scientific339650
21 G aguja de mariposaBraunVenofix
llave de paso de 3 víasFisher ScientificK420163-4503
software de análisis 3DBitplane AGIMARIS
software de análisis 3DCellprofilersoftware abierto gratuito
5-0 sutura de sedaFine Science Tools18020-50
jeringas de plástico de 50 mLFisher Scientific14-817-57
Anticuerpo monoclonal anti-BrdURoche11296736001
Diluyente de anticuerposDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Solución de recuperación de antígenos a base de citratoVector LaboratoriesH-3300
Hemostático curvoFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Microscopio de disecciónMoticDSK-500
Casetes de inclusiónCarl RothE478.1
EtanolMerck
Cinamato de etiloSigma-Aldrich112372
Película flexible/Parafilm MSigma-AldrichP7793
Cabra anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Conejillo de indias anti-NKCC2N/AN/ADOI: 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
HeparinaSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Balancín horizontalLabnetS2035-E
Plato de imagenIbidi81218
KetaminaMWI Animal Health501090
Micro serrefineFine Science Tools18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Tijeras de operaciónMerit97-272
ParaformaldehídoThermo Fischer ScientificO4042-500
Conejo anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Elastómero de siliconaWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
Azida sódicaSigma-AldrichS2002
Cortadora de pañuelosZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
Tijeras VannasFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xilacina)
100983

Referencias

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