Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

Laszlo Radnai; Rebecca F. Stremel; James R. Sellers; Gavin Rumbaugh; Courtney A. Miller

doi:10.3791/60017

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Artículo de método

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

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DOI:

10.3791/60017

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17 de agosto de 2019

Laszlo Radnai¹^,² , Rebecca F. Stremel¹^,² , James R. Sellers³ , Gavin Rumbaugh² , Courtney A. Miller¹^,²

¹Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, ²Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, ³Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Resumen

Las enzimas ATPase utilizan la energía libre almacenada en el trifosfato de adenosina para catalizar una amplia variedad de procesos bioquímicos endergónicos in vivo que no ocurrirían espontáneamente. Estas proteínas son cruciales para esencialmente todos los aspectos de la vida celular, incluyendo el metabolismo, división celular, respuestas a los cambios ambientales y movimiento. El protocolo presentado aquí describe un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) que se ha adaptado a la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores ATPase de moléculas pequeñas. El ensayo se ha aplicado a la miosina cardiaca y esquelética de miosina II, dos ATPases de motor molecular a base de actina, como prueba de principio. La hidrólisis de ATP se acopla a la oxidación de NADH por reacciones enzimáticas en el ensayo. En primer lugar, el ADP generado por el ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK). PK cataliza la transición de fosfoenolpiruvato (PEP) al piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH), que cataliza la oxidación de NADH en paralelo. Por lo tanto, la disminución de la concentración de ATP está directamente correlacionada con la disminución de la concentración de NADH, que es seguida por el cambio a la fluorescencia intrínseca de NADH. Mientras la PEP esté disponible en el sistema de reacción, la concentración de ADP sigue siendo muy baja, evitando la inhibición de la enzima ATPase por su propio producto. Además, la concentración de ATP se mantiene casi constante, produciendo cursos de tiempo lineales. La fluorescencia se monitorea continuamente, lo que permite una fácil estimación de la calidad de los datos y ayuda a filtrar los artefactos potenciales (por ejemplo, derivados de precipitaciones compuestas o cambios térmicos).

Introducción

Las miosinas son transductores de energía mecanoquímicos que hidrolizan trifosfato de adenosina (ATP) para generar movimientodireccional a lo largo de los filamentos del citoesqueleto de actina en eucariotas 1,². Se han adaptado tanto estructural como cinéticamente a sus diversas funciones intracelulares, como el transporte deorgánulos, la contracción muscular o la generación de tensión citoesquelética 1,^2. La superfamilia de miosina está representada por genes de miosina de 40 euros pertenecientes a 12 clases distintas de miosina en el genoma humano