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Artículo de método

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

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DOI:

10.3791/60039

⸱

23 de agosto de 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

En este artículo

Resumen

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Resumen

La organización y la estructura de los dominios de cromatina son exclusivas de los linajes celulares individuales. Su mala regulación podría conducir a una pérdida en la identidad celular y / o enfermedad. A pesar de los enormes esfuerzos, nuestra comprensión de la formación y propagación de dominios de cromatina sigue siendo limitada. Los dominios de cromatina se han estudiado en condiciones estables, que no son propicias para seguir los acontecimientos iniciales durante su establecimiento. Aquí, presentamos un método para reconstruir inducibariamente dominios de cromatina y seguir su re-formación en función del tiempo. Aunque, aplicado primero al caso de la formación de dominios de cromatina represiva mediada por PRC2, podría adaptarse fácilmente a otros dominios de cromatina. La modificación y/o la combinación de este método con la genómica y las tecnologías de imagen proporcionarán herramientas invaluables para estudiar el establecimiento de dominios de cromatina con gran detalle. Creemos que este método revolucionará nuestra comprensión de cómo se forman los dominios de cromatina e interactúan entre sí.

Introducción

Los genomas eucariotas están altamente organizados y los cambios en la accesibilidad a la cromatina controlan directamente la transcripción genética1. El genoma contiene distintos tipos de dominios de cromatina, que se correlacionan con la actividad transcripcional y la sincronización de replicación2,3. Estos dominios de cromatina varían en tamaño de unas pocas kilobases (kb) a más de 100 kb y se caracterizan por un enriquecimiento en distintas modificaciones histonas4. Las preguntas centrales son: ¿cómo se forman estos dominios y cómo se propagan?

Uno de los dominios de cromatina más bien caracterizados se fomenta a través de la actividad del complejo represivo 2 (PRC2). PRC2 es un complejo multisubunidad compuesto por un subconjunto del Grupo Polycomb (PcG) de proteínas5,6, y cataliza la mono-, di- y trimetilación de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 están asociados con un estado de cromatina represiva, pero la función de H3K27me1 no está clara6,11. Uno de los componentes principales de PRC2, el desarrollo embrionario de ectodermos (EED), se une al producto final de la catálisis PRC2, H3K27me3, a través de su jaula aromática y esta característica da como resultado la estimulación alostérica de PRC212,13. La actividad enzimática PRC2 es crucial para preservar la identidad celular durante el desarrollo, ya que la expresión inapropiada de ciertos genes del desarrollo que están contraindicados para un linaje específico, sería perjudicial5,6 . Por lo tanto, desentrañar los mecanismos por los cuales PRC2 fomenta la formación de dominios represivas de cromatina en los mamíferos es de importancia fundamental para entender la identidad celular.

Todos los sistemas experimentales anteriores diseñados para investigar la formación de dominios de cromatina, incluidos los dominios de cromatina mediados por PRC2, se realizaron en condiciones de estado estacionario, que no pueden rastrear los eventos de formación de dominios de cromatina en Células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar un sistema celular inducible que monitorea el reclutamiento inicial y la propagación de dominios de cromatina. Específicamente, nos centramos en el seguimiento de la formación de dominios de cromatina represiva mediados por PRC2 que comprenden H3K27me2/3. Este sistema que puede capturar los detalles mecanicistas de la formación de dominios de cromatina, podría adaptarse para incorporar otros dominios de cromatina, como los dominios ampliamente estudiados que comprenden H2AK119ub o H3K9me. En combinación con la genómica y las tecnologías de imagen, este enfoque tiene el potencial de abordar con éxito varias cuestiones clave en la biología de la cromatina.

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Protocolo

Generación de mESC de rescate EED inducibles

1. Cultivo celular

  1. Utilice células madre embrionarias de ratón C57BL/6 libres de alimentación (mESC) que posean un transgén CreERT2 establemente integrado, que puede translocarse al núcleo tras la administración de 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT)13.
  2. Cultivar mESC en ESC medio convencional14,15, complementado con 1000 U/ml de LIF, 1 inhibidor de ERK DE M PD0325901 y 3 inhibidores GSK3 CHIR99021. Para el medio ESC convencional, utilice DMEM knockout que contenga 15% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1X penicilina/estreptomicina y 0,1 mM de 2 mm de mercaptoetanol.
  3. Utilice placas recubiertas con una solución de gelatina al 0,1% para el cultivo de mESC.

2. Generación de mESCs clonales de EED (KO)

  1. Guía de diseño RNAs (gRNAs) para eliminar Exon 10 y Exon 11 de copia endógena de EED en mESC utilizando la herramienta de diseño CRISPR en Benchling16. EED-KO-gRNA-1 apunta al intrón inmediatamente aguas arriba del exón 10 y EED-KO-gRNA-2 apunta al intrón inmediatamente aguas abajo del Exon 11. La aplicación simultánea de estos gRNAs elimina tanto Exon 10 como Exon 11 por unión final no homóloga (NHEJ).
  2. Clonar gRNAs en pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) utilizando las instrucciones de Ran et al., 201317.
  3. En un formato de placa de 6 pocillos, transfectar 2 x 105 mESCs con 1 mg de cada EED-KO-gRNA-1 y EED-KO-gRNA-2 (ver Tabla de Materiales)utilizando reactivo de transfección siguiendo las instrucciones del fabricante. Cambie el soporte 24 h después de la transfección.
  4. Dos días después de la transfección, aísle las células positivas de GFP utilizando la clasificación de células activada por Fluorescencia (FACS). Espere que la eficiencia de la transfección varíe alrededor del 10-30 %. Ordenar alrededor de 5 x 105 celdas para capturar suficientes células positivas GFP para el chapado.
  5. Placar los mESC positivos GFP aislados en placas de 15 cm pre-recubiertas con 0.1% gelatina (10-20 x103 células por placa) para la recolección de colonias.
  6. Cultivar las células en medio ESC durante aproximadamente una semana hasta que las colonias individuales sean visibles. Cambie el medio cada 2 días.
  7. Escoja un mínimo de 48 colonias usando una punta de micropipeta de 20 l. Raspa sobre la colonia mientras aspiras en la punta de la micropipeta. No divida la colonia en células individuales. Transfiera la colonia a una placa de pozo de 96 que contiene acusación (20 ml).
  8. Incubar las colonias durante 10 min a 37oC hasta que todas las células se disocien.
  9. Agregue 200 ml de medios ESC en cada pocificado utilizando pipeta multicanal.
  10. Mezcle bien y enplaca reline las células en dos placas de 96 pocillos separadas usando pipeta multicanal.
  11. Utilice una de las 96 placas de pozo para el genotipado y mantenga la otra creciendo hasta que se concluya el genotipado. Utilice la solución de extracción de ADN para extraer ADN de la placa de pozo 96 siguiendo las instrucciones del fabricante.
  12. Utilice las imprimaciones de genotipado Gnt_EED-KO-up y Gnt_EED-KO_down, que abarcan el sitio eliminado y realizan el genotipado de PCR con la polimerasa de ADN Taq siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Otros tipos de polimerasas de ADN también se pueden utilizar para el genotipado, sin embargo, taq DNA polimerasa ofrece comodidad, ya que la reacción PCR se puede cargar directamente en un gel cuando se utiliza su búfer de reacción de color.
    1. Observar un producto de ADN de menor peso molecular en células con una deleción homocigota en relación con el caso de tipo silvestre (WT).
      NOTA: Para generar células nulas PRC2, es necesaria la eliminación homocigota de los exons 10 y 11 para desestabilizar y degradar EED, una subunidad esencial del núcleo PRC213. La eficiencia de la orientación CRISPR es de alrededor del 10 %.
  13. Validar la deleción del exón 10 y 11 de EED y la pérdida de proteína EED por secuenciación de Sanger y hincha occidental, respectivamente.
  14. Confirme el agotamiento de EED y H3K27me2/me3 de la cromatina en las células eED KO por ChIP-seq utilizando anticuerpos contra H3K27me2/me3 y EED. Utilice el protocolo indicado en Oksuz et al., 201715 para los experimentos ChIP-seq.

3. Ingeniería de los mESC knockout de EED para albergar la expresión inducible de EED basada en Cre-ERT2

  1. Diseñar gRNA (inducible en EED-gRNA) para introducir un corte dentro del intrón después del exón 9 de EED utilizando la herramienta de diseño CRISPR en Benchling16 (ver Tabla de Materiales).
  2. Clonar gRNAs en pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) utilizando las instrucciones de Ran et al., 201317.
  3. Diseñar un ADN de plantilla de donante que comporte secuencia de ADNc EED después del exón 9 y una etiqueta Flag-HA de C-terminal aguas arriba de una secuencia T2A-GFP, todo en orientación inversa con respecto a la secuencia genética endógena.
    1. Flanquee el cassette con un empalme-aceptador y una secuencia de poliadenilación anidada entre sitios loxP invertidos hetrólogo (lox66 y lox71)18.
    2. Incluya al menos 500 bp de brazos de homología de cada extremo. Divida la plantilla de donante en 2 segmentos de fragmentos de genes gBlocks (consulte gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" y gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") y ensamblelos en Vector PCR Blunt utilizando la clonación Gibson siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: gblock-2 contiene un residuo aromático (Y365) dentro de la jaula de EED que es importante para la interacción con H3K27me312. gBlock-2-Wt contiene residuos de tipo salvaje, mientras que gblock-2-cage-mutant contiene el mutante de jaula de EED (Y365A), incapaz de unirse a H3K27me3. El rescate inducible de WT EED se denota como i-WT-r y el rescate inducible de EED de mutante de jaula se denota como i-MT-r para mayor comodidad.
  4. En un formato de placa de 6 pocillos, transfectar 2 x 105 mESCs con 1 mg del gRNA (inducible en ARN-EED) y 1 mg de las plantillas de donante (i-WT-r o i-MT-r) utilizando reactivo de transfección y aislar células positivas GFP utilizando FACS.
  5. Siga los pasos 2.3-2.11 para aislar colonias individuales listas para el genotipado para una segmentación exitosa.
  6. Utilice imprimaciones de genotipado Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-REV-1, que abarcan el cassette insertado y realizan la PCR de genotipado utilizando la polimerasa de ADN Taq.
    NOTA: La eficiencia de segmentación de CRISPR es de alrededor del 10 %.
    1. Confirme la correcta integración del cassette por PCR utilizando inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-REV-2 imprimaciones, que están fuera de los brazos de homología.
      NOTA: La integración homocigota del casete es necesaria para lograr un rescate eficiente de EED. Tenga en cuenta que las células con integración homocigota producirán un solo producto de ADN grande en comparación con WT EED, que producirá un producto corto.
  7. Confirme la integración del cassette mediante la secuenciación de Sanger.
  8. Confirme el volteo del cassette y la expresión de EED y otros componentes principales de PRC2 (por ejemplo, EZH2 y SUZ12) tras la administración de 4-OHT por western blotting.
  9. Confirme la expresión de T2A-GFP y el porcentaje de citometría de flujo. Tenga en cuenta que la expresión de GFP es indicativa de voltear el casete y la expresión de EED.

4. Después de la nucleación y propagación de la actividad de la PRC2 en la cromatina

  1. Confirme que los mESC i-WT-r e i-MT-r no tienen expresión de filtrado de GFP por citometría de flujo. En el caso de la expresión de fugas de GFP, aísle las células GFP negativas por FACS antes de iniciar el experimento.
  2. Expanda los mESC i-WT-r e i-MT-r en cinco placas de 15 cm (5x 106 celdas por placa).
  3. Inducir la expresión de WT o EED mutante en jaula por administración de 0,5 mM 4-OHT durante 0 h, 12 h, 24 h, 36 h y 8 días (una placa de 15 cm por condición). Cambiar el medio después de 12 h para tratamientos de más de 12 h. Aísle las células recombinadas con éxito por FACS utilizando GFP. Ajustar el tiempo de los tratamientos de forma que todas las condiciones se recojan a la vez.
  4. Realice ChIP-seq para H3K27me2, H3K27me3 para investigar su deposición temporal a la cromatina en respuesta a la re-expresión de WT o EED mutante en jaula. Utilice el protocolo ChIP-seq, incluida la preparación de la biblioteca detallada en Oksuz et al., 201715.
  5. Utilice el control de spike-in en cada muestra para permitir la comparación cuantitativa entre diferentes puntos de tiempo19.
    1. Para el control de picos, utilice cromatina de Drosophila melanogaster (en una proporción de 1:50 con la cromatina derivada de mESC), así como el anticuerpo H2Av específico de Drosophila (1 l de anticuerpo H2Av por 4 g de cromatina drosofífica según instrucciones del fabricante) en cada muestra.
    2. Preparar la cromatina de Drosophila de una manera similar a la de los mESC utilizando el protocolo detallado en Oksuz et al., 201715.
  6. Asigne las lecturas de secuencia para el genoma ChIP-seq a mm10 con Bowtie 2 utilizando los parámetros predeterminados20.
  7. Normalizar el ratón ChIP-seq lee para pinchar en Drosophila leer cuenta21. Calcule el factor de normalización de pico utilizando la siguiente fórmula: 1 x 106/único recuentos de lectura de Drosophila. Espere obtener alrededor de 1 x 106recuentos de lecturade Drosophila y 20 x 106 recuentos de lectura de ratón por experimento.
    1. No incluya la cromatina Drosophila al secuenciar las muestras de entrada.
  8. Utilice la herramienta genomecov de bedtools para convertir el archivo bam en bedgraph22. A continuación, convertir el bedgraph en archivo bigwig utilizando la herramienta bedGraphToBigWig de USCS23,24. Consulte el siguiente script:
    gen-"ruta al genoma mm10"
    chr-"ruta a los tamaños de cromosomas mm10"
    inp_bam"ruta para introducir el archivo bam "
    multiplicar "calcular el factor de normalización de pico en"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Visualice las densidades de lectura de ChIP-seq cargando los archivos bigwig en el navegador del genoma USCS24.

5. Monitoreo de la aparición y crecimiento de los focos H3K27me3 en los núcleos de mESCs

  1. Placa 1x 104 mESCs en correderas de cámara de 8 pocillos pre-recubiertas con 0.1% de gelatina.
  2. Al día siguiente, comience a realizar inducciones consecutivas de 4-OHT (0,5 mM) para recoger las células que expresan EED para los puntos de tiempo indicados (0 h, 12 h, 24 h y 36 h). Cambiar el medio después de 12 h para tratamientos de más de 12 h.
  3. Fijar los mESC con 4% de paraformaldehído en solución salina con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
  4. Permeabilizar las celdas con PBS/0.25% Tritón X-100 a RT durante 30 min.
  5. Bloquee las células con PBS/5% suero de burro/0.1% Triton X-100 (buffer de bloqueo) en RT durante 30 min.
  6. Diluir el anticuerpo primario H3K27me3 1:500 en el tampón de bloqueo y añadir a las células.
  7. Incubar las células con anticuerpo primario durante la noche a 4oC.
  8. Al día siguiente, realice 3 lavados con PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Diluir el anticuerpo secundario (Alexa fluor 595) 1:1000 en el búfer de bloqueo y añadir a las células.
    1. Realizar todas las incubaciones en la oscuridad en los siguientes pasos como anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor son sensibles a la luz.
  10. Incubar el anticuerpo secundario durante 2 h a RT.
  11. Realice 3 lavados con PBS/0.1% Triton X-100.
  12. Diluir DAPI (1 mg/ml) 1:4000 con PBS/0.1% Triton X-100 y agregar a las células.
  13. Incubar las células con DAPI durante 10 minutos a RT.
  14. Monte las celdas con el soporte Aqua.
  15. Imagen de las células con microscopía confocal a un aumento de 63X.
  16. Procesar y pseudocolor las imágenes utilizando una distribución de ImageJ, Fiji25.

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Resultados

Un esquema general del sistema de rescate condicional
La Figura 1 muestra el esquema de apuntamiento para rescatar condicionalmente las células de EED KO con WT o EED mutante en jaula (Y365A) que se expresa desde el locus EED endógeno. Después de eliminar EED, una subunidad central de PRC2 que es esencial para su estabilidad y actividad enzimática, se introduce un casete dentro del intrón después del exón 9 de EED (Figura 1). El cassette cons...

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Discusión

Un enfoque poderoso hacia la comprensión de los detalles mecanicistas durante la formación de un dominio de cromatina dado, es primero interrumpir el dominio y luego realizar un seguimiento de su reconstrucción en curso dentro de las células. El proceso se puede pausar en cualquier momento durante la reconstrucción para analizar en detalle los eventos en curso. Estudios previos sobre dominios de cromatina no pudieron resolver tales eventos, ya que se realizaron en condiciones de estado estacionario (por ejemplo, comparan...

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Divulgaciones

D.R. es cofundador de Constellation Pharmaceuticals y Fulcrum Therapeutics. Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a los doctores L. Vales, D. Ozata y H. Mou por la revisión del manuscrito. El D.R. Lab cuenta con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes y los Institutos Nacionales de Salud (R01CA199652 y R01NS100897).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(Z)-4-hidroxitamoxifeno (5 mg)SigmaH7904-5MGPara la inducción de la expresión de EED
16% Solución acuosa de paraformaldehído (10x10 ml)Microscopía electrónica Sciences15710Para inmunofluorescencia
2-mercaptoetanolLifeTechnologies21985-023Para cultivo de mESCs
Solución de gelatina al 2%SigmaG1393-100mlPara mESCs cultivo
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500Para mESCs cultivo
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152para inmunofluorescencia
Aqua-Mount medio de montajeFISHER/VWR41799-008Para inmunofluorescencia
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKPara inmunofluorescencia
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) - 10 mgLife TechD1306Para inmunofluorescencia
Inhibidor de ERK, PD0325901Stemgent04-0006Para cultivo de mESCs
ESGRO Ratón recombinante LIF ProteínaMillipore/FisherESG1107Para el cultivo de mESCs
FBS Stem Cell QualifiedAtlantaS10250Para cultivo de mESCs
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LPara clonación de plantilla de donante
Inhibidor de GSK3, CHIR99021Stemgent04-0004Para cultivo de mESCs
H3K27me2 (D18C8) conejo Señalizacióncélulas9728Spara ChIP-seq
H3K27me3Señalizacióncelular Anticuerpo 9733Spara ChIP-seq
Histone H2Av anticuerpo (pAb)Motivo activo39715Control de picos para ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018Para cultivo de mESCs
L-glutaminaSigmaG7513Para cultivo de mESCs
Lipofectamine 2000LifeTech11668019Para la transfección
MangoTaq ADN polimerasaBiolineBIO-21079para genotipado PCR
Suero de burro normal (10 mL)Jackson ImmunoResearch017-000-121Para inmunofluorescencia
Penicilina-EstreptomicinaSigma/RocheP0781Para cultivo de mESCs
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Para clonación de ARNg
Solución de extracción de ADNQuickExtract LucigenQE0905Tpara genotipado PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning KitThermo FisherK270020para la clonación de plantillas de donantes
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1Secuencia: ctctggctactgtcaactag. Los ARNg se emparejan para eliminar el EED en las ESC C57BL/6 para los sistemas i-WT-r e i-MT-r.
Secuencia EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. Los ARNg se emparejan para eliminar EED en ESC C57BL/6 para sistemas i-WT-r e i-MT-r.
por EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO.
de i-WT-rhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO.
por EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA y donante para generar el sistema i-WT-r en el fondo EED-KO.
i-MT-rhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA y donante para generar el sistema i-MT-r en el fondo EED-KO.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1Secuencia: ctgtaggctgccatctgtga. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1,9 kb. El alelo knockout producirá un producto de 200 pb.
Gnt-EED-KO-REV-1Secuencia: agccagggctacacagagaa. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1,9 kb. El alelo knockout producirá un producto de 200 pb.
Inducible_Genotype-FW-1Secuencia: tgcagtgaaacaaatttggaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 1863 pb. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de ~200 pb.
Inducible_Genotype-REV-1Secuencia: gagaggggtggcactgtaaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 1863 pb. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de ~200 pb.
Inducible_Genotype-FW-2Secuencia: ccccctctctctctctctct Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 3200 bp. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1560 pb.
Inducible_Genotype-REV-2Secuencia: atgcctgggtgaatgaaaaa. Cuando se inserta el casete, los cebadores producirán 3200 bp. El alelo de tipo salvaje producirá un producto de 1560 pb.
de mAB Anticuerpo Secuencia inducible Donantes Secuencia inducible Donantes

Referencias

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Formación de dominios de cromatinacromatina mediada por PRC2knockout mediante CRISPR-Cas9análisis por citometría de flujoanálisis por ChIP-seqmicroscopía de fluorescenciacélulas madre embrionarias de ratóndeleción del gen EEDinducción con 4-hidroxitamoxifenodeposición de H3K27me3
Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina
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