Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mekanistisk Insight inn i utviklingen av TNBS-mediert intestinal fibrose og evaluere den hemmende effekten av Rapamycin

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60067
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science, University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

I denne studien beskriver vi en detaljert prosedyre av TNBS-mediert tarm fibrose, som utstillinger sammenlignbare patofysiologi til Crohns fibrose. Vi diskuterer også denne tilnærmingen i lys av Rapamycin tilrettelagt hemmende effekter på intestinal fibrose.

Abstract

Betydelige studier har blitt gjennomført for å forstå effektiv forvaltning av tarm fibrose. Mangelen på bedre kunnskap om fibrose har imidlertid hindret utviklingen av et forebyggende medikament. Primært finne en passende dyremodell er utfordrende å forstå mekanismen av Crohns-assosiert intestinal fibrose patologi. Her vedtok vi en effektiv metode der TNBS kjemisk eksponering for mus rectums produserer betydelig dypt sårdannelse og kronisk betennelse, og musene deretter kronisk utvikle intestinal fibrose. Også beskriver vi en teknikk der en Rapamycin injeksjon viser hemmende effekter på TNBS-mediert fibrose i muse modellen. For å vurdere den underliggende mekanismen for fibrose diskuterer vi en prosedyre for rensing av Cx3Cr1 + celler fra den lamina propria til TNBS-behandlede og kontroll mus. Denne detaljerte protokollen vil være nyttig for forskere som undersøker mekanismen for fibrose og legge banen for å finne en bedre terapeutisk oppfinnelse for Crohns-assosiert intestinal fibrose.

Introduction

Feilregulering av immun homeostase i tarmen fører til sykdomsfremkallende betennelse og har vært viden kjent for å forårsake inflammatorisk tarmsykdom (IBD)1,2. Intestinal fibrose er en kronisk konsekvens av inflammatoriske tarm sykdommer (IBDs), for eksempel Crohns sykdom (CD)3. Den irreversible patofysiologi av CD inkluderer intestinal striktur eller stenose av fibrose, som begrenser behandlingstilbud, og uten medisiner tilgjengelig for øyeblikket, den eneste behandlingen er kirurgi. Til syvende og sist er utviklingen av effektive terapier for å motvirke upassende betennelser mye som trengs for å studere mekanismen av CD, og dette vil føre oss et skritt nærmere det.

En rekke genetiske musemodeller er tilgjengelig for å studere IBD inkludert IL10 ko, SAMP/YIT og adoptiv CD45+RB høy celle overføring til SCID mus4,5,6. Her viser vi fremgangsmåten for TNBS-mediert fibrose i musen modell av CD, som kan sammenlignes med patologi av humant Crohns fibrose. TNBS-indusert modellen har visse fordeler. Denne modellen er teknisk enkel; sykdom utbruddet er rask, billig, og kan mye brukes i forskjellige dyr (f. eks, mus, rotte og marsvin7). Samtidig administrering av etanol og TNBS (2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonsyrer acid) skader tarm barrieren og eksponerer kolon tissue protein for å TNBS og lokke fram betydelige Immunologic svar8,9. Gjentatt eksponering av TNBS fører til en overreactive reparasjonsprosess som responderer på inflammasjon og skader, og utvikler en antifibrotiske reaksjon i tarmen. Således, TNBS-indusert fibrose modellen tjener til å være en svært overbevisende modell for å studere Crohns-assosiert intestinal fibrose.

Videre mononukleære phagocytes er de primære cellene som megle i medfødt immunrespons til patogenesen og skade i tarmen10,11,12,13. For å belyse den cellulære mekanismen og å etablere rollen til Cx3Cr1+ mononukleære PHAGOCYTES i TNBS fibrose modellen, viser vi prosedyren for rensing av mononukleære phagocytes. Analyse av Cx3Cr1+ celler er et viktig skritt for å vurdere den inflammatoriske markører og bestemme samtidig mekanisme for intestinal fibrose. Kollektivt, denne detaljerte prosedyren for TNBS fibrose vil være nyttig å forklare cellulære mekanismer av intestinal fibrose.

Protocol

For dette manuskriptet, alle menneskelige prøvene ble anskaffet i henhold til den godkjente protokollen ved Institutt gjennomgang Board (IRB) og av komiteen for Human Research ved Albany Medical College. All forskning som involverer dyr ble strengt fulgt i henhold til den godkjente protokollen av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved Albany Medical College samt National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr .

1. innsamling av menneskelige tarm prøver

  1. Samle vevsprøver i henhold til institusjonens forskningskomité protokoller.
  2. Anskaffe tarm vev (ileocolonic) av en CD pasient diagnostisert med fibrose og kontroll prøver fra pasienter uten historie IBDs.
  3. Bruk en del av tarm vevet for immunohistology, en annen del av vevet for å analysere mRNA, og en siste del for protein uttrykk for antifibrotiske og cytokin gener/markører.
  4. For immunohistology analyse, først fikse den menneskelige vev prøven i 4% paraformaldehyde i minst 48 h og deretter overføre den til et rør som inneholder 70% etanol i minst 16 t. Bruk denne faste vev for å lage en parafin-embedded blokk og kutt 5 μm tykt vev deler ved hjelp av en vev-mikrotomen.
  5. Ved hjelp av en pensel, forsiktig spredt ut hvert kutt delen på et glass lysbilde for farging.
  6. Flekk vev delen lysbilde med trichrome beis å oppdage kollagen deponering, og med αSMA beis å oppdage myofibroblasts (se avsnitt 3 for detaljert informasjon om trichrome og αSMA farging). Undersøk fargede seksjoner under et lett mikroskop.
  7. Behandle en annen del av den oppnådde vev prøven for å gjøre protein lysat å oppdage αSMA via Western Blot (se avsnitt 7 for detaljert informasjon om Western Blot analyse).
  8. Skaff RNA fra den siste delen av vevsprøven ved hjelp av en avsugs reagens (tabell med materialer) og Konverter MRNA til CDNA via RT-PCR.
  9. Analyser antifibrotiske og cytokin gener ved qPCR (se avsnitt 6 for detaljert informasjon om mRNA forberedelser).

2. induksjon av TNBS fibrose og Rapamycin behandling hos mus

  1. Gjennomføre dyr forskning i henhold til dyret forskning protokoller godkjent av institusjonen.
  2. Barbere voksen mus rundt halsen området for å pre-sensitize til TNBS via dermal eksponering. Sug TNBS i en bomullspinne, og deretter bruke TNBS til barberte området av musen nakken.
    Merk: pre-overfølsomhet er et svært viktig skritt siden det forbedrer forsinket overfølsomhet respons å initiere TNBS-mediert betennelse.
  3. Åtte dager etter pre-allergi, indusere kolitt ved intra-rektal administrasjon en gang i uken i seks uker. Påfør fire mg TNBS (i 25% etanol) ved hjelp av en 100 μL klyster via en 1 mL sprøyte festet til et 3,5 fransk polyuretan kateter og gi kontroll mus 100 μL av 25% etanol.
    1. Bedøve mus med pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) eller utsett dem for 2,5% isoflurane sammen med 1 L/min oksygen under TNBS-administrering. Bekreft bedøvelsen ved å knipe tærne forsiktig og se etter et fravær av refleks.
  4. Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens mus er under anestesi.
  5. Injiser Rapamycin ved 2 mg/kg/dag eller kjøretøy (5% mellom-20 og 4% etanol) hver ukedag i 3-6 uker, intraperitoneal, til både kontroll og TNBS-behandlede mus.
  6. Bruk 6-ukers TNBS post-behandlet mus tarmen for å analysere ekstracellulære analysene inkludert histologi, Flow flowcytometri, Western blotting og RNA utvinning. Å høste organer, euthanize mus bruker CO2 inhalasjon og bekrefte dødshjelp med cervical forvridning.
    1. Å høste organer, euthanize mus bruker CO2 inhalasjon og bekrefte dødshjelp med cervical forvridning. Etter dødshjelp, lengderetningen åpne musen på sin ventrale side ved hjelp av kirurgisk karakter saks og tang. Fjern hele kolon fra endetarmen til Terminal Tarmben området. Raskt overføre kolon til iskald 1x HBSS og vask kolon ved hjelp av samme buffer.
    2. Mål og sammenlign kolon lengdene til kontrollen og TNBS-behandlede mus. Gjør dette trinnet så raskt som mulig for å unngå uttørking av kolon for å unngå celle dødsfall.
    3. Skjær kolon i små biter og holde på-80 ° c for lagring for fremtidige formål (RNA/Western Blot analyse). Bruk en annen del av kolon for FACS analyse.
    4. Sørg for å kutte og samle colonic vevsprøver fra lignende regioner av kolon av både kontroll og TNBS-behandlede dyr.
      Merk: en 10%-20% dødelighet er forventet med TNBS inoculation selv med erfaring, dødeligheten kan reduseres betraktelig.

3. Immuno-histopathologic vurdering av tarm fibrose

  1. Fix menneskelige og/eller mus vev i 4% paraformaldehyde for 48 h, og deretter overføre til 70% etanol for 16 h.
    Merk: Paraformaldehyde er en nevrotoksiske kjemisk så unngå inhalering; bruke en ansiktsmaske mens du bruker den.
  2. Parafin embed den faste kolon vev, Slice til en 5 μm tykkelse, og direkte sette vev på glass lysbilder for histologi.
  3. Utfør H & E og Trichrome blå farging i henhold til produsentens instruksjoner for å oppdage kollagen.
    1. Kort, først deparaffinize seksjoner av submerging lysbildet inneholder seksjoner i to kamre av xylen i 5 min i hvert kammer.
    2. Skyll lysbildene med 100% alkohol i 1 min; Gjenta dette trinnet tre ganger. Skyll igjen med vann fra springen i 1 min.
    3. Etter det, dyppe lysbilder i forvarmet Bouin ' s løsning på 56 ° c for 60 min. Bouin ' s løsning er gul i utseende; vask etter å ha tatt ut lysbildene fra Bouin løsning i vann fra springen i 3 min eller til lysbildene ble fargeløs.
    4. Dypp lysbildene i modifisert Mayer ' s Hematoksylin løsning i 7 min ved romtemperatur.
    5. Beis lysbilder ved å fordype i Trichrome beis for 5-8 min. umiddelbart, skyll lysbildene i rennende vann for 5-10 s for å fjerne overflødig Trichrome flekken.
    6. Tørke lysbilder med 100% alkohol i 1 min. Gjenta denne prosedyren tre ganger.
    7. Fjern lysbilder med xylen i 1 min og gjenta trinn 3x.
    8. Monter lysbilder med monterings medier (tabell over materialer).
  4. Hold forsiktig dekkglass i den ene enden med pinsett og la det dekke hele seksjonen uten bobler. Hvis det er noen bobler, raskt fjerne bobler ved å trykke på dekkglass.
  5. Bruk immunostaining for å oppdage αSMA.
    1. Block kolon seksjoner i blokkering buffer (0,2% Triton X-100 og 5% normal geit serum i 1x PBS) for 1 t ved romtemperatur.
    2. Ruge med 100 μL av fortynnet primær antistoff for αSMA (tabell over materialer) på lysbilde løsningen (0,2% Triton X-100 og 3% normalt geit serum i 1x PBS; anti-αSMA 1:200) ved 4 ° c over natten.
    3. Vask delene tre ganger med 1x PBS.
    4. Bruk geit anti-mus IgG (H + L) bøyd med Alexa fluor 488 (tabell av materialer) som et sekundært antistoff for 2 t ved romtemperatur.
    5. Vask delene tre ganger med 1x PBS.
    6. Bruk DAPI å counterstain kjernen i 5 min.
    7. Vask delene tre ganger med 1x PBS.
    8. Monter lysbilder med fluorescerende monterings medier (tabell av materialer), og forsegle med en dekkglass ved hjelp av neglelakk.
  6. Skaff deg bilder ved hjelp av LSM 880 konfokalmikroskopi mikroskop og Prosessbilder ved hjelp av mikroskop programvare.
  7. Kvantifisere bilder ved å ta et gjennomsnitt av flere utvalgte områder i samme avsnitt med ImageJ.

4. isolering av intestinal lamina propria og rensing av Cx3Cr1+ mononukleære phagocytes

  1. Lengderetningen åpne kolon i iskald Hank ' s balansert salt Solution (HBSS; Tabell med materialer) og vask kolon med samme buffer.
  2. Skjær ca 5 cm små biter av kolon vev ved hjelp av sterile saks i HBSS.
  3. Overfør små kolon vev brikker i en 50 mL konisk rør som inneholder 10 mL pre-fordøyelsen buffer (1x HBSS med 5% FBS mM EDTA og 1 mM DTT), og rist i 20 min ved 100 RPM i en 37 ° c inkubator11.
    Merk: Inkubasjons av colonic vev i 37 ° c ved 100 RPM risting tilstand gir effektiv kollagenase vev fordøyelse og høy utbytte av levedyktige celler.
  4. Kast frittliggende colonic epitel ved å passere gjennom en 40 μm celle sil.
  5. Samle de resterende vev fra sil og ytterligere fordøye dem i fordøyelsen buffer som inneholder Kollagenase type IV og DNase i (tabell av materialer) i 1x HBSS med 5% FBS i 20 min ved 37 ° c ved 100 RPM.
  6. Vortex den fordøyd vev for ca 20 s og passere gjennom en 40 μm celle sil for å få lamina propria fraksjoner.
  7. Sentrifuger lamina propria fraksjoner til pellet ned cellene ved 700 x g i 4 ° c
  8. For å utelukke døde celler fra lamina propria bruke en tetthet gradient (tabell av materialer).
    Merk: tettheten gradient Media som brukes her (tabell over materialer) kan føre til tap av mononukleære celler; Men, det i stor grad fjerner døde celler fra preparatet, som samlet øker renheten.
    1. Gjør 100 mL hver av 30% og 70% tetthet gradient media løsninger. Resuspend de oppnådde cellene i 10 mL av 30% løsning og overlegg på toppen av 5 mL av 70% løsning i en 15 mL tube.
    2. Sentrifuger graderingen i en brems-fri tilstand ved 1 000 x g og romtemperatur. Samle den hvite ringen fase som inneholder lamina propria lymfocytter, som vil være mellom 30% og 70% gradient lag.
  9. Vask de oppnådde cellene ved å re-suspendere i iskald HBSS og sentrifuge ved 500 x g, 20 ° c, i 10 min. re-suspendere celler i FACS (fluorescens-aktivert celle sortering) buffer (PBS, pH 7,4, med 1% BSA og 2 mm EDTA).
  10. Rens mononukleære phagocytes fra de innsamlede cellene rensing ved hjelp av magnetiske perler og/eller FACS sortering.
    1. Magnetisk rensing
      1. Før farging med antistoffer, første blokk celleoverflaten av lamina propria celler ved incubating med anti-mus CD16/CD32 FC blocker i 15 minutter på isen.
      2. Ruge celler med anti-Cx3Cr1-PE (fykoerytrin) antistoffer sammen med anti-PE mikroperler (tabell av materialer) i 30 min på isen, for å fange de bundne cellene. Vask celler med FACS buffer.
      3. Pass på antistoff/perle bundne celler gjennom en magnetisk aktivert celle-sortering kolonne i et magnetisk felt for å fjerne ubundne celler. Vask tre ganger med FACS buffer. Fjern kolonnen fra det magnetiske feltet og skyv stempelet i kolonnen for å gi perle bundne celler.
    2. FACS-sortering
      Merk: FACS sortering kan brukes i stedet for magnetisk rensing. Selv om magnetisk rensing er en enkel og kostnadseffektiv metode, er det begrenset til bare å rense enkeltceller, ikke for subpopulasjoner av celler. Derfor, for å isolere subpopulasjoner av celler, er FACS sorteringsmetode en effektiv metode for sortering av enkeltceller i tillegg til subpopulasjoner av celler.
      1. Block lamina propria celler med anti-mus CD16/CD32 FC blocker (tabell av materialer).
      2. Stain celler ved incubating med anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, og MHCII antistoffer.
      3. Sorter ved hjelp av en FACS Flow flowcytometer, gating for CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- celler for å rense Cx3Cr1 (P3 + P4) befolkning.
  11. Lyse sorterte celler for total RNA-forberedelse og deteksjon av cytokin og antifibrotiske markører (se pkt. 6 for RNA og cDNA-tilberedning).
  12. Analyser mRNA uttrykk for antifibrotiske markører og inflammatorisk cytokin analyse fra isolerte enkelt celle suspensjoner fra magnetisk rensing.
  13. For FACS analyse, blokk celler med anti-mus CD16/CD32 FC blocker (tabell av materialer) før farging med antistoffer mot overflaten eller intracellulære markører.

5. Flow flowcytometri analyse

  1. Celle overflate farging og analyse
    1. Resuspend 5-10 × 105 isolerte lamina propria celler i 50 ml FACS buffer (1% BSA, 2 mm EDTA i PBS, pH 7,4).
    2. Ruge celler med anti-mus CD16/CD32 (tabell av materialer) på en 1:50 fortynning å blokkere FC reseptorer på isen i 10 min.
    3. Vask celler med 500 μL av iskald FACS-buffer for å fjerne ubundne anti-CD16/CD32 før farging av celleoverflaten.
    4. Overflate flekk colonic enkelt celle suspensjoner (106 celler/50 ml) med fluorescerende-merket antistoff ved 1:100 fortynning på isen i 30 min for å evaluere colonic lamina propria.
    5. Vask merkede celler med 500 μL av iskald FACS buffer to ganger for å fjerne ubundne antistoffer.
    6. Analyser merkede mononukleære celler ved å strømme flowcytometri. Gate for Live, deretter for FSC+SSC+ etterfulgt av CD11b+ Cx3Cr1+, og deretter analysere andre MACROPHAGE aktivisering MARKØRER inkludert MHCII, CD80, CD86 og CD40.
  2. Intracellulære cytokin farging og analyse
    1. For intracellulære cytokin farging, fikse og permeabilize overflaten-fargede celler ved hjelp av en fiksering/Permeabilization Solution Kit (tabell av materialer); Følg produsentens anvisninger for detaljerte trinn.
    2. Gate lamina propria celler for Live, deretter for FSC+SSC+ etterfulgt av CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ å oppdage intracellulære nivå av IL23 cytokin og CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ til oppdage intracellulære nivå av IL1β cytokin.
  3. αSMA farging og analyse
    1. Vask celler med FACS buffer to ganger ved sentrifugering ved 200 x g og 4 ° c i 5 min for å fjerne overflødig bindemiddel buffer.
    2. For å bestemme αSMA nivå, permeabilize celler med en fiksering/Permeabilization Solution Kit (tabell av materialer).
    3. Ruge celler med anti-αSMA-AF488 antistoff (tabell av materialer) med 1:1000 fortynning på isen i 30 min.
    4. Vask celler to ganger og deretter gjøre FACS analyse. Gate for Live, FSC+SSC+ etterfulgt av påvisning av αSMA+ celler i colonic celler.

6. RNA-isolasjon, RT-PCR, sann tids PCR-

  1. Isoler RNA fra Mac-er eller FACS-renset celler eller kolon excised vev ved å homogenisere dem i avsugs reagens (tabell med materialer).
    Merk: Bruk vernebriller og annet beskyttelsesutstyr for laboratorier når du arbeider med denne reagens siden det er en lunge-og hud irriterende. Arbeid trygt i en hette.
  2. Tilsett 0,5 μL av RNase-fri glykogen fra 20 μg/mL glykogen lagerløsning (tabell over materialer) for å forbedre utvinningen av total RNA før fremskynde RNA med isopropanol.
  3. Resuspend av RNA-pellet-en i 50, μL av RNase fritt vann (materialfortegnelsen) og ruge ved 55 ° c i 5 min for å oppløse RNA-ganen fullstendig.
  4. Les RNA-konsentrasjoner ved hjelp av en spektrofotometer ved 260 NM.
  5. Syntetisere cDNA med 1 μg av total RNA og en omvendt transkripsjon syntese Kit (tabell av materialer).
  6. Analyser genuttrykk med 2 μL av cDNA som maler via sann tids PCR. Bruk en 96-brønn PCR plate qPCR Master Mix Kit (tabell av materialer). Bruk CT-verdier for å beregne fold endring av RNA overflod etter normalisering av GAPDH/HPRT verdier.

7. vestlig blotting

  1. Lyse kolon vev ved hjelp av RIPA lyse buffer (1% NP40).
  2. Løse protein lysat i en 8% BIS-Tris gel ved en konstant spenning på 80 V.
  3. Overfør gel-protein til nitrocellulose membran (er) i kjøle overføringsbuffer som kjører ved en konstant strøm av 50 mA for 2 t ved 4 ° c.
  4. Blokker ikke-spesifikke regioner på proteinet overført membran med 5% ikke-fett melk i TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% mellom-20) i minst 1 time ved romtemperatur.
  5. For å oppdage αSMA nivåer, ruge membran (er) med αSMA primære deteksjon antistoff ved 4 ° c over natten.
  6. Vask membraner 3-4 ganger ved hjelp TBST i 15 minutter intervaller.
  7. Ruge med HRP-bøyd sekundært antistoff (1:10000) i 5% ikke-fett melk i TBST.
  8. Utvikle membraner ved hjelp av en ECL utviklingssett.
  9. Normalisere protein signalet intensitet med GAPDH som en lasting kontroll for densitometri analyse.

8. statistisk analyse

  1. Analysere data ved hjelp av dataanalyse programvare av valget ved å sammenligne mellom Wild type og KO dyr.
  2. Vurder P-verdien av < 0,05 for å være signifikant (* P < 0,05; * * P < 0,01; * * * P < 0,001).
  3. Bruk student t-test for å teste forskjellene mellom to grupper og ANOVA test for analyse mellom mer enn to grupper.

Representative Results

Vi vedtok TNBS kolitt musemodell for å studere og belyse de underliggende mekanismene for intestinal fibrose8. Her utførte vi en detaljert tid kurs studie av TNBS-mediert kolitt, der TNBS ble rektalt administreres ukentlig til vill type mus i opptil seks uker som representerte skjematisk (figur 1a). Etter seks uker med TNBS behandling, la vi merke til at colonic lengder forkorte gradvis i løpet av TNBS behandling, fra et gjennomsnitt på 5 ± 0,5 cm i kontrollgruppen til 3 ± 0,5 cm i TNBS gruppen; slik kvantitativ analyse av kolon lengden representerer en meget tydelig reduksjon i kolon lengde (figur 1B). For å sikre at TNBS Crohns sykdom modellen kan sammenlignes med den menneskelige Crohns fibrose modell og var ikke en gjenstand knyttet til metodikken, analyserte vi antifibrotiske markører på flere nivåer i en detaljert tid kurs studie for TNBS injeksjon til Wild type . Akkumulering av Alpha-glatt muskel utgangen (αSMA) positive celler og kollagen deponering innen submucosal lag har blitt rapportert i de fleste av fibrose forekomst og regnes som et kjennetegn for antifibrotiske hendelser14. Vi fant at kolon deler av TNBS-behandlede mus som var farget med αSMA viste en 4-6-fold økning i colonic submukosa lag positivt farget med αSMA (figur 1C). Foruten, Trichrome blå farging for disse seksjonene viste også en 2-4-fold økning, noe som tyder betydelig kollagen deponering, som validerer alvorlig intestinal fibrose (figur 1D). Vi vurderte videre aktiveringen av myofibroblasts ved å påvise αSMA-positive celler ved FACS-analyse i TNBS-behandlede mus kolon og fant en signifikant opphopning av αSMA-positive flekker (figur 1E). Videre fant vi betydelig induksjon i uttrykket αSMA, Col-I og Col-III målt ved qPCR-analyse i TNBS-behandlede mus (figur 1F). Økt uttrykk for αSMA protein i Western Blot analyse avslørte økt fibrose (figur 1G). Overall, TNBS Kinetics behandling gir en mulighet til å få tilgang til antatte immunrespons i kroniske tilstander, som tett etterligner CD kronisk fase tilstand og er avgjørende for fibrose utvikling.

For å sammenligne TNBS fibrose med Crohns tilhørende fibrose, analyserte vi uttrykket av fibrose markører og cytokiner i ferskt vev biopsi fra ileum av pasienter med aktiv CD eller under remisjon. Bemerkelsesverdig, fant vi merket induksjon av tykkelse av αSMA-positive lag og økt kollagen deponering som oppdages av trichrome flekker i aktiv CD seksjoner (figur 2A). Vi har også utført Western Blot analyse og bekreftet induksjon av αSMA uttrykk i aktive CD-prøver (figur 2B). I tillegg observerte vi betydelig induksjon av fibrose markører inkludert αSMA, Kol1, som oppdages av qPCR analyse (figur 2C).

Deretter, for å bestemme en mekanisme for å begrense TNBS fibrose vi evaluert virkningene av Rapamycin, en farmakologisk inhibitor av mTOR aktivitet15,16. Følgelig behandlet vi mus med både TNBS og Rapamycin og analysert αSMA og kollagen nivå i kolon histologi og har vist kvantitativ måling av αSMA og kollagen i densitometri tomten (Figur 3A). Våre data tyder på at Rapamycin reduserer αSMA-positive flekker i submucosal lag og reduserer kollagen deponering. For ytterligere å validere og kvantifisere antifibrotiske responser, bestemte vi oss for αSMA, kollagen og TGFβ uttrykk ved qPCR, og αSMA uttrykk ved flyt flowcytometri i TNBS-behandlet kolon (Figur 3B, 3c). Vi har også vist Cx3Cr1+ mononukleære phagocytes indusere en inflammatorisk immunrespons til skade9. Derfor ønsket vi å se om administrering av Rapamycin i TNBS-behandlede mus kunne reversere de inflammatoriske og antifibrotiske effektene. Derfor har vi renset Cx3Cr1+ Resident mononukleære phagocytes fra colonic enkelt celle suspensjoner ved hjelp av magnetiske Mikroperler (Figur 3D). Vi fant et økt nivå av p-P70 og p-s6 i Cx3Cr1+ Resident mononukleære phagocytes ved Western Blot analyse fra TNBS-behandlede mus, og dette nivået ble blokkert av Rapamycin (Figur 3E). Dessuten fant vi at Rapamycin behandling demper ned IL-23 og IL-1β i TNBS-behandlet gruppe (Figur 3F). Videre disse funnene belyse effektiv mekanisme involvert i induksjon av TNBS-fibrose og har vist at Rapamycin attenuates induksjon av fibrose.

Figure 1
Figur 1: vellykket TNBS administrasjon fører til utvikling av intestinal fibrose i mus. A. skjematisk diagram representasjon av ukentlig TNBS behandling gitt til vill-type mus. B. Colon bilder og måling av kolon LENGDER fra TNBS-behandlede mus, høstet på uker 0, 2, 4 og 6 post-TNSB behandling. C-D. Kolon seksjoner ' histologiske analyse beiset med anti-αSMA antistoff for aktivering av myofibroblasts og trichrome blå farging for kollagen; skala bar 100 μm. E. FACS-analyse for å identifisere αSMA-positive celler i kolon og kvantifisering av αSMA-positive celler. F. antifibrotiske markører og cytokiner oppdaget av qPCR. G. Western Blot analyse av αSMA fra kolon LYSAT av TNBS-behandlet og kontroll mus. Denne endrede figuren brukes på nytt med tillatelse fra tidligere utgivelse9 i slimhinne immunologi, 2019 av Mathur et al. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: TNBS fibrose er sammenlignbare med Crohns-assosiert intestinal fibrose. A. representative bilder av kolon biopsier av kontroll, aktiv CD som viser en betydelig økning av trichrome blå farging og αSMA-positive flekker i submucosal lag, skala bar 50 μm. B. Western Blot analyse av αSMA uttrykk og kvantifisering. C. qPCR analyse av antifibrotiske markører og cytokiner. Denne endrede figuren brukes på nytt med tillatelse fra tidligere utgivelse9 i slimhinne immunologi, 2019 av Mathur et al. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Rapamycin behandling effektivt AMELIORATES TNBS-indusert fibrose. A. Colon histologiske analyse-representative bilder av myofibroblast farging med anti-αSMA antistoff og kollagen farging med Trichrome blå, skala bar 100 μm. B. qPCR analyse av ΑSMA, kollagen og TGFβ uttrykk i kontroll/ TNBS-behandlede muse kolon. C. FACS analyse av αSMA i én celle suspensjon fra mus kolon behandlet med Control/TNBS. D. skjematisk for rensing av Cx3Cr1+ celler fra colonic LAMINA propria brøk og FACS analyse av renset celler. E. Western Blot analyse av p-P70 og p-s6 nivåer i renset Cx3Cr1 + mononukleære phagocytes fra mus behandlet med TNBS og/eller Rapamycin. F. qPCR analyse av uttrykket i renset Cx3Cr1 + mononukleære phagocytes, som produserer Il-23 og Il-1β. Denne endrede figuren brukes på nytt med tillatelse fra tidligere utgivelse9 i slimhinne immunologi, 2019 av Mathur et al. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sår helbredelse eller reparasjon av vev er en strengt regulert biologisk prosess17. Under vevsskade med en kjemisk, mekanisk og infeksjon tilstand, utløser en inflammatorisk respons vevet reparasjonsprosessen. Imidlertid fører en dysregulated og patologisk inflammatorisk respons til utvikling av arrdannelse eller en antifibrotiske reaksjon, noe som kan svekke vevs reparasjonsfunksjonen9,18,19. Her viser vi prosedyren for TNBS-indusert fibrose dyr modell, som i betydelig grad aksjer patofysiologi med humant Crohns sykdom. Påfølgende inoculation av TNBS kjemisk eksponering for skade musen epitel forårsaker dyp ulcerasjon og induserer fibrose utvikling. Med en pålitelig, lav kostnad, og rask induksjon av sykdomsutbruddet, er denne metoden allment akseptert av flere forskningsgrupper involvert i studier for vevsskade, transmuralt betennelser og gut-hjerne-aksen.

For å kunne implementere TNBS fibrose modellen, er det flere viktige trinn. For eksempel, tilstrekkelig dosering og timing av TNBS administrasjon er svært viktig. En 6-8-ukers TNBS-inoculation gir dyp vevs sår og er sterkt anbefalt for kroniske antifibrotiske-studier. Resultatet krakk fra mus og retrograd refleks av inokulert TNBS er to store problemer, noe som kan føre til levering av variable doser til mus. Lett trykk nær mus endetarmen kan bidra til å frigjøre avføring før TNBS administrasjon. Holding hodet av dyret ned i noen sekunder dramatisk bidrar til å stoppe Reverse reflux av TNBS. Holde mus i et bur, plassere buret på en varmepute, og gi mus med Napa nektar kan også være nyttige strategier for å forebygge høy dødelighet.

Her diskuterer vi også tarm betennelsen under TNBS fibrose og deres innvirkning på antifibrotiske respons. mTOR/autofagi rolle er grovt innblandet i tarm homeostase og i IBD patogenesen20,21. Vi identifiserte at mTOR/autofagi signalering er avgjørende for å modulere Pro-inflammatorisk svar fra IL-23 og IL1β cytokiner fra Cx3Cr1+ mononukleære phagocytes som påvirker Pro-antifibrotiske Il-23/Il-22 aksen (Figur 3A)9 . Derved er rensing av enkelt Cx3Cr1+ mononukleære-celler for immunoprofiling og genuttrykk et kritisk trinn i modellen. Vi diskuterer i detalj protokollen for å isolere lamina propria og gi rensing prosedyre for Cx3Cr1+ mononukleære celler ved hjelp av magnetiske perler.

Kollektivt, til tross for tilstedeværelsen av genetiske og spontane modeller for Crohns sykdom, TNBS-kolitt er fortsatt et potent verktøy for å studere Immuno-patogenesen av CD og har potensial til å evaluere Crohns fibrose behandlinger. Den store begrensningen for å bruke kjemisk indusert fibrose modeller som TNBS er sjansen for høy variasjon fra bruker til bruker og muligheten for outliers i dataene. En utvalgsstørrelse på 5-8 dyr per gruppe sammen med større brukeropplevelse kan øke konsistens i modellen. Men å finne en passende genetisk modell forårsaker spontan Crohns fibrose er og vil alltid være berettiget.

Disclosures

Konkurrerende interesser: forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), og Crohns & kolitt Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (RM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 e-bioscience 53-9760-82
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 e-bioscience 149760-80
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 Biolegend Inc 101226
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 Biolegend 149006
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block Biolegend Inc 14-9760-80
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-105-639
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody e-bioscience 7074
Bovine Serum Albumin InvivoGen tlrl-isdn
Collagenase type IV Roche 1088866001
DAPI SIGMA D9542
DMEM Corning 10013-CV
DNase I from bovine pancreas Roche D263-5vl
Falcon® 40µm Cell Strainer Corning 352340
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit BD Bioscience 555028
FlowJo FlowJo LLC www.flowjo.com
Glycogen Roche 10901393001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate e-bioscience 5018
Graphpad Prism 7 GraphPad Software Inc www.graphpad.com
H&E kit American Mastertech Kit HXMMHPT
Image J NIH www.imagej.nih.gov/ij/
Mouse: C57BL/6J Jackson Laboratories 664
MS Columns Miltenyi 130-042-201
Percol GE Healthcare 17-0891-01
PMA/Ionomycin salt Sigma P8139
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermofisher A25777
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 Cell signaling 5174
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 Cell signaling 2708
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 Cell signaling 9208
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E Cell signaling 4858
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein Cell signaling 2217
Rapamycin LC LABORATORIES 1003799
TNBS Sigma 92823
Trichorme staining kit American Mastertech Kit STOSTBPT
TRIzol Life technologies 15596018
Verso cDNA Synthesis Kit Thermofisher AB1453B
Zen black 2.1 Carl Zeiss www.zeis.com
Zen blue lite 2.3 Carl Zeiss www.zeis.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
  2. Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
  3. Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
  4. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
  5. Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
  6. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
  7. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
  8. Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
  9. Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
  10. Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
  11. Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
  12. Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
  13. Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
  14. Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
  15. Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
  16. Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
  17. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
  18. Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
  19. Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
  20. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
  21. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).

Tags

Immunologi og infeksjon TNBS-mediert intestinal fibrose Crohns sykdom betennelser Rapamycin autofagi bosatt macrophage genuttrykk
Mekanistisk Insight inn i utviklingen av TNBS-mediert intestinal fibrose og evaluere den hemmende effekten av Rapamycin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X.… More

Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X. F., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter