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Artículo de método

Infección crónica por salmonela fibrosis intestinal inducida

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DOI:

10.3791/60068

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22 de septiembre de 2019

 ,  ,  , 
1The Biomedical Research Centre, University of British Columbia

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo de ratón de fibrosis intestinal impulsada por Salmonella que se asemeja a las principales señas de identidad patológicas de la enfermedad de Crohn, incluida la inflamación transmural y la fibrosis. Este método se puede utilizar para evaluar los factores de huésped que alteran los resultados fibroticos utilizando ratones mutantes mantenidos en un fondo genético C57Bl/6.

Resumen

La fibrosis tisular caracterizada por la acumulación patológica de la matriz extracelular como el colágeno es el resultado de la inflamación persistente y la reparación desregulada. En la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la fibrosis conduce a formaciones recurrentes de estenosis para las que no hay una terapia eficaz que no sea la resección quirúrgica. Debido a su inicio tardío, los procesos que impulsan la fibrosis son menos estudiados y en gran medida desconocidos. Por lo tanto, las complicaciones fibrosas representan un desafío importante en la EII. En este protocolo, se describe un modelo robusto in vivo de fibrosis intestinal donde el pretratamiento de estreptomicina de ratones C57Bl/6 seguido de gavage oral con el grado de vacuna Salmonella Typhimurium AaroA mutante conduce a la colonización persistente de patógenos y fibrosis del cecum. Metodologías para la preparación de S. Se explica Typhimurium -AroA para la inoculación, la cuantificación de las cargas de patógenos en el cecum y el bazo, y la evaluación de la deposición de colágeno en los tejidos intestinales. Este modelo de enfermedad experimental es útil para examinar factores de huésped que mejoran o exacerban la fibrosis intestinal similar a la CD.

Introducción

La colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son las dos formas principales de EII y se caracterizan como trastornos inflamatorios crónicos y recurrentes del tracto gastrointestinal 1,2. Estos trastornos tienen un impacto importante en la calidad de vida de los pacientes. Los síntomas de la EII incluyen dolor abdominal, diarrea, náuseas, pérdida de peso, fiebre y fatiga3. Estudios recientes han identificado factores genéticos y ambientales que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad; se cree que tales factores de riesgo contribuyen a la interrupción de la barrera epitelial que resulta en la translocación o sobremuestreo de antígenos luminales4. Como consecuencia, esto inicia una respuesta inflamatoria aberrante a la flora commensal mediada por las células inmunitarias intestinales4. Las características de las complicaciones asociadas a la EII pueden extenderse a sitios más allá del tracto gastrointestinal que afectan a varios órganos, incluyendo articulaciones, piel, y el hígado1,2. Las características de la UC incluyen inflamación grave y difusa típicamente localizada en el colon1. La patología de la enfermedad afecta a la mucosa y la submucosa del intestino, lo que resulta en ulceraciones superficiales de la mucosa1. Por el contrario, la CD puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal, aunque la evidencia de la enfermedad se encuentra comúnmente en el colon y el íleon distal2. Por otra parte, la inflamación en CD es transmural, afectando a todas las capas de la pared intestinal2.

Varios genes de susceptibilidad de la EII que se han identificado indicarían que la desregulación de la barrera epitelial o la inmunidad son contribuyentes críticos a la progresión de la enfermedad5. Se encontró que las mutaciones en el dominio 2 de oligomerización de nucleótidos (NOD2) expresadas por monocitos estaban asociadas con una mayor susceptibilidad a la CD; esto pone de relieve un vínculo entre la detección inmune innata alterada de los componentes bacterianos y la enfermedad6. Estudios de asociación más recientes del genoma (GWAS) han revelado vías adicionales potencialmente implicadas en la patogénesis de la EII, incluidas variaciones genéticas en: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R vinculada a la inmunidad adaptativa, MUC1, MUC19y PTGER4 en el mantenimiento de barreras intestinales, y la autofagia mediada ATG16L7,8,9. Si bien estos estudios genéticos basados en la población han mejorado nuestra comprensión de la EII, es probable que los alelos de susceptibilidad por sí solos sean insuficientes para iniciar y mantener la enfermedad crónica3. Otros factores no genéticos, incluyendo alteraciones en la composición del microbioma intestinal y una reducción en la diversidad se han asociado con la inflamación intestinal. Sin embargo, no está claro si la disbiosis intestinal precede o es la consecuencia de las respuestas inmunitarias desreguladas3. Aunque la etiología de la EII sigue sin estar clara, nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad se ha visto reforzada por modelos experimentales de ratón de inflamación intestinal10,11. Estos modelos individualmente no representan plenamente la complejidad de la enfermedad humana, pero son valiosos para esclarecer vías fisiopatológicas que podrían ser relevantes para la EII y para la validación de estrategias terapéuticas tentativas10, 11. Estos modelos de ratón suelen basarse en el inicio de la inflamación por inducción química o infección, transferencia de células inmunitarias o manipulación genética. Además, estas estrategias a menudo implican perturbaciones en la integridad epitelial o modulación de inmunidad innata o adaptativa.

Los seróvares enterica sándalos de Salmonella son patógenos intestinales que pueden infectar a humanos y ratones. Después de la ingestión, Salmonella puede colonizar el intestino por invasión directa de epitelia, células M, o antígeno que presenta las células12. Ratones infectados por vía oral con S. Typhimurium da como resultado la colonización principalmente de sitios sistémicos como el bazo y los ganglios linfáticos mesentéricos con relativamente baja abundancia en el tracto gastrointestinal12. Sin embargo, el pretratamiento de ratones con estreptomicina mejora la eficiencia de la colonización de Salmonella del intestino al disminuir los efectos protectores del huésped de la microbiota normal13. Las características patológicas de este modelo incluyen la interrupción o ulceración de la barrera epitelial, el reclutamiento de granulocitos y el edema grave13. Alternativamente, infección con la vacuna grado S. El mutante Typhimurium -AroA conduce a la colonización crónica del cecum y el colon que persiste hasta el día 40 después de la infección14. El S. La cepa Typhimurium -AroA tiene un defecto en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos; esto hace que la cepa mutante avirulemente y se puede utilizar como una vacuna altamente eficaz15. La infección oral en ratones conduce a una respuesta inflamatoria asociada a Th1 y Th17-citoquina, remodelación extensa del tejido y deposición de colágeno. La patología tisular se asocia con niveles elevados de factor profibrotico como TGF-1, CTGF e IGF14. La cicatrización fibrosa transmural notificada en este modelo recuerda a las formaciones de estenosis que a menudo se observan en la EII. La inducción de fibrosis por Salmonella requiere virulencia codificada por las islas de patogenicidad de Salmonella (SPI)-1 y 2 12. Es importante destacar que esta S. El modelo de infección de Tymphimurium -AroA es un sistema útil para el estudio de respuestas fibrosas en ratones mutantes mantenidos en un fondo C57/Bl6. La cepa C57/Bl6 es extremadamente sensible a S. Infección por Typhiumurim SL1344 debido a una mutación de pérdida de función en el gen que codifica la proteína de macrófago sasociado a la resistencia natural (NRAMP)-116,17. Hemos encontrado que las células linfoides innatas dependientes de IL-17A y ROR son importantes contribuyentes a la patogénesis en este modelo18.

Una complicación importante de la CD es la deposición desregulada y excesiva de la matriz extracelular (ECM) incluyendo colágeno2,19. Aunque el tracto gastrointestinal tiene una capacidad relativamente alta de regeneración, la cicatrización fibrosa puede surgir debido a las respuestas curativas de heridas no resueltas que se asocian con inflamación crónica y grave20,21. En CD, esto resulta en efectos nocivos en la arquitectura del tejido que conduce a un deterioro significativo del órgano21,22. La naturaleza transmural de la inflamación observada en cd en última instancia precede al engrosamiento de la pared intestinal asociada con la estenosis sintomática o formación de estenosis21. Alrededor de un tercio de los pacientes con CD requieren resección intestinal para esta complicación22. No existen terapias antifinosfóticas eficaces en la EII, dado que el uso de inmunosupresores como los productos biológicos de azatioprina o anti-TNF no tienen ningún impacto o sólo redujeron modestamente el requisito de intervenciones quirúrgicas19,23 . Mientras que la fibrosis se cree que es la consecuencia de la inflamación crónica, las células de origen mesenquimal como los fibroblastos y los pericitas se cree que son las principales fuentes celulares de ECM en cicatrices fibrosas21,24. Crónica S. La infección por Typhimurium -AroA es un modelo robusto de ratón de fibrosis intestinal que puede ofrecer información sobre la patogénesis de características similares a los CD.

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Protocolo

Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica.

1. Preparación de salmonella Typhimurium -AroA cultivos para el gavage oral de ratones

  1. De un stock de glicerol congelado de S. Typhimurium -AroA, prepare una placa de rayas con agar LB que contenga 100 g/ml de estreptomicina con un bucle inoculante estéril. Incubar durante la noche a 37oC. Las placas de rayas se pueden almacenar hasta una semana a 4 oC.
  2. Un día antes de la infección, preparar el antibiótico disolviendo 0,5 g de estreptomicina en 2,5 ml de agua. Después de filtrar la solución de estreptomicina esterilizante, atraviese oralmente a los ratones utilizando una aguja de gavage de 22 G con punta de bulbo y una jeringa de 1 ml con 100 ml de solución de estreptomicina (20 mg de estreptomicina/dosis). Usando un bucle inoculante, inocular 3 ml de caldo LB (50 g/ml de estreptomicina) en un tubo de cultivo con una sola colonia. Incubar el cultivo de Salmonella aeróbicamente a 37oC durante la noche con temblores a 200 RPM.
  3. El día de la infección, preparar la dosis final de infección realizando 2 diluciones consecutivas de 1/10 de cultivos de Salmonella durante la noche en PBS estéril. Esto resultaría en un inóculo de 100 l que contiene aproximadamente 3 x 106 Ufc.
  4. Usando una aguja de gavage de 22G con punta de bombilla y una jeringa de 1 ml, envien cada ratón con 100 ml de la Salmonella preparada.
    NOTA: Preparar cultivos de Salmonella utilizando técnicas asépticas. La concentración final de inoculación de Salmonella puede verificarse mediante diluciones en serie de chapado en agar LB con estreptomicina. La cepa S. Typhimurium -AroA se puede obtener poniéndose en contacto con el profesor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).

2. Evaluación de las cargas de Salmonella en los tejidos

  1. Prepare microtubos de fondo redondo de 2 ml con 1 ml de PBS estéril y una perla de acero inoxidable autoclave. Pese previamente los tubos antes de la recolección de tejidos.
  2. Resecíe los tejidos cecales y esplénicos de ratones eutanetaizados por la exposición al dióxido de carbono. Recoger el tejido de animales individuales en tubos separados. Pesar los tubos para determinar el peso del tejido.
  3. Homogeneizar utilizando un aparato de molino mezclador durante 15 min a 30 Hz. Transfiera 900 l de PBS por poca en un megabloque de 96 pozos y 2 ml. La pipeta se homogeneiza 100 l de tejido en el primer pozo, se mezcla bien y realiza diluciones en serie añadiendo 100 l a los pozos subsiguientes hasta obtener una dilución de 10-6. Placa de 10 ml de cada dilución en triplicados sobre el agar LB que contiene 100 g/ml de estreptomcyina.
  4. Contar y multiplicar la CFU promedio por un factor de 100 ya que se celenó 10 sde la muestra de 1000 sL, y el factor de dilución adecuado. Divida el peso total del tejido Ufc por pesos tisulares para determinar la UFC por gramo de tejido.
    NOTA: Mantenga todas las muestras sobre hielo o a 4 oC durante el procesamiento de tejidos. Utilice puntas de pipeta de orificio ancho al realizar diluciones en serie con homogeneados tisulares. Prepare el megabloque de 96 pozos que contiene PBS de antemano.

3. Picrosirius Tinción roja y cuantificación de colágeno.

  1. Arreglar los tejidos cecales durante la noche en 10% de formalina tamponada y prepararse para la incrustación de parafina. Corte las secciones de 5 m para la tinción de Picrosirius Red como se describió anteriormente25.
  2. Capture imágenes compuestas de secciones transversales de cecal enteras en un microscopio de campo brillante.
  3. Abra Fiji (ImageJ) y arrastre y suelte el archivo de imagen .tif en la barra de herramientas.
  4. En la barra de menús, seleccione Imagen > Texto > Pila RGB para dividir la imagen en canales rojos, verdes y azules. Deslice la barra horizontal en la parte inferior del panel para establecer el canal en Verde.
  5. Abra Imagen > Ajustar > Herramienta Umbral. Ajuste los límites mínimo y máximo para eliminar las señales de fondo. Una vez establecido el umbral deseado, cierre la herramienta de umbral y vaya a Analizar > Establecer medidas. Desactive Area( Area Fraction), Area Fraction (Limitación al umbral)y Display label (Mostrar etiqueta).
  6. Atraviese la sección de tejido con selecciones a mano alzada o herramienta Detopolis y mida el % área positiva para el colágeno haciendo clic en Analizar > Medir.
  7. Normalizar el área absoluta positiva para la tinción de colágeno en el área del tejido.
    NOTA: Fiji (ImageJ) es un programa de código abierto que se puede descargar en https://fiji.sc. Las imágenes con las mismas condiciones de captura (es decir, brillo y enfoque) deben tener límites de umbral idénticos para una cuantificación precisa. Si hay alguna tinción de fondo dentro del tejido seleccionado, mida el área absoluta y reste de la zona positiva para el colágeno de todo el tejido.

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Resultados

Tratamiento con estreptomicina seguido de infección oral con S. Typhimurium -AroA conduce a inflamación intestinal robusta y fibrosis especialmente en el cecum (Figura 1). Las cargas patógenas típicas de 108 a 109 UFC por 1 g de cecum y 104 UFC por 1 g de bazo se pueden recuperar de animales infectados(Figura 2). La evaluación de la fibrosis en las secciones cecales manchadas de color rojo picrosirius indica fibrosis máx...

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Discusión

Nuestra comprensión de la patogénesis de la EII se ha visto reforzada en gran medida por los modelos de ratón de inflamación intestinal. Aunque estos modelos individuales no recapitulan todas las características de la enfermedad humana compleja y multifactorial, han sido útiles para identificar las características clave de la progresión de la enfermedad. Las estenosis fibrosas asociadas con la EII siguen siendo una necesidad clínica importante no satisfecha, ya que los tratamientos actuales son ineficaces para revertir e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos financieros de interés que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Ingrid Barta por los servicios de histología.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de cierre de caja fuerte de fondo redondo de 2 mlEppendorf22363344
Perlas de acero inoxidableQiagen69989
PBSGibco10010031
Puntas de pipeta de orificio grandeFisher2707134
2 mL placas megablockSarstedt82.1972.002
Agujas de sonda nasogástricaFST18061-22
Sulfato de estreptomicinaSigmaS9137
Molino mezcladorRetschMM

Referencias

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