Aquí, presentamos un protocolo para realizar una evaluación hemodinámica invasiva del ventrículo derecho y la arteria pulmonar en ratones utilizando un enfoque de cirugía de pecho abierto.
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Artículo de método
Evaluación hemodinámica invasiva para el sistema ventricular derecho y hipertensión arterial pulmonar inducida por hipoxia en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un trastorno cardiopulmonar crónico y grave. Los ratones son un modelo animal popular utilizado para imitar esta enfermedad. Sin embargo, la evaluación de la presión ventricular derecha (RVP) y la presión arterial pulmonar (PAP) sigue siendo técnicamente difícil en ratones. RVP y PAP son más difíciles de medir que la presión ventricular izquierda debido a las diferencias anatómicas entre los sistemas del corazón izquierdo y derecho. En este artículo, describimos un método de medición hemodinámica estable del corazón derecho y su validación utilizando ratones sanos y PAH. Este método se basa en la cirugía de pecho abierto y el soporte de ventilación mecánica. Es un procedimiento complicado en comparación con los procedimientos de tórax cerrados. Mientras que se requiere un cirujano bien entrenado para esta cirugía, la ventaja de este procedimiento es que puede generar parámetros RVP y PAP al mismo tiempo, por lo que es un procedimiento preferible para la evaluación de los modelos de HAP.
Introducción
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un trastorno cardiopulmonar crónico y grave con elevación de la presión arterial pulmonar (PAP) y la presión ventricular derecha (RVP) que es causada por la proliferación celular y la fibrosis de las pequeñas arterias pulmonares 1. Los catéteres de la arteria pulmonar, también llamados catéteres Swan-Ganz2,se utilizan comúnmente en el monitoreo clínico de RVP y PAP. Además, se ha utilizado clínicamente un sistema de monitorización PAP inalámbrico3,4,5. Para imitar la enfermedad para su estudio en ratones, se utiliza un entorno hipóxico para simular manifestaciones clínicas humanas de HAP6. En la evaluación de PAP en animales, los animales grandes son relativamente fáciles de monitorear a través de catéteres de arteria pulmonar utilizando la misma técnica que para sujetos humanos, pero los animales pequeños como ratas y ratones son difíciles de evaluar debido a su pequeño tamaño corporal. La medición hemodinámica del sistema ventricular derecho en ratones es posible con un catéter de tamaño ultrapequeño 1 Fr7. En la literatura8,9, se ha informado de un método para medir RVP y PAP en ratones, pero la metodología carece de una descripción detallada. RVP y PAP son más difíciles de medir que la presión ventricular izquierda debido a las diferencias anatómicas entre los sistemas del corazón izquierdo y derecho.
Para obtener parámetros PAP y RVP en el mismo ratón, describimos un enfoque basado en cirugía de pecho abierto para mediciones hemodinámicas del corazón derecho, su validación con ratones sanos y PAH, y cómo evitar la generación de datos artificiales durante el complicado pecho abierto Cirugía. Aunque esta técnica es mejor realizada por un cirujano bien entrenado, tiene la ventaja de poder evaluar PAP y RVP en el mismo ratón.
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Protocolo
El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Fuwai, Academia China de Ciencias Médicas, Peking Union Medical College (NO.0000287). Los animales experimentales fueron alojados y alimentados de acuerdo con las directrices de bienestar animal en China.
NOTA: Los ratones C57BL machos de ocho a 12 semanas de edad se alojaban en un entorno con un ciclo de luz oscuro de 12 h/ 12 h. Los ratones de la HAP fueron alojados durante 4 semanas bajo una concentración de oxígeno del 10%, mantenida según una cámara de hipoxia controlada por oxígeno para inducir hipertensión pulmonar, y los ratones de control fueron alojados en el aire de la habitación (21% de oxígeno) en condiciones idénticas. Las mediciones de RVP y PAP se realizaron al final de las 4 semanas de desafío de hipoxia.
1. Preparación preoperatoria
- Remoje el catéter del transductor de presión (tamaño: 1 Fr) en una salina del 0,9% a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes del experimento hemodinámico.
- Filtrar la solución de 2,2,2-tribromoetanol con filtro de 0,22 m y almacenar en un refrigerador de 4 grados.
- Prepare herramientas y suministros de cirugía limpia, como guantes para la cirugía.
- Preparar 10 ml de solución enzimática digestiva al 1,0% para la limpieza del catéter.
- Conecte el catéter del transductor de presión a un sistema de volumen de presión.
- Calibre el transductor de presión antes de obtener mediciones de presión para cada ratón.
- Gire la perilla de calibración a 0 mmHg y 25 mmHg para enviar una señal de presión de verificación al software de adquisición de datos y configurar el ajuste de calibración en el software.
- Gire la perilla al transductor y ajuste la perilla de equilibrio a la línea base cero.
- Configure un estereomicroscopio estándar y una mesa quirúrgica animal pequeña y controlada por temperatura para el mantenimiento de la temperatura corporal durante la cirugía.
- Configure un sistema de iluminación ligera para la microcirugía para proporcionar suficiente luz sobre el área quirúrgica.
2. Cirugía de pecho abierto y medición hemodinámica
- Anestetizar ratones con 250 mg/kg de 2,2,2-Tribromoetanol mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Si es necesario, repita las dosis suplementarias a 1/3 a 1/2 de la dosis original durante el procedimiento.
- Retire el pecho y el cuello con una afeitadora y loción para depilar(Figura 1A, 2A).
- Asegure cada ratón en la posición supina en una mesa quirúrgica de animales pequeños con control de temperatura para ayudar a mantener la temperatura corporal (37 oC) durante la cirugía.
- Limpie el sitio quirúrgico con 70% de ethanal.
- Una vez que la anestesia esté en vigor, confirme la inducción adecuada de la anestesia utilizando un pellizco en el dedo del dedo del mundo.
- Haga una incisión de línea media en la piel del cuello(Figura 1A).
- Diseccionar el músculo esquelético usando fórceps curvos y exponer la tráquea(Figura 1B, 1C).
- Realice la intubación a través de la boca utilizando un catéter de vaina intravenosa de 22 G modificado. Confirme que el tubo está en la tráquea utilizando fórceps (Figura 1D).
- Conecte el tubo a un pequeño respirador de animales. Calcular y ajustar la velocidad de respiración y el volumen de marea en función del peso corporal de acuerdo con el manual de usuario del ventilador10. Por ejemplo, establezca la velocidad de respiración en 133/min y el volumen de marea en 180 s para un ratón de 30 g basado en el cálculo descrito.
- Fije el tubo para la ventilación con cinta adhesiva.
- Confirme la inducción adecuada de la anestesia con un pellizco en el dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Haga una incisión de línea media en la piel del pecho y diseccione cuidadosamente los músculos del pecho usando una herramienta de cauterización(Figura 2B, 2C).
- Cortar el esternón usando tijeras a través del medio y exponer la cavidad torácica (Figura 2D).
- Prevenir cualquier sangrado usando la herramienta de cauterio durante el procedimiento de cirugía de pecho abierto.
- Exponer el ventrículo derecho con retractores(Figura 2E).
- Inserte el catéter de transductor de presión empapado en salina a través de un pequeño túnel creado con una aguja de 25 G en el ventrículo derecho para medir rVP(Figura 2F y Figura 3A, 3C).
- Sostenga el cable del catéter y cruce la válvula pulmonar de manera coaxial con la arteria pulmonar. Observe la forma de onda de presión y obtenga una señal PAP estable(Figura 3B, 3D).
- Registre datos hemodinámicos utilizando el sistema de adquisición de datos y el software.
- Después de las mediciones finales, eutanasia a los ratones humanamente a través de la inyección de i.p. de una dosis excesiva de 2,2,2-Tribromoetanol solución.
- Retire cuidadosamente el catéter del sistema cardíaco derecho y colóquelo en una jeringa de 1 ml que contenga un 1% de solución enzimática digestiva.
- Utilice agua destilada para lavar continuamente el catéter con cuidado y guardarlo en la caja original.
3. Análisis de datos para hemodinámica
NOTA: Los datos hemodinámicos se registraron y analizaron utilizando el software de análisis11 (Tabla de materiales).
- Para cada ratón, seleccione al menos 10 ciclos de latidos continuos y estables sin ruido para obtener los datos promedio de datos RVP o PAP para cada parámetro.
- Utilice la prueba t-testde Student para comparar los grupos normales de control del aire e hipoxia. NOTA: p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se presentan como la media de SD.
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Resultados
El catéter del transductor de presión se insertó en el ventrículo derecho(Figura 3A)a través de un túnel expandido por una aguja de 25 G, y se obtuvo una forma de onda RVP típica(Figura 3C). El catéter se ajustó continuamente y avanzó lentamente y se mantuvo en el mismo eje que la arteria pulmonar mientras pasaba a través de la válvula pulmonar(Figura 3B). Cuando el sensor de presió...
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Discusión
La intubación traqueal es el primer paso importante para las cirugías de pecho abierto. El método clásico de intubación traqueal para animales pequeños, como ratas o ratones, consiste en hacer una incisión en forma de T en la tráquea e insertar directamente tubos traqueales de tipo Y en la tráquea. En la práctica, encontramos que este método no es fácil durante el funcionamiento. El tubo traqueal tipo Y es demasiado grande para animales pequeños y forma un ángulo con la tráquea. Por lo tanto, es difícil fijar el tubo en ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación está respaldada por el Proyecto de Educación y Reforma Docente de Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), el Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) y el Director Fund of Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluación de Materiales de Implantes Cardiovasculares (2018-PT2-ZR05).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | Para anestesia |
| Controlador de temperatura animal | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | Para control de temperatura |
| Pinzas de disección | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | Para cirugía |
| Gemini Sistema de cauterización | Gemini | GEM 5917 | Para cirugía |
| Catéter intravenoso (22G) | BD angiocath | 381123 | Para intubación |
| LabChart 7.3 | Instrumentos | Para el análisis | |
| de datos Sistema de iluminación lumínica | Olympus | Para cirugía | |
| Catéter Mikro-Tip | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | Para la medición de presión |
| Millar Sistemas de presión-volumen | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | Para la medición de presión |
| Controlador de O2 y cámara de hipoxia | Biospherix | ProOx 110 | Para hipoxia crónica |
| Sistema de adquisición de datos PowerLab | ADInstruments | PowerLab 16/30 | Para el registro |
| de datos Tijeras | Herramientas de Ciencia Fina, Inc. | 14084-08 | Para cirugía |
| Ventilador para animales pequeños | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | Para cirugía |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZ61 | Para cirugía |
| Cinta | 3M | Para cirugía | |
| Enzima Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | Para la limpieza de catéteres |
Referencias
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- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. Methods in Molecular Biology. vol 1816. Ishikawa, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
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