Artículo de método

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

DOI:

10.3791/60098

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1 de noviembre de 2019

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1Liver Disease and Liver Metabolism Lab, CIC bioGUNE, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), 2Proteomics Platforms, CIC bioGUNE, ProteoRED-ISCIII, CIBERehd, 3Advanced Technology Institute in Life Sciences (ITAV)-CNRS-IPBS, UbiCARE

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer, aislar, identificar y caracterizar proteínas modificadas por SUMO in vivo tanto de células de hepatoma humanos como de tumores hepáticos obtenidos a partir de modelos de ratón de carcinoma hepatocelular mediante el uso de entidades de unión SUMO (SUBE).

Resumen

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La modificación post-traduccional es un mecanismo clave que regula la homeostasis proteica y la función en las células eucariotas. Entre todas las proteínas similares a la ubiquitina en el cáncer de hígado, la modificación por SUMO (Pequeño MOcificador de Ubiquitina) ha recibido la mayor atención. El aislamiento de proteínas ENDógenas SUPILAdas in vivo es un reto debido a la presencia de proteasas activas específicas de SUMO. Los estudios iniciales de SUMOylation in vivo se basaron en la detección molecular de proteínas SUCULadas específicas (por ejemplo, por mancha occidental). Sin embargo, en muchos casos, los anticuerpos, generalmente hechos con proteína recombinante no modificada, no inmunopreciaban las formas SULOtiladas de la proteína de interés. La cromatografía de níquel ha sido el otro enfoque para estudiar la SUMOylation mediante la captura de versiones etiquetadas con histidina de moléculas SUMO. Este enfoque se utiliza principalmente en células que se expresan de forma estable o se transcuran transitoriamente con moléculas His-SUMO. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron entidades de unión SUMO (SUBE) para aislar proteínas ENDógenas SUTIladas. En este documento, describimos todos los pasos necesarios para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de sustratos SUMarioados a partir de células de hepatoma humano y tejidos hepáticos de un modelo de ratón de cáncer de hígado mediante el uso de SUBE. En primer lugar, describimos los métodos involucrados en la preparación y lisis de las células de hepatoma humano y muestras de tejido tumoral hepático. A continuación, se detalla una explicación detallada de la preparación de los SUBE y los controles junto con el protocolo para los ensayos desplegables de proteínas. Por último, se proporcionan algunos ejemplos con respecto a las opciones disponibles para la identificación y caracterización del proteoma SUMAlado, a saber, el uso de análisis de western-blot para la detección de un sustrato específico de SUMOylated a partir de tumores hepáticos o el uso proteómica por espectrometría de masas para la caracterización de alto rendimiento del proteoma y el interactoma SUMAylados en células de hepatoma.

Introducción

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El cáncer de hígado es el sexto cáncer más común en todo el mundo y la segunda causa de muertes asociadas al cáncer1. El carcinoma hepatocelular (HCC) es la forma más predominante de cáncer de hígado primario. Históricamente, los factores de riesgo comunes para el desarrollo de HCC incluyeron la infección crónica por hepatitis B o C y el consumo abusivo de alcohol. En las últimas décadas, el síndrome metabólico, diabetes tipo 2 enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha surgido como factores de riesgo para el desarrollo de HCC2. El HCC es muy heterogéneo, tanto fenotípicamente como genéticamente, en el que se interrumpe una compleja red de vías de señalización. En los últimos años, a pesar de que ha habido un aumento en nuestro conocimiento sobre las vías moleculares implicadas en la patogénesis del HCC, todavía no hay enfoques terapéuticos eficaces para el manejo del HCC. Muchas vías se activan en HCC e inhibir una generalmente impulsa la compensación por otras vías3. Esta ha sido una de las principales dificultades al tratar el HCC. Por lo tanto, un enfoque más global puede proporcionar un enfoque terapéutico potencial para el manejo clínico del cáncer de hígado, por ejemplo, dirigido a modificaciones post-traduccionales (PTM), ya que múltiples vías de señalización pueden ser reguladas simultáneamente por LOS PTM de proteínas.

Las modificaciones post-traduccionales se consideran como mecanismos clave que regulan la homeostasis proteica y las funciones4. Los cambios estructurales y funcionales son introducidos por los PTM, aumentando así la diversidad del proteome. Los MPT más comunes incluyen fosforilación, metilación, acetilación, glicosilación, ubiquitinación y conjugación de proteínas similares a la ubiquitina (UbL). Entre todos los UbLs, la modificación de proteínas por SUMO (Pequeño MOdifier de Ubiquitina) ha atraído la atención en asociación con su papel crítico en una variedad de procesos celulares, incluyendo transcripción, localización celular, reparación del ADN y progresión del ciclo celular 5. Recientemente, sumaylación se ha demostrado que está alterado en el cáncer de hígado6,7,8,9, y los cambios en la SUMA ylasiación de proteínas específicas se ha descrito para desempeñar un papel en la progresión de enfermedades relacionadas con el cáncer9.

En los mamíferos, hay cinco paraólogos SUMO, SUMO-1 a SUMO-5. Hasta la fecha, no se dispone de pruebas experimentales sobre la existencia de reacciones endógenas de conjugación SUMO-4 y SUMO-5 endógenas en el nivel de proteína10,11,12. La SUMA en mamíferos se lleva a cabo por una cascada enzimática de tiol-éster que implica tres enzimas, la enzima activadora SUMO heterodimérica (SAE1/SAE2) o E1, la enzima conjugada SUMO (Ubc9) o E2 y una SUMO-E3-ligasa específica para cada proteína diana. La acción de varias familias de SUMO E3s parece estar en un equilibrio dinámico con proteasas específicas de SUMO (SUSPs o SENPs)13 haciendo que la reacción de SUMOylation sea altamente reversible. Además, sólo una pequeña fracción de la proteína SULOilada frente a la proteína total no SUMOylated está presente. De este lado, aislar las proteínas ENDógenas SULOiladas in vivo es bastante difícil13.

LA SUMOylation in vivo fue estudiada inicialmente por western blot utilizando anticuerpos contra la proteína de interés14. La inmunoprecipitación de la proteína se realizó con anticuerpos específicos y luego PAGE-western blot se llevó a cabo con anticuerpos anti-SUMO. El principal problema con esta estrategia es que los anticuerpos generados contra una proteína recombinante no modificada no siempre son capaces de inmunopreciar la forma SUPILAda de una proteína. Alternativamente, la cromatografía de níquel después de la expresión transitoria de las versiones etiquetadas con histidina (His6) de las moléculas SUMO y la proteína de interés se ha utilizado para estudiar la SUMOylation en las células. Sobre esta base, será más conveniente detectar formas modificadas SUMO de células que expresan establemente His6-SUMO15. Para los estudios in vivo, se demostró un enriquecimiento basado en motivos interactuadores en tándem-SUMO (SIM) para la purificación de conjugados de poliSUMO16. Otros grupos han estado utilizando enfoques SUMO de anticuerpos etiquetados con epítopos que proporcionan una herramienta factible para investigar la SUMOylación endógena en células primarias, tejidos y órganos17,18. Y más recientemente, Nielsen y sus colegas han utilizado el enriquecimiento basado en anticuerpos para identificar SUMO endógeno y específico del sitio en células y tejidos19.

Con el fin de proporcionar información complementaria sobre el papel de la SUMOylation in vivo, se desarrollaron entidades vinculantes SUMO (SUBE), también conocidas como trampas SUMO,20. De relevancia, las entidades de unión a ubiquitinas en tándem (TUBEs) se consideran precursoras conceptuales de las SUBE y son herramientas disponibles comercialmente para la detección y aislamiento de proteínas poliubiquiladas21. Los SUBE son proteínas recombinantes que comprenden repeticiones en tándem de SIS, reconociendo así las moléculas SUMO en proteínas modificadas con un aumento en la afinidad general por los sustratos SUMO. Las trampas SUMO se diseñaron mediante la introducción de un e3 ubiquitina-proteína ligasa RNF4 y SIM3 motivos en tándem, en un vector que contiene glutatión S-transferasa (GST), una proteína portadora heteróloga20. Aunque los SUBE no se pueden utilizar correctamente para identificar proteínas diana monoSUMOylated, este método proporciona una herramienta para facilitar la purificación e identificación de proteínas diana poli-SUMO in vivo. Aquí, describimos la aplicación de SUBE para aislar proteínas SULOiladas tanto en células hepatomas humanas como en biopsias de hígado de ratón, una herramienta importante para el estudio del cáncer de hígado. En la Figura 1se muestra un esquema general del protocolo descrito en este manuscrito.

Protocolo

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Todos los experimentos fueron aprobados por los comités institucionales de CIC bioGUNE para el cuidado y manejo de animales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de animales utilizados. Se utilizaron glicinasin glicina masculina de 3 meses de edad(Gnmt) deficiente (Gnmt)y sus littermates de tipo salvaje (Gnmt+/+).

1. Preparación celular y lisis

NOTA: En este documento, se utilizaron Huh-7 (línea celular de hepatoma humano) y THLE2 (línea celular hepática humana).

  1. Mantener las células en placas P100 en medios de crecimiento estándar a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO2-95% de humedad.
  2. Cultivar las células en placas P100 a una densidad de 1.2–1.5 x 106 células por plato contando las células usando una cámara de conteo de hemocitometría Neubauer.
    1. Cultivo Huh-7 en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) y 1% de glutamina.
    2. Cultivo thLE2 células en platos de cultivo pre-recubiertos con 0.01 mg/ml de fibronectina, 0.01 mg/ml albúmina sérica bovina (BSA) y 0.03 mg/ml colágeno tipo I disuelto en medio de crecimiento que consiste en el medio basal de crecimiento de células epiteliales bronquiales (BEGM) complementado con suplemento con suplemento con factores de crecimiento (0,4% de BPE, 0,1% de insulina, 0,1% de hidrocortisona, 0,1% de ácido retinoico, 0,1% transferrina, 0,1% triiodotironina, así como 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/ml factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 70 ng/ml fosfooetanolamina.
  3. En el punto final del experimento, aspirar el medio de las placas y células de lavado con 5 ml de solución salina estéril 1x con fosfato (PBS). Células de Lyse directamente en la placa colocadas en hielo usando 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% de nontídete P-40 (NP40), complementado con cóctel completo de inhibidor de proteasa libre de EDTA y 50 M PR-619 para cada plato P100. Usando un rascador de celdas, raspe suavemente las células de la parte inferior de la placa en el medio de Lisis.
    NOTA: Compruebe que todas las células se han desprendido de la placa inspeccionando visualmente la base de la placa después del tratamiento.
  4. Alternativamente, cosechar células por trippsinización por aspirar medios celulares y agregar 1 mL de 1x (0.05%) trippsin-EDTA a la placa, suficiente para cubrir las células y colocar la placa en la incubadora a 37 oC, 5% CO2y 95% de humedad durante 5 minutos asegurando que todas las células se hayan separado de la placa. Añadir 2 ml de medio de crecimiento precalentado para detener la trippsinización. Centrífuga a 150 g durante 10 min y aspirar al sobrenadante. Lavar con 1PBS y centrifugar a 150 x g durante 10 min. Después de aspirar el sobrenadante, añadir 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo y 50 M PR-619 para cada plato P100.
    NOTA: La adición del PR-619 es crítica.
  5. Centrífuga a 15.500 x g y 4oC durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.

2. Preparación de tejidos y lisis

  1. Tras el sacrificio animal, recoger los hígados de ratón, lavar con PBS frío, y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene las muestras a 80 oC hasta su posterior análisis.
  2. Homogeneizar 75 mg de hígados congelados/o frescos en 1 ml de tampón de lisis helada (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo y 50 M PR-619). Ejecute el homogeneizador a 6500 x rpm, 2 x 60 s cada uno, con una pausa de 30 s (ver Tabla de Materiales).
  3. Centrifugar las muestras en un microfófugo a 15, 500 x g y 4 oC durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet.
  4. Alternativamente, triturar 75 mg de tejidos congelados en nitrógeno líquido. A continuación, recuperar el tejido en 1 ml de tampón de lisis.
  5. Centrifugar la muestra en un microfófugo a 15, 500 x g y 4 oC durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.

3. Encuadernación de GST-SUBEs o control GST a glutatión-agarosa Abalorios

NOTA: La síntesis del control GST-SUBE o GST está fuera del alcance de este manuscrito y puede ser revisada en la literatura publicada anteriormente20. Alternativamente, los SUBE de GST y Control están disponibles comercialmente (por ejemplo, SignalChem).

  1. Preparación de cuentas de glutatión
    1. Añadir 1 ml de agua desionizada a 70 mg de cuentas liofilizadas de glutatión-agarosa. Reconstituir las perlas durante la noche a 4oC (o durante al menos 30 min a temperatura ambiente).
    2. Lavar las perlas a fondo después de la hinchazón (para eliminar la lactosa y el etanol que generalmente están presentes en las cuentas de agarosa en polvo liofilizado). Para ello, primero lave con 10 ml de agua desionizada o PBS seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Realice esto tres veces.
    3. Después de 3 lavados, resuspenda las perlas en 1 ml de PBS para obtener una suspensión del 50% (v/v).
      NOTA: Este volumen es adecuado para el análisis de 10 muestras.
  2. Para cada muestra, añada 100 g de Control GST-SUBEs o GST (ver referencia20) a 100 l de la suspensión de perlas de glutatión y 500 l de PBS.
    NOTA: La abundancia relativa de las proteínas SUMOylated de interés determina la cantidad de GST-SUBEs utilizados para los pull-downs. Para cada nuevo modelo experimental, analice la condición antes del experimento real por la hinchada occidental el material de entrada, uncuado y flujo (FT) utilizando anticuerpos anti-SUMO2/3 o contra proteínas de interés (Kinasa hepática B1 (LKB1).
  3. Incubar todos los GST-SUBEs o control GST con perlas preparadas en 3.2., girando lentamente en rotador o mini rodillo (ver Tabla de Materiales)a 4oC durante al menos 2 h (reacción de unión lenta).
    NOTA: La adición de ditiothreitol de 1 mM (TDT) mejora la unión GST a las perlas de glutatión.
  4. Recuperar las perlas de agarosa por centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Al final, resuspendió las perlas en PBS para obtener una suspensión del 50% (v/v).
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.

4. Ensayo GST Pull Down

  1. Después del paso 1.5, 2.3 o 2.5, tomar 1/10 del volumen total (por ejemplo, 50 l) y diluir en el mismo volumen de tampón de ebullición 3x (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 500 mM -mercaptoetanol, 50% glicerol, 10% SDS, azul bromofenol). Esta fracción se considera como INPUT.
  2. Añadir 450 l de lisato clarificado a partir de los pasos 1.5, 2.3 o 2.5 a 100 l de perlas de glutatión. Incubar el lisado con cuentas, girando lentamente a 4oC durante al menos 2 h.
    NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar 100-200 g de proteína total a partir de los pasos 1.5, 2.3 o 2.5 (cuantificado con el ensayo Bradford) en un volumen total de 450 l.
  3. Gire las cuentas en un microfófugo a 300 x g durante 5 min y recoja el sobrenadante para el análisis. Transfiera 1/10 del volumen total (p. ej., 50 l) en un tubo separado y diluya en un volumen igual de tampón de ebullición 3x. Esta fracción es la fracción de flujo a través (FT).
  4. Lave la muestra restante tres veces con PBS helado de 1 ml, 0,05% Tween 20, gire hacia abajo a 4 oC y 300 x g durante 1 min. Aspirar cuidadosamente asegurando que no quede líquido. Las perlas corresponden a la fracción SUBEs BOUND (SB).
  5. Elule la muestra con 15 s l de tampón hirviendo 3x y 15 l del tampón de lisis. Esto se llama la fracción BOUND.

5. Identificación y caracterización de objetivos SUMO por análisis de Western Blot

  1. Realizar análisis de manchas occidentales utilizando un anticuerpo anti-SUMO2/3 o cualquier otro anticuerpo específico de elección como se describió anteriormente22.

6. Identificación y caracterización del Proteome SUMAYlado por Espectrometría de Masas

NOTA: En el caso del análisis de espectrometría de masas (MS), las muestras se procesaron utilizando el método de preparación de muestras asistida por filtro (FASP) descrito por Wisniewski et al.23.

  1. Desallos los péptidos utilizando microcolumnas C18 de punta de etapa y resuspenderlos en 0.1% ácido fórmico (FA) antes del análisis de la EP.
  2. Cargue las muestras en un sistema LC-MS (ver Tabla de Materiales)y analícelas en triplicado (replicaciones técnicas) (Figura 2b).
  3. Continúe con la identificación de proteínas y el cálculo de la abundancia mediante el uso de un software asociado.
  4. Para el análisis estadístico y la generación de mapas de calor, cargue los datos en la plataforma Perseus (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Aplique una prueba t corregida por la tasa de detección falsa (FDR) basada en permutación para la comparación de las abundancias. Las proteínas con una relación q < 0.05 y una relación SUBEs/GST mayor que 2 se consideraron enriquecidascomo 24.
    NOTA: Las proteínas identificadas con al menos dos péptidos diferentes se consideran en el análisis final.

Resultados

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Identificación de un sustrato específico de SUMAylación en biopsias de tumores hepáticos por Western Blot Analysis

La quinasación hepática B1 (LKB1) SUMOylation ha demostrado recientemente ser un importante factor oncogénico en el cáncer de hígado9,25. Los ratones deficientes en glicina N-metiltransferasa (Gnmt),a menudo conocido como Gnmt,es un modelo que desarrolla espontáneamente carcinoma hepatocelular (HCC), el tipo más común de cáncer de hígado primario. Los SUBE se utilizaron para enriquecer y aislar las proteínas SUMIladas tanto en ratones Gnmt/o con ratones con cáncer de hígado como en sus "littermates de tipo salvaje" (Gnmt+/+). En la Figura 2a, se incluyen la tinción de Ponceau S de las tres fracciones diferentes (entrada, FT y BOUND) obtenidas en el ensayo desplegable SUBE. Una mancha de Ponceau S es útil para controlar un posible efecto nocivo en la carga de proteínas manchadas para ser evaluadas por las manchas occidentales. En la Figura 2b se muestra un análisis de lKB1 de LKB1 mediante subE para capturar LKB1 endógeno. Los niveles de LKB1 SUMOylation se incrementan en tumores hepáticos. En el caso del análisis de manchas occidentales, se observaron cargas iguales y proteínas transferidas por la tinción Ponceau de la fracción de entrada y no se modificaron significativamente después de lavados (flujo a través de fracción). La cantidad de proteína capturada con SUBE fue significativamente mayor, particularmente en los tumores. Alternativamente, la tinción de un gel duplicado con Azul Coomassie puede proporcionar información similar. Las proteínas pegajosas como las formas p53 o SUMOylated de algunas proteínas pueden unirse al control del GST. Para eliminar el fondo, utilice perlas de agarosa de baja densidad, realice un recubrimiento con BSA o incorpore lavados adicionales. Sin embargo, esto podría afectar a aplicaciones como la espectrometría de masas y podría resultar en la pérdida de proteínas que interactúan con baja afinidad.

Caracterización del Interactome SUMO en Células de Hema Humana por Análisis de Espectrometría de Masas

Para investigar la capacidad de la trampa SUMO para interactuar con proteínas NATURALmente SUpiladas, se utilizaron las líneas celulares THLE2 epitéliales epitéliales hepáticos no transformados. El primer paso es la visualización del material total capturado con SUBEs y el uso de GST como un control negativo. Para ello, podemos utilizar protocolos convencionales de tinción de proteínas como se muestra en la Figura 3a. Luego, realizamos análisis de espectrometría de masas. Se identificaron un promedio de 2268 proteínas en las muestras de Huh7 GST (2339, 2297 y 2168 para cada carga, respectivamente), mientras que 2812 proteínas se identificaron de media en la muestra de SubEs Huh7 (2815, 2817 y 2806). Después de la resta, 742 proteínas se enriquecieron en los SUBE. Por otro lado, se identificó un promedio de 2497 proteínas en las muestras THLE2 GST (2476, 2520 y 2495, respectivamente) y 2763 en las SUBE (2823, 2783 y 2684). De ellos, 577 se consideraron enriquecidos en las muestras de SUBE. El análisis de réplicas técnicas recupera el mapa de calor que se muestra en la Figura 3b,que se calculó utilizando la configuración predeterminada disponible (distancia euclidiana, vinculación media y preprocesado con k-means). El mapa de calor representa la distribución de las 100 proteínas más significativas y exclusivamente enriquecidas en cada línea celular.

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Figura 1: Diagrama esquemático del diagrama de flujo de protocolo utilizado para el enriquecimiento, aislamiento e identificación y caracterización del proteome in vivo con SUMOylated para el estudio del cáncer de hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Modificación de LKB1 por SUMO-2 en modelos de ratón de Carcinoma Hepatocelular.
(a ) Tinción de Ponceau S de las tres fracciones diferentes (entrada, flujo a través de (FT) y BOUND) obtenidas en el ensayo desplegable SUBE. (b) Análisis de la mancha occidental de LKB1 mediante entidades de enlace SUMO (SUBE) para capturar SUMOylated ENDógeno LKB1; GAPDH se utiliza como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diferencias entre el proteome CONsumión entre las líneas celulares humanas tumoralEs Huh-7 y THLE2 epitelial hepática no transformada.
(a) Tinción sypro del material proteico capturado, con GST (control negativo) y SUBEs. (c) Mapa de calor que representa las proteínas enriquecidas diferencialmente en las muestras de HUH-7 y THLE2 SUBE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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En este documento, hemos proporcionado una descripción completa y detallada de la metodología que informa del uso de SUBEs para el enriquecimiento, aislamiento e identificación y caracterización de las proteínas SUMOylated en modelos in vivo de cáncer de hígado. Tanto en tumores hepáticos de ratón como en células hepatoma humanas, pudimos aislar e identificar correctamente las proteínas SUPILAdas de interés y realizar una caracterización de alto rendimiento del proteoma e interactoma SUMAylated. A pesar de que la síntesis de SUBE está fuera del alcance de este manuscrito, para más información se deben mirar las siguientes referencias a26. El protocolo descrito es rápido y muy sensible y el paso crítico del protocolo incluye el uso de inhibidores de SENPs (PR-619). Alternativamente, se pueden utilizar inhibidores químicos de la isopeptidasa como NEM (N-Etilmaleimida) e IAA (2-Iodoacetamida) en el tampón de lisis, sin embargo, informes anteriores han demostrado que para el protocolo SUBE, el uso de PR-619 es ventajoso como el otro inhibidores interfieren con la unión gST a las cuentas de glutatión20.

Los SUBE son proteínas recombinantes que comprenden repeticiones en tándem de SIS, reconociendo así las moléculas SUMO en proteínas modificadas con un aumento en la afinidad general por los sustratos SUMO. Debido a su alta especificidad y sensibilidad, el uso de SUBE para el aislamiento del proteome SUMOylated es ventajoso en relación con otros enfoques en la literatura, como la detección por western-blot de proteínas ESPECÍFICAs DE SUMA la proteína de interés o la cromatografía de níquel utilizando las diferentes versiones etiquetadas con histidina de las moléculas SUMO. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, dado que el protocolo SUBEs se realiza en condiciones no desnaturalizantes, se mantiene la interacción entre las proteínas SUDOiladas y otras proteínas que interactúan. Por lo tanto, obtenemos información sobre el interactome SUMO en lugar de sólo una lista de proteínas diana SUMOylated. Por lo tanto, se realizan más experimentos para confirmar si la proteína identificada es un objetivo SUMO o un factor de interacción. Otra limitación de los SUBE es el hecho de que las trampas GST de control utilizadas son capaces de capturar muchas proteínas de fondo relacionadas con el estrés oxidativo. Este problema es especialmente relevante durante el análisis de la EP debido a la alta sensibilidad de la técnica. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado trampas SUMO biotinyladas (bioSUBEs)26. Otra limitación de los SUBE reside en el hecho de que sólo somos capaces de capturar proteínas modificadas por SUMO 2 y SUMO 3, mientras que las proteínas SUMO 1 modificadas no se pueden aislar.

Otra preocupación por el uso de SUBE está relacionada con la cantidad de material de partida necesaria para el procedimiento. El material de partida utilizado para capturar proteínas SULOiladas debe tener en cuenta las diferentes condiciones experimentales exploradas. Mientras que la SUMOylation basal se ha divulgado en varios contextos celulares, SUMOylation es un proceso que es fuertemente inducido después de múltiples condiciones de estrés / estímulos. Si se comparan muestras no tratadas con muestras tratadas, hay que asegurarse de que la columna no está saturada, y se pueden observar diferencias entre esas condiciones. En el caso de los fenotipos de ratón que estamos analizando, no se han utilizado tratamientos y los niveles basales de SUMAylación son bajos. Por esta razón, se utilizaron altas cantidades de proteínas. El nivel de fondo debe controlarse mediante gST y si el enlace no específico es alto, se debe reducir la cantidad de material de partida o el tiempo de enlace. El análisis de la fracción FT puede ser indicativo de la eficiencia de captura incluso si estas trampas prefieren proteínas polisuculadas y no se debe esperar un agotamiento total, una reducción de la SUMOylation total se observa en general Óptima.

Por último, otras aplicaciones de la tecnología SUBEs incluyen la combinación de la tecnología SUBEs con la Resonancia de Plasmón de Superficie en Tiempo Real (SPR) permitiendo las interacciones en tiempo real con proteínas SUMOiladas a partir de extractos celulares27. También, más recientemente, se han desarrollado trampas SUMO biotinicadas (bioSUBEs) con la ventaja de reducir el fondo asociado a etiquetas más grandes, por ejemplo, durante el análisis de espectrometría de masas26. Además, la versión bioSUBE se puede utilizar para detectar proteínas SUGAladas en células vivas por fluorescencia mediante el uso de estreptavidina con tintes fluorescentes distintos aprovechando la unión de estreptavidina a la biotina. Asimismo, se pueden considerar métodos de detección y cuantificación de proteínas SUGAladas con versiones GST y bioSUBEs como se hizo con las entidades de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)21.

En general, el uso de SUBE para el aislamiento y caracterización del proteome SUMOylated relevante en el cáncer de hígado es un método rápido y sensible que proporciona vasta información sobre el papel todavía bastante desconocido de la vía de LA SUMOylation en el cáncer de hígado.

Divulgaciones

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El Dr. Martínez-Chantar asesora a Mitotherapeutix LLC.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Institut National du Cancer, FRANCE, la beca INCa PLBIO16-251 (PLBIO16-251), la beca CONACyT-SRE (México) 0280365 y el programa REPERE de Occitanie, Francia (M.S.R.). Asimismo, NIH (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (a M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Plan de Estado Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Fundación Vasca para la Innovación y la Investigación Sanitaria): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciador con Fondos FEDER (a M.L.M.-C), Asociación Española contra el Cáncer (T.C.D, M.L.M-C), premio Daniel Alagille de EASL (T.C.D), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cáncer (Fundación Científica AECC) Llamadas Raras Tumorales 2017 (a M.L.M), Programa de la Fundación La Caixa (a M.L.M). Agradecemos a MINECO la Acreditación Severo Ochoa Excellence a CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) ratonesCIC bioGUNE
0.5% Tripsina-EDTALife Technologies15400-054
BEBMLonza/Clonetics Corporationcc-3171
BEGM Bullet KitLonza/Clonetics CorporationCC3170
Azul de bromofenolSigma115-39-9
BSASigmaA4503
Microcolumnas C18MilliporeZ720070
Colágeno tipo ISanta Cruz Biotechnologysc-136157
Comprimidos completos sin EDTARoche4693132001
DMEMLife TechnologiesA14431-01
DTTSigma43815
EDTASigmaE6758
EGFSigmae9644
FBSLife Technologies10270
FibronectinaLife Technologies33010018
GlutaminaLife Technologies25030-024
Glutatión perlas de agarosaSigmaG4510
GlicerolSigmaG5516
GST-ControlSignalChemG52-30H
GST-SUBEsSignalChemS291-340G
Huh7CLS (Servicio de líneas celulares)300156https://clsgmbh.de/
IAA (2-yodoacetamida)MerckL58046844
anticuerpo LKB1Santa Cruz Biotechnologysc-32245
Mini LabRoller RotatorLABNETH5500https://www.labnetinternational.com
NaClMerck106404041000
nanoEluteBRUKERhttps://www.bruker.com/
NEM (N-Ethylmaleimida)SigmaE3876
NP40 Fluka74385
PBSLife Technologies14190-094
Peaks softwareBioinformática Soluciones S.A.http://www.bioinfor.com/
FosfoetanolaminaSigmaP0503
Solución Ponceau SSigmaP7170
PR-619Merck662141
Precellys 24Bertin TechnologiesP000669-PR240-A
PSALife Technologies151-40-122
PSGLife Tecnologías10378-016
SDSSigmaL3771
SUMO2/3 anticuerpoAbcamAb3742
THLE-2ATCCATCC CRL-2706http://www.lgcstandards-atcc.org
timsTOF Pro con espectrómetro de masasPASEF BRUKERhttps://www.bruker.com/
β-mercaptoetanolSigma60-24-2

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 379 (9822), 1245-1255 (2012).
  2. Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
  3. Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
  4. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  5. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
  6. Seeler, J. S., Dejean, A. SUMO and the robustness of cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (3), 184-197 (2017).
  7. Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
  8. Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
  9. Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
  10. Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
  11. Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148(2012).
  12. Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509(2016).
  13. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  14. Hilgarth, R. S., Sarge, K. D. Detection of sumoylated proteins. Methods in Molecular Biology. 301, 329-338 (2005).
  15. Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
  16. Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
  17. Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
  18. Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
  19. Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456(2018).
  20. Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690(2013).
  21. Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
  22. Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
  23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  24. Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  25. Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
  26. Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
  27. Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).

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