Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.
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Artículo de método
Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos
En este artículo
Resumen
Resumen
En la última década, los trasplantes de tejido adiposo se han utilizado ampliamente en cirugía plástica y ortopedia para mejorar el agotamiento y/o regeneración de tejidos. En consecuencia, las técnicas para cosechar y procesar el tejido adiposo humano han evolucionado con el fin de obtener rápida y eficientemente grandes cantidades de tejido. Entre ellos, la tecnología de sistema cerrado representa un sistema innovador y fácil de usar para cosechar, procesar y reinyectar tejido graso refinado en poco tiempo y en la misma intervención (intraoperatoriamente). El tejido adiposo se recoge mediante liposucción, lavado, emulsionado, enjuagado y picado mecánicamente en grupos celulares de 0,3 a 0,8 mm. El trasplante autólogo de tejido adiposo fragmentado mecánicamente ha demostrado una eficacia notable en diferentes grupos terapéuticos indicaciones como medicina estética y cirugía, cirugía ortopédica y general. La caracterización del tejido adiposo microfragmentado reveló la presencia de pequeños vasos intactos dentro de los cúmulos de adipocitos; por lo tanto, el nicho perivascular se deja imperturbado. Estos cúmulos se enriquecen en células perivasculares (es decir, ancestros de células madre mesenquimales (MSC)) y el análisis in vitro mostró una mayor liberación de factores de crecimiento y citoquinas implicadas en la reparación y regeneración de tejidos, en comparación con los MSC derivados enzimáticamente. Esto sugiere que el potencial terapéutico superior del tejido adiposo microfragmentado se explica por una mayor frecuencia de LOS CONE presuntivos y una mayor actividad secretora. No se sabe si estos pericitas añadidos contribuyen directamente a un mayor factor de crecimiento y a la producción de citoquinas. Este procedimiento clínicamente aprobado permite el trasplante de MSC presuntivas sin necesidad de expansión y/o tratamiento enzimático, evitando así los requisitos de las directrices GMP, y reduciendo los costos de las terapias basadas en células.
Introducción
El tejido adiposo, utilizado durante mucho tiempo como relleno en cirugía reconstructiva y estética, se ha vuelto recientemente más popular en la medicina regenerativa una vez reconocida como una fuente de células madre mesenquimales (MSC)1. Los lipoaspirados disociados disociados enzimáticamente en suspensiones de una sola célula producen una fracción vascular estromal libre de adipocitos (SVF) que se utiliza inalterada en el paciente o, más comúnmente, se cultiva durante varias semanas en los MSC2.
Sin embargo, la disociación enzimática rompe los microambientes tisulares, asegurando las célu....
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Protocolo
La aprobación ética para el uso de tejidos humanos en esta investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).
1. Colección de tejido adiposo abdominal subcutáneo
NOTA: Todos los instrumentos utilizados en el procedimiento de lipoaspiración manual son proporcionados por el fabricante del dispositivo de microfragmentación.
- Mantenga la esterilidad para todos los fluidos, recipientes, instrumentos y el área operativa durante todo el experimento.
- Coloque la muestra de abdominoplastia (adquirida por el equipo quirúrgico en u....
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Resultados
La disociación mecánica de lipoaspirados manuales dio lugar a la producción de tejido adiposo microfragmentado (MAT), que consiste en un agregado de adipocitos que envuelven una red microvascular(Figura 3). El análisis de inmunofluorescencia de la MAT incrustada en gelatina y criofijada destaca esta estructura, mostrando la red vascular marcada por el receptor Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1) compuesto principalmente por pequeños vasos capilares (
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Discusión
Este artículo describe el fraccionamiento físico, utilizando un dispositivo de sistema cerrado, de tejido adiposo humano en pequeños grupos que muestran la microanatomía normal del tejido adiposo.
El tejido adiposo subcutáneo humano aspirado manualmente y la solución salina se cargan en un cilindro de plástico transparente que contiene grandes esferas metálicas al estilo pinball que, tras el vigoroso temblor manual del dispositivo, rompen la grasa en submilimetro Fragmentos. Los filtros y la s.......
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Divulgaciones
CT es uno de los fundadores de Lipogems.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Claire Cryer y Fiona Rossi de la Universidad de Edimburgo por su asistencia experta en citometría de flujo. También queremos dar las gracias al personal del hospital Murrayfield que contribuyó proporcionando especímenes de tejido.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la British Heart Foundation y Lipogems, que suministraban kits de procesamiento de tejido adiposo. Las muestras de tejido súbditos humanos se adquirieron con el pleno permiso de ética del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehído tamponado (PFA) | Productos químicos VWR | 9317.901 | |
| Solución de NaCl al 0,9 | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 cabra anti-ratón IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 cabra anti-conejo IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Cloruro de amonio | productos químicos de pesca | 1158868 | |
| diluyente anticuente | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Compensación de control negativo (BSA) Plus BD | Biosciences | 560497 | |
| Avidina/Kit de bloqueo de biotina | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa Citómetro de flujo de 5 láseres& nbsp; | BD Biosciences | Láser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) – filtro V450/50 para anticuerpos DAPI y V450; Láser 561nm (amarillo-verde) – filtro YG582/15 para anticuerpos PE; Láser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) y ndash; filtro V710/50 para anticuerpos BV711 | |
| Lectina biotinilada Ulex europaeus Vector | Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Ratón IgG1, k Control de isotipo | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 BD | Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | concentración de stock: 5 mg / mL |
| Cánula de liposucción desechable (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogemas | suministrado en el kit quirúrgico Lipogems | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| glucosa, GlutaMAX sin piruvato de sodio | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Suero de becerro fetal (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatina | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Kit quirúrgico | Lipogems | LG SK 60 | |
| Ratón anti humano- NG2 | BD Biosciences | 554275 | concentración de stock: 0,5 mg/mL |
| PE Ratón IgG1, κ Control de isotipo | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con tapón a presión de filtro de celdas | BD Biosciences | 352235, 25/Paquete | |
| Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL | BD Biosciences | 352003 | |
| Conejo anti humano - PDGFRb | Abcam | 32570 | concentración de stock: 0,15 mg/mL |
| Estreptavidina conjugada-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Cánula de infiltración tisular (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogemas | suministrado en el kit quirúrgico Lipogems | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Tipo-II Colagenasa | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Control de isotipos | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observador | Zeiss | Objetivo utilizado: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| luz LED ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitación 385 nm; 488: Azul, excitación 475 nm; 555: Verde, excitación 555 nm; 647:Rojo, excitación 630 nm |
Referencias
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies.
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Reimpresiones y permisos
