Artículo de método

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

DOI:

10.3791/60117

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20 de octubre de 2019

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1MRC Center for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Dept. of Morphology, Surgery and Experimental Medicine, Section of General Pathology, University of Ferrara, 3Italian Image Institute, 4Orthopaedic Hospital Research Center and Broad Stem Cell Research Center, David Geffen School of Medicine, University of California

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la última década, los trasplantes de tejido adiposo se han utilizado ampliamente en cirugía plástica y ortopedia para mejorar el agotamiento y/o regeneración de tejidos. En consecuencia, las técnicas para cosechar y procesar el tejido adiposo humano han evolucionado con el fin de obtener rápida y eficientemente grandes cantidades de tejido. Entre ellos, la tecnología de sistema cerrado representa un sistema innovador y fácil de usar para cosechar, procesar y reinyectar tejido graso refinado en poco tiempo y en la misma intervención (intraoperatoriamente). El tejido adiposo se recoge mediante liposucción, lavado, emulsionado, enjuagado y picado mecánicamente en grupos celulares de 0,3 a 0,8 mm. El trasplante autólogo de tejido adiposo fragmentado mecánicamente ha demostrado una eficacia notable en diferentes grupos terapéuticos indicaciones como medicina estética y cirugía, cirugía ortopédica y general. La caracterización del tejido adiposo microfragmentado reveló la presencia de pequeños vasos intactos dentro de los cúmulos de adipocitos; por lo tanto, el nicho perivascular se deja imperturbado. Estos cúmulos se enriquecen en células perivasculares (es decir, ancestros de células madre mesenquimales (MSC)) y el análisis in vitro mostró una mayor liberación de factores de crecimiento y citoquinas implicadas en la reparación y regeneración de tejidos, en comparación con los MSC derivados enzimáticamente. Esto sugiere que el potencial terapéutico superior del tejido adiposo microfragmentado se explica por una mayor frecuencia de LOS CONE presuntivos y una mayor actividad secretora. No se sabe si estos pericitas añadidos contribuyen directamente a un mayor factor de crecimiento y a la producción de citoquinas. Este procedimiento clínicamente aprobado permite el trasplante de MSC presuntivas sin necesidad de expansión y/o tratamiento enzimático, evitando así los requisitos de las directrices GMP, y reduciendo los costos de las terapias basadas en células.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo, utilizado durante mucho tiempo como relleno en cirugía reconstructiva y estética, se ha vuelto recientemente más popular en la medicina regenerativa una vez reconocida como una fuente de células madre mesenquimales (MSC)1. Los lipoaspirados disociados disociados enzimáticamente en suspensiones de una sola célula producen una fracción vascular estromal libre de adipocitos (SVF) que se utiliza inalterada en el paciente o, más comúnmente, se cultiva durante varias semanas en los MSC2.

Sin embargo, la disociación enzimática rompe los microambientes tisulares, asegurando las células reguladoras vecinas de células regenerativas presuntivas que se modifican considerablemente por el cultivo in vitro. Para evitar tales artefactos experimentales y las consiguientes alteraciones funcionales, se han intentado procesar el tejido adiposo para uso terapéutico manteniendo intacta su configuración nativa como posible3,4. En particular, la interrupción mecánica del tejido ha comenzado a reemplazar la disociación enzimática. Con este fin, los microfragmentos de sistema cerrado de inmersión completa lipoaspirados en racimos de tejido submilimétrico, libre de sangre y aceite (por ejemplo, Lipogems) a través de una secuencia de filtración de tamiz y alteración inducida por mármol de acero3. El trasplante autólogo de tejido adiposo microfragmentado, utilizando esta tecnología de sistema cerrado, ha tenido éxito en múltiples indicaciones, abarcando cosméticos, ortopedia, proctología y ginecología4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.

La comparación entre el tejido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtenido con el dispositivo del sistema cerrado y el SVF isogénico reveló que con respecto a la distribución de células vasculares/estromales y la actividad secretora en el cultivo, MAT contiene más pericitas, que son presuntos MSCs14, y secreta mayores cantidades de factores de crecimiento y citoquinas15.

El presente artículo ilustra la microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo subcutáneo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado, y el procesamiento posterior de dicho tejido adiposo micronizado para cultivo in vitro, inmunohistoquímica y análisis FACS, para identificar los tipos de células presentes y los factores solubles secretados(Figura 1). El método descrito genera de forma segura organoides submilimétricos derivados de adiposoques que contienen poblaciones viables de células de tejido adiposo en un nicho intacto, adecuado para aplicaciones y estudios adicionales.

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Protocolo

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La aprobación ética para el uso de tejidos humanos en esta investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).

1. Colección de tejido adiposo abdominal subcutáneo

NOTA: Todos los instrumentos utilizados en el procedimiento de lipoaspiración manual son proporcionados por el fabricante del dispositivo de microfragmentación.

  1. Mantenga la esterilidad para todos los fluidos, recipientes, instrumentos y el área operativa durante todo el experimento.
  2. Coloque la muestra de abdominoplastia (adquirida por el equipo quirúrgico en una bolsa estéril sin solución) encima de un paño quirúrgico con la piel hacia arriba. No se requiere lavado. Para un uso óptimo, mantenga la muestra a 4oC y procese la muestra adiposa dentro de las 16 h de la cosecha.
  3. Inyectar de 50 a 100 ml de 37 oC 0,9% de solución de NaCl, dependiendo del tamaño de la muestra de tejido (utilizar 50 ml para un máximo de 15 cm2 superficie de tejido adiposo y aumentar el volumen en consecuencia), utilizando una cánula de infiltración de tejido desechable, en el subcutáneo tejido adiposo. Manipule el espécimen por la parte cutánea.
  4. Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 ml a una cánula de liposucción desechable.
  5. Introducir cuidadosamente la cánula dentro del tejido adiposo de los bordes. Una vez dentro, cree el vacío dentro de la jeringa tirando del émbolo. Mantenga el émbolo en posición manual para asegurar la aspiración al vacío.
  6. Realice movimientos radiales dentro de la muestra de tejido adiposo hasta que la jeringa esté llena de lipoaspiración. Retire cuidadosamente la cánula del tejido y desconecte la jeringa. Conecte una nueva jeringa vacía.
  7. Repita el procedimiento hasta que se hayan recogido 60 ml de lipoaspirate.
    NOTA: La cantidad máxima de lipoaspiración que se puede procesar cambia según el tipo de dispositivo utilizado. Consulte las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).

2. Microfragmentación del lipoaspirate

NOTA: Este protocolo está destinado únicamente para uso de investigación. La microfragmentación se realiza con la ayuda de un dispositivo disponible comercialmente(Tabla de materiales).

  1. Retire el dispositivo del paquete y compruebe que la unidad principal está conectada a la bolsa de residuos. Coloque la bolsa de recogida de residuos en el suelo y asegúrese de que las válvulas estén fijadas a las tapas de la unidad de proceso.
  2. Conecte el pico del terminal de la línea de entrada a la bolsa salina perforando el puerto de conexión de la bolsa. Mantenga la bolsa de salina más alta que la unidad de procesamiento.
    NOTA: Para el tipo de dispositivo utilizado en este protocolo, se recomienda una bolsa de 2.000 ml de solución salina estéril.
  3. Verifique que las 5 abrazaderas conectadas a los tubos de los circuitos estén abiertas. Coloque la unidad de procesamiento en posición vertical con la tapa gris hacia arriba.
  4. Permita que la solución salina llene la unidad de procesamiento. Compruebe que el flujo llegue a la bolsa de residuos. Retire todas las burbujas de aire de la unidad de procesamiento sacudiéndola.
    NOTA: Todos los pasajes siguientes deben realizarse en ausencia de aire en la unidad de procesamiento.
  5. Coloque la unidad de procesamiento en posición vertical con la tapa azul hacia arriba y cierre la abrazadera junto a la línea de entrada.
  6. Comience a inyectar el lipoaspirateo conectando la jeringa a la válvula autoooconclusa de la tapa de entrada azul. Mantenga la unidad de procesamiento vertical durante este procedimiento y tire lentamente del émbolo de la jeringa hasta que todo el lipoaspiratoisco se haya transferido a la unidad. Repita el proceso hasta que todo el lipoaspirateo esté dentro de la unidad de procesamiento.
    NOTA: Para la unidad de procesamiento utilizada en el vídeo, añada un máximo de 30 ml de lipoaspiración en ese momento. El procedimiento se puede realizar máximo dos veces, hasta que se hayan procesado 60 ml de lipoaspirate.
  7. Abra la abrazadera de entrada para restaurar el flujo salino.
  8. Agitar vigorosamente la unidad de procesamiento durante 2 minutos al menos, comprobando regularmente el flujo de la solución salina en la bolsa de residuos.
  9. Cuando la solución salina de la unidad de procesamiento se vuelva transparente, después de aproximadamente 2 minutos de agitación, coloque la unidad con la tapa gris hacia arriba y cierre la abrazadera situada en el drenaje cerca de la tapa gris. El tejido procesado flotará en la parte superior.
  10. Llene una jeringa de bloqueo Luer de 10 ml con solución salina y conéctela a la válvula de carga de la tapa azul. Cierre la abrazadera situada cerca de la tapa azul. Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 ml vacía, con el émbolo completamente insertado, a la válvula de la tapa gris.
    NOTA: Utilice únicamente jeringas Luer lock.
  11. Inyecte firmemente la salina en la unidad de procesamiento desde la tapa azul. Asegúrese de que la jeringa conectada a la válvula gris se llene con el tejido procesado. Una vez inyectado toda la salina, retire cuidadosamente ambas jeringas.
  12. Repita los pasos 2.10 y 2.11 hasta que se recoja todo el tejido procesado.
    NOTA: El rendimiento medio de MAT es de 30 ml de 60 ml de lipoaspiración manual. Algunos tejidos permanecerán dentro de la unidad de procesamiento y algunos grumos podrían estar presentes unidos al borde azul dentro de la unidad.
  13. Al final del procesamiento, retire todas las jeringas, cierre todas las abrazaderas, desenganche la bolsa salina y deseche el dispositivo de acuerdo con los protocolos locales.
    NOTA: El dispositivo de procesamiento no se puede volver a utilizar.

3. Inmunohistoquímica de Fluorescencia

  1. Transfiera 300-500 l de MAT a un tubo de 1,5 ml. Añadir 1 mL de 4% de paraformaldehida tamponado (PFA), mezclar suavemente a mano (sin vórtice) y dejar a 4 oC durante la noche (de 16 a 24 h).
  2. Recoger la muestra y transferirla a un tubo limpio de 1,5 ml que contenga 1 ml de PBS. Repita el paso dos veces para eliminar el exceso de PFA.
  3. Transfiera el espécimen en sacarosa del 15% (p/v) en solución de PBS e incubar a 4oC durante la noche (de 16 a 24 h)
  4. Transfiera la muestra en un pozo de una placa de 24 pocillos y añada una solución de incrustación hecha de 15% de sacarosa y 7% de gelatina (p/v) en PBS. Llene el pozo a mitad de camino. Incubar durante 4 h a 37oC.
  5. Transfiera las muestras a 4oC. Después de 2-4 h para que la gelatina se solidifique, llene el pozo con la solución de incrustación y deje a 4oC durante la noche.
  6. Retire las muestras de los pozos. Retire el exceso de compuesto de incrustación y congele en hielo seco. Almacene las muestras a -80 oC.
  7. Cortar secciones de 8-10 m de espesor usando un criostato. Para un seccionamiento óptimo, utilice el criostato a -30 oC. Las diapositivas se pueden almacenar a -80 oC.
  8. Antes de proceder con la inmunofluorescencia, fije las secciones en 4% PFA durante 7 min. Retire el PFA y lave dos veces con PBS tibio (37 oC) para eliminar la gelatina de las secciones.
  9. Bloquee la unión de anticuerpos no específicos incubando los portaobjetos con un 10% de suero de cabra en PBS (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente.
  10. Diluir los anticuerpos primarios en diluyente de anticuerpos o 0,2% (p/v) albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (p/v): ratón antihumano-NG2 (1:100, stock 0,5 mg/ml), conejo antihumano-PDGFR (1:100, stock 0,15 mg/ml).
  11. Retire la solución de bloqueo y agregue los anticuerpos primarios diluidos. Incubar a 4oC durante la noche.
    NOTA: Realice todos los pasos de incubación a partir de ahora en la oscuridad.
  12. Retire los anticuerpos primarios y lávelos 3 veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
  13. Diluir los anticuerpos secundarios en diluyente de anticuerpos o 0,2% (p/v) BSA en PBS: cabra anti-ratón- 555 (1:300), cabra anti-conejo- 647 (1:300). Incubar 1 h a temperatura ambiente.
  14. Retire los anticuerpos secundarios y lávelos tres veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
  15. Si se utiliza una lectina conjugada biotina, utilice el kit de bloqueo de avidina/biotina. Incubar durante 10 minutos con cada reactivo provisto de dos lavados en el medio con PBS.
  16. Repita el paso de bloqueo incubando los portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente con un 10% de suero de cabra en PBS.
  17. Añadir la lectina biotinalada, la lectina biotinilada Ulex europaeus (1:200, stock 2 mg/ml), diluida en 0,2% de BSA (p/v) en PBS o diluyente de anticuerpos. Incubar 1 h y 30 min a temperatura ambiente.
  18. Retire el exceso de lectina biotinada y lave tres veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
  19. Añadir el anticuerpo conjugado de estrupvidina secundario diluido en bSA del 0,2% (p/v) en PBS o diluyente de anticuerpos. Incubar durante 1 h.
  20. Retire el anticuerpo secundario y lávelo tres veces con PBS durante 10 minutos cada vez.
  21. Núcleos de contrastaína con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:500, stock 5 mg/mL), diluido en 0,2% de BSA (p/v) en PBS, durante 10 min a temperatura ambiente.
  22. Retire la solución DAPI y lave dos veces con PBS, 10 min cada vez.
  23. Monte las correderas con un agente de montaje acuoso. Dejar secar por completo, ya sea durante la noche en el banco en la oscuridad o 1 h a 37 oC.
  24. Mantenga las diapositivas a 4 oC en la oscuridad y adquiera imágenes en un microscopio de epifluorescencia.

4. Digestión del tejido adiposo microfragmentado y el aislamiento celular

  1. Transfiera el tejido adiposo microfragmentado a un recipiente estéril.
  2. Recién conforman el medio de digestión disolviendo la colagenasa tipo II en DMEM a la concentración de 1 mg/ml.
  3. Añadir el mismo volumen de medio de digestión al tejido adiposo microfragmentado (es decir, para 30 ml de muestra añadir 30 ml de medio de digestión).
  4. Coloque el recipiente sellado en un baño de agua agitador de 37 oC ajustado a 120 rpm durante 45 minutos. Tenga en cuenta que el recipiente debe permitir un agitado adecuado de la muestra. Si no hay un recipiente grande disponible, utilice dos tubos de 50 ml (30 ml de mezcla de muestra/medio de digestión en cada uno) colocados horizontalmente.
  5. Después de la incubación, bloquee la digestión añadiendo un volumen igual de solución de bloqueo (2% (v/v) FCS/PBS) y filtre secuencialmente a través de coladors de células de 100 y 70 m.
  6. Centrifugar la suspensión filtrada durante 5 min a 200 x g. Descarta el sobrenadante.
  7. Resuspender el pellet en aproximadamente 5 ml de tampón de lisis eritrocitos (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7.65). El volumen de tampón puede variar según la contaminación por eritrocitos observada en el pellet celular. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  8. Agregue un volumen igual de solución de bloqueo y filtre a través de un colador de celdas de 40 m.
  9. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 x g y desechar el sobrenadante.
  10. Resuspenda el pellet en la solución de bloqueo. Mezcle bien pipeteando. Cuente las células viables con exclusión azul de Trypan en un hemocaquítómetro.
    1. Mezcle un volumen igual de la suspensión celular con la mancha azul Trypan. Aspirar 10 l de la solución y colocarla en un hemocitómetro.
    2. Cuente el número de celdas vivas (brillantes y redondas) presentes en al menos 5 cuadrados y obtenga el número de celda medio. Para incluir el factor de dilución de la mancha, multiplique el número medio de células por 2. Para obtener el número total de celdas vivas por 1 ml de muestra, multiplique el número obtenido por 104.
      NOTA: La suspensión de una sola célula obtenida, a saber, la fracción vascular estromal (SVF), se puede sembrar a 20.000 células/cm2 en medio de crecimiento de células perivasculares (DMEM complementado con 20% de FCS inactivado por calor, 1% penicilina/estreptomicina y 1% L-glutamina) o se utiliza para el análisis y clasificación de citometría de flujo. El rendimiento promedio de las células nucleadas en el SVF es de aproximadamente 3 x 104 células por ml de MAT. Los experimentos de clasificación requieren al menos 8 x 105 células para obtener suficientes células perivasculares para el cultivo.

5. Etiquetado y clasificación celular

  1. Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 5 min a 200 x g,y volver a suspender el pellet en medio de bloqueo a una concentración de 1 x 106 células por 100 oL.
  2. Aliquot al menos 50.000 células para el control no manchado y la fluorescencia menos una (FMO) controla en tubos de citometría de flujo inferior redondo de poliestireno. Utilice el resto de las celdas para la tinción multicolor colocando en otro tubo.
    NOTA: Una vez establecidas las configuraciones del experimento (es decir, intensidad del láser, estrategia de gating), el número de células utilizadas para el control no manchado y las FMOs se pueden reducir, si, los anticuerpos utilizados son los mismos.
  3. Agregue los anticuerpos CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) y CD146-BV711 (1:100) a la suspensión de una sola celda para la tinción multicolor. Para los controles FMO, agregue: para los volúmenes equivalentes A FTM V450 de CD34-PE y CD146-BV711 más el control de isotipo V450; para los volúmenes equivalentes de PE FMO de CD31-V450, CD45-V450 y CD146-BV711 más control de isotipo PE; para los volúmenes equivalentes BV711 FMO de CD31-V450, CD45-V450 y CD34-PE más control de isotipo BV711.
  4. Pipetear suavemente, o vórtice lentamente la solución en el tubo para mezclar e incubar los tubos a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.
  5. Preparar cuentas de control de compensación. Añadir 15 l de perlas positivas y 15 l de perlas negativas a 70 l de medio de bloqueo en 3 tubos de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno. Agregue los anticuerpos CD34-PE, CD31-V450 o CD45-V450 y CD146-BV711, uno por tubo.
  6. Pipetear suavemente, o vórtice lentamente, para mezclar los anticuerpos con las perlas e incubar todos los tubos a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.
    NOTA: El procedimiento descrito se puede utilizar para el análisis de citometría de flujo o la clasificación de células.
  7. Preparar los tubos de recogida prehumedeciendo la superficie interna de los tubos con medio de crecimiento endotelial (EGM), dejando aproximadamente 50 s de medio en la parte inferior de cada tubo.
  8. Después de la incubación de anticuerpos, eliminar el exceso de anticuerpos lavando las células y las perlas con 2 ml de medio de bloqueo.
  9. Retire la solución centrifugando los tubos a 200 x g durante 5 min y aspirando cuidadosamente el sobrenadante. Replicar el paso de lavado.
  10. Resuspenda las células en un medio de bloqueo a una concentración final de 1 x 106 células por 250 s. Resuspenda las perlas en 100 s de medio de bloqueo.
  11. Transfiera las células a nuevos tubos de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno con tapa de colador de células. Esto permitirá la interrupción de los grumos celulares.
  12. Transporte todas las suspensiones de células y cuentas a la clasificadora de celdas sobre hielo en la oscuridad.
  13. Ejecute células de control sin mancha para establecer la fluorescencia de fondo y establecer los voltajes.
  14. Ejecute los tubos de control de compensación para establecer la compensación de fluorescencia.
  15. Utilice el área de dispersión hacia delante (FSC-A) vs el área de dispersión lateral (SSC-A) para identificar las celdas, y luego utilice el área de dispersión hacia adelante (FSC-A) frente a la altura de dispersión hacia adelante (FSC-H) para seleccionar celdas individuales.
  16. Agregue DAPI, 1 l de solución de 5 g/ml para cada ml de muestra, al control sin mancha para establecer el gating para las celdas muertas(Figura 2). No es necesario lavarse después de la tinción de DAPI.
  17. Ejecute controles de isotipo para establecer umbrales de fluorescencia en segundo plano relacionados con la unión no específica y establezca el gating.
  18. Ejecute la muestra de tintas multicolor. Excluya las células hematopoyéticas y endoteliales mediante la picadura de células negativas CD31 y CD45. Recoger las poblaciones de pericita (CD146+ CD34-) y de células adventicias (CD146- CD34+) en tubos de recogida (Figura 2).
    NOTA: Los rendimientos celulares óptimos y viables son aproximadamente el 2% de la disociación total de células vivas para los pericitas y el 1,5% para las células adventiales.

6. Cultivo celular

  1. Semillas recién ordenadas perilíticos y células adventicias a una densidad de 30.000 a 40.000 células/cm2 en placas de cultivo recubiertas de gelatina
  2. Para recubrir las placas de cultivo, cubra el área de la placa con gelatina estéril del 0,2% (p/v) en solución de PBS (aproximadamente 100 ml de solución por cm2). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min y retirar la solución. Mantenga las células recién ordenadas en el hielo durante el recubrimiento de la placa de cultivo.
  3. Centrifugar las células recién recolectadas a 200 x g durante 5 min y volver a suspender suavemente el pellet celular en una cantidad adecuada de medio de crecimiento endotelial (EGM). Si el número de células recogidas es muy bajo, evite la centrifugación y placa directamente las células recolectadas.
  4. Sembrar las células en placas recubiertas de gelatina. Incubar a 37oC en 5% CO2.
  5. Una vez que las células se han asentado y se han adherido a la placa (después de al menos 72 h), intercambie EGM con medio de crecimiento de células perivasculares (DMEM complementado con 20% de FCS inactivado por calor, 1% penicilina/estreptomicina y 1% L-glutamina) tanto para pericitas como para células adventitiales.
  6. Una vez que los pericitos y las células adventicias han alcanzado una confluencia del 80%-90%, disocian las células usando 0.05% trypsin-EDTA. Recoger con 5% FCS/PBS, centrifugar a 200 x g durante 5 min, volver a suspender en medio de crecimiento de células perivasculares, y luego pasar las células de 1:3 a 1:5 relación (o en aproximadamente 7,000 células/cm2) en placas de cultivo de poliestireno sin recubrimiento o matraces.

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Resultados

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La disociación mecánica de lipoaspirados manuales dio lugar a la producción de tejido adiposo microfragmentado (MAT), que consiste en un agregado de adipocitos que envuelven una red microvascular(Figura 3). El análisis de inmunofluorescencia de la MAT incrustada en gelatina y criofijada destaca esta estructura, mostrando la red vascular marcada por el receptor Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1) compuesto principalmente por pequeños vasos capilares (

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe el fraccionamiento físico, utilizando un dispositivo de sistema cerrado, de tejido adiposo humano en pequeños grupos que muestran la microanatomía normal del tejido adiposo.

El tejido adiposo subcutáneo humano aspirado manualmente y la solución salina se cargan en un cilindro de plástico transparente que contiene grandes esferas metálicas al estilo pinball que, tras el vigoroso temblor manual del dispositivo, rompen la grasa en submilimetro Fragmentos. Los filtros y la s...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CT es uno de los fundadores de Lipogems.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a Claire Cryer y Fiona Rossi de la Universidad de Edimburgo por su asistencia experta en citometría de flujo. También queremos dar las gracias al personal del hospital Murrayfield que contribuyó proporcionando especímenes de tejido.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la British Heart Foundation y Lipogems, que suministraban kits de procesamiento de tejido adiposo. Las muestras de tejido súbditos humanos se adquirieron con el pleno permiso de ética del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4% Paraformaldehído tamponado (PFA)Productos químicos VWR9317.901
Solución de NaCl al 0,9Baxter3KB7127
AlexaFluor 555 cabra anti-ratón IgG Life TechnologiesA21422
AlexaFluor 647 cabra anti-conejo IgGLife Technologies  A21245
Cloruro de amonioproductos químicos de pesca1158868
diluyente anticuenteLife Technologies3218
Anti-Mouse Ig, κ/Compensación de control negativo (BSA) Plus BDBiosciences560497
Avidina/Kit de bloqueo de biotinaLife Technologies4303
BD LSR Fortessa Citómetro de flujo de 5 láseres& nbsp;BD BiosciencesLáser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) – filtro V450/50 para anticuerpos DAPI y V450; Láser 561nm (amarillo-verde) – filtro YG582/15 para anticuerpos PE; Láser 405 nm (violeta)/375 nm (UV) y ndash; filtro V710/50 para anticuerpos BV711 
Lectina biotinilada Ulex europaeus VectorLaboratoriesVector-B1065
BV711 Ratón IgG1, k Control de isotipoBD Biosciences563044
CD146-BV711BD Biosciences563186
CD31-V450 BDBiosciences561653
CD34-PEBD Biosciences555822
CD45-V450BD Biosciences560367
DAPILife TechnologiesD1306concentración de stock: 5 mg / mL
Cánula de liposucción desechable (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)  Lipogemas suministrado en el kit quirúrgico Lipogems
Diva software 306 (v.6.0)BD Biosciences
glucosa, GlutaMAX sin piruvato de sodioLife Technologies61965026
EGMTM-2 Endotelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTMLonza CC-3156
Suero de becerro fetal (FCS)Sigma-AldrichF2442
FlowJo (v.10.0)FlowJo
Fluoromount GSouthernBiotech0100-01
GelatinaAcros Organics410870025
Lipogems Kit quirúrgicoLipogems LG SK 60
Ratón anti humano- NG2BD Biosciences554275concentración de stock: 0,5 mg/mL
PE Ratón IgG1, κ Control de isotipoBD Biosciences555749
Penicilina-EstreptomicinaSigma-AldrichP4333
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8537
Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con tapón a presión de filtro de celdas BD Biosciences352235, 25/Paquete
Tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mLBD Biosciences352003
Conejo anti humano - PDGFRbAbcam32570concentración de stock: 0,15 mg/mL
Estreptavidina conjugada-488Life Technologies  S32354
SacarosaSigma-Aldrich84100-5kg
Cánula de infiltración tisular (17 G x 185 mm-VG 17/18) Lipogemas suministrado en el kit quirúrgico Lipogems
Tris basefisher chemicalsBP152-500
Tipo-II ColagenasaGibco17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Control de isotiposBD Biosciences560373
Widefield Zeiss observadorZeissObjetivo utilizado: Plan-Apo 20x/0.8
luz LED ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm)ZeissDAPI: UV, excitación 385 nm; 488: Azul, excitación 475 nm;   555: Verde, excitación 555 nm;   647:Rojo, excitación 630 nm 
% DMEM, alto contenido de Zeiss Colibri7 Fuente de

Referencias

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