Vitrificación de gotas a granel para la preservación de hepatocitos primarios

Reinier  J. de Vries; Peony  D. Banik; Sonal Nagpal; Lindong Weng; Sinan Ozer; Thomas  M. van Gulik; Mehmet Toner; Shannon  N. Tessier; Korkut Uygun

doi:10.3791/60250

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Artículo de método

Vitrificación de gotas a granel para la preservación de hepatocitos primarios

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DOI:

10.3791/60250

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25 de octubre de 2019

Reinier J. de Vries¹^,²^,³ , Peony D. Banik¹^,² , Sonal Nagpal¹^,² , Lindong Weng¹^,² , Sinan Ozer¹^,² , Thomas M. van Gulik³ , Mehmet Toner¹^,² , Shannon N. Tessier¹^,² , Korkut Uygun¹^,²

¹Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, ²Shriners Hospitals for Children, Boston, ³Department of Surgery, University of Amsterdam

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un método de criopreservación libre de hielo para grandes cantidades de hepatocitos de rata mediante el cual las células primarias son preincubante con agentes crioprotectores a baja concentración y vitrificadas en grandes gotas.

Resumen

La vitrificación es una alternativa prometedora sin hielo para la criopreservación clásica de muestras biológicas a cámara lenta (a aproximadamente 1 oC/min). La vitrificación requiere tasas de enfriamiento extremadamente rápidas para lograr la transición del agua a la fase de vidrio evitando la formación de hielo perjudicial. Aunque la preincubación con agentes crioprotectores (CPA) puede reducir la tasa de enfriamiento crítico de las muestras biológicas, generalmente se necesitan altas concentraciones para permitir la criopreservación sin hielo por vitrificación. Como resultado, la vitrificación se ve obstaculizada por la toxicidad del CPA y restringida a pequeñas muestras que se pueden enfriar rápidamente. Recientemente se demostró que estas limitaciones inherentes pueden ser superadas por la vitrificación de gotas masivas. Usando este método novedoso, las células se preincuban primero con una baja concentración de CPA intracelular. Aprovechando la deshidratación osmótica rápida, el CPA intracelular se concentra directamente antes de la vitrificación, sin la necesidad de equilibrar completamente las concentraciones tóxicas de CPA. La deshidratación celular se realiza en un dispositivo fluido e integrado con una generación continua de alto rendimiento de gotas de gran tamaño que se vitrifican en nitrógeno líquido. Este método de criopreservación sin hielo con una toxicidad mínima de CPA es adecuado para grandes cantidades de células y resulta en una mayor viabilidad de los hepatocitos y la función metabólica en comparación con la criopreservación clásica de congelación lenta. Este manuscrito describe los métodos para la vitrificación exitosa de gotas masivas en detalle.

Introducción

La pérdida de viabilidad celular y la función metabólica después de la criopreservación de hepatocitos sigue siendo un problema importante que limita las aplicaciones clínicas¹^,²^,³. El método de referencia de criopreservación de hepatocitos es la congelación lenta, que se realiza preincubando los hepatocitos con CPA (dimetil sulfóxido [DMSO], glucosa y albúmina) y posterior congelación de la velocidad controlada (aproximadamente 1 oC/min) a temperaturas criogénicas⁴^,⁵. A pesar de muchas optimizaciones reportadas, la t....