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Artículo de método

Vitrificación de gotas a granel para la preservación de hepatocitos primarios

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DOI:

10.3791/60250

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25 de octubre de 2019

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1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un método de criopreservación libre de hielo para grandes cantidades de hepatocitos de rata mediante el cual las células primarias son preincubante con agentes crioprotectores a baja concentración y vitrificadas en grandes gotas.

Resumen

La vitrificación es una alternativa prometedora sin hielo para la criopreservación clásica de muestras biológicas a cámara lenta (a aproximadamente 1 oC/min). La vitrificación requiere tasas de enfriamiento extremadamente rápidas para lograr la transición del agua a la fase de vidrio evitando la formación de hielo perjudicial. Aunque la preincubación con agentes crioprotectores (CPA) puede reducir la tasa de enfriamiento crítico de las muestras biológicas, generalmente se necesitan altas concentraciones para permitir la criopreservación sin hielo por vitrificación. Como resultado, la vitrificación se ve obstaculizada por la toxicidad del CPA y restringida a pequeñas muestras que se pueden enfriar rápidamente. Recientemente se demostró que estas limitaciones inherentes pueden ser superadas por la vitrificación de gotas masivas. Usando este método novedoso, las células se preincuban primero con una baja concentración de CPA intracelular. Aprovechando la deshidratación osmótica rápida, el CPA intracelular se concentra directamente antes de la vitrificación, sin la necesidad de equilibrar completamente las concentraciones tóxicas de CPA. La deshidratación celular se realiza en un dispositivo fluido e integrado con una generación continua de alto rendimiento de gotas de gran tamaño que se vitrifican en nitrógeno líquido. Este método de criopreservación sin hielo con una toxicidad mínima de CPA es adecuado para grandes cantidades de células y resulta en una mayor viabilidad de los hepatocitos y la función metabólica en comparación con la criopreservación clásica de congelación lenta. Este manuscrito describe los métodos para la vitrificación exitosa de gotas masivas en detalle.

Introducción

La pérdida de viabilidad celular y la función metabólica después de la criopreservación de hepatocitos sigue siendo un problema importante que limita las aplicaciones clínicas1,2,3. El método de referencia de criopreservación de hepatocitos es la congelación lenta, que se realiza preincubando los hepatocitos con CPA (dimetil sulfóxido [DMSO], glucosa y albúmina) y posterior congelación de la velocidad controlada (aproximadamente 1 oC/min) a temperaturas criogénicas4,5. A pesar de muchas optimizaciones reportadas, la toxicidad de CPA junto con los desequilibrios osmóticos perjudiciales durante la congelación y el estrés mecánico de la formación de hielo siguen siendo inconvenientes fundamentales de la congelación lenta6,7.

La vitrificación ofrece una ventaja sobre la congelación lenta en que la lesión debido a la formación de hielo se evita por completo por una transición de fase directa del agua al estado de vidrio6. Sin embargo, para alcanzar la temperatura de transición del vidrio del agua pura (-137 oC), el agua debe enfriarse a velocidades del orden de un millón de grados centígrados por segundo (es decir, la tasa de enfriamiento crítico) para evitar la formación de hielo por encima de la temperatura de transición del vidrio8 . La adición de CPAs puede reducir la tasa de enfriamiento crítico y aumentar la temperatura de transición del vidrio de las soluciones acuosas9. Sin embargo, incluso con altas concentraciones de CPA (por ejemplo, 40% v/v DMSO o superior) se requieren, no obstante, tasas de refrigeración rápida para la vitrificación exitosa8,9.

Las tasas de enfriamiento requeridas y las altas concentraciones de CPA dan lugar a dos grandes inconvenientes de la vitrificación. En primer lugar, para permitir un enfriamiento rápido, las muestras deben tener una masa térmica baja. En segundo lugar, para alcanzar altas concentraciones de CPA evitando lesiones osmóticas, los CPA deben introducirse lentamente y equilibrarse completamente entre los compartimentos intra yextracelulares 6. Esto aumenta el tiempo de exposición de las células a los CPA tóxicos. Juntos, esto hace que la vitrificación sea un proceso engorroso que se limita a unas pocas muestras de pequeño tamaño (microlitros) a la vez. La vitrificación de gotas se ha propuesto como una solución potencial a estas restricciones. Al exponer las gotas minúsculas de carga celular (nanolitros) al nitrógeno líquido, la tasa de enfriamiento se incrementa significativamente, lo que permite una reducción considerable de la concentración de CPA10,11,12 ,13,14. Aunque múltiples boquillas generadoras de gotas de alta frecuencia podrían utilizarse potencialmente simultáneamente, el tamaño de las gotas extremadamente pequeña limita el rendimiento a microlitros por minuto10,lo que impide la vitrificación eficiente de células grandes volúmenes con magnitudes mayores tasas de procesamiento en el orden de mililitros por minuto.

Recientemente se demostró que estas limitaciones inherentes de la vitrificación pueden ser superadas por la vitrificación de gotas masivas15. Este novedoso método aprovecha la deshidratación osmótica rápida para concentrar una concentración intracelular de CPA del 7,5% v/v de etilenglicol y DMSO inmediatamente anterior a la vitrificación, eliminando la necesidad de un equilibrio completo de las concentraciones tóxicas de CPA. La deshidratación celular se realiza en un dispositivo fluido mediante una breve exposición de los hepatocitos a una alta concentración de CPA extracelular. Aunque esta exposición causa deshidratación osmótica rápida, es demasiado corta para que la alta concentración de CPA se difunda en las células. Inmediatamente después de la deshidratación, las células se cargan en gotas que se vitrifican directamente en nitrógeno líquido. Este método elimina la necesidad de una aceptación intracelular completa de altas concentraciones de CPA, mientras que la alta concentración de CPA extracelular permite la vitrificación de gotas de gran tamaño, lo que resulta en volúmenes de alto rendimiento con una toxicidad mínima de CPA.

La vitrificación de gotas mejora la viabilidad directa y a largo plazo después de la preservación, así como la morfología y la función metabólica de los hepatocitos primarios de ratas en comparación con la criopreservación clásica por congelación lenta15. Este manuscrito proporciona los detalles metodológicos para la vitrificación de gotas a granel de hepatocitos de ratas primarias.

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Protocolo

Los principales aislamientos de hepatocitos para este protocolo fueron realizados por el Núcleo de Recursos Celulares (CRC) en el Hospital General de Massachusetts, Boston, Massachusetts, EE. UU. El protocolo animal (#2011N000111) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts.

1. Vitrificación de gotas a granel

  1. Preparar las soluciones de vitrificación.
    1. Añadir 40 mg de albúmina sérica bovina (BSA) a 17,0 ml de la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) para hacer la solución de vitrificación 1 (V1). Filtrar estérilmente la solución V1 utilizando un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
      NOTA: UW es una solución de conservación de órganos de uso común. Contiene 50 g/L de almidón de hidroxietilo, 35.83 g/L de ácido lactobiónico, fosfato de potasio 3,4 g/L monobásico, 1,23 g/L de sulfato de magnesio heptahidrato, 17,83 g/L de rafinensa pentahidrato, 1,34 g/L de adenosina, 0,136 g/L de alopurinol, 0,992 g/L glutatión total, 5,61 g /L hidróxido de potasio e hidróxido de sodio para ajustar el pH a 7.4.
    2. Combinar 7,0 ml de UW, 6,5 ml de DMSO, 6,5 ml de etilenglicol (EG), 40 mg de BSA y 5,48 g de sacarosa para hacer la solución de vitrificación 2 (V2). Filtrar estérilmente la solución V2 utilizando un filtro de 0,22 m. Cargue 3,5 ml de solución estéril filtrada V2 en una jeringa de 3 ml y guárdela a 4 oC.
      NOTA: Para facilitar la disolución de los CPA, las soluciones se preparan en cantidades mayores de las requeridas.
  2. Prepare el aparato de vitrificación de gotas a granel.
    1. Para preparar la aguja de mezcla, primero corte a lo largo de un lado de la manga gris exterior de la aguja de mezcla, y luego doble el manguito abierto para retirarlo de la aguja de mezcla.
    2. Deslice dos secciones de tubos de silicona de 25 mm sobre las entradas de la aguja de mezcla y fije su posición con pegamento(Figura 1A).
    3. Corte la aguja a una longitud de 20 mm (es decir, la longitud de la hélice de mezcla interna) como se muestra en la Figura 1A.
      NOTA: La longitud de la aguja de mezcla es proporcional al volumen dentro de la aguja y por lo tanto se puede modificar para controlar el tiempo de exposición de los hepatocitos a la solución de alta concentración de CPA.
    4. Inserte la salida de corte de la aguja de mezcla en una aguja de inyección de 20 G(Figura 1B).
      NOTA: El tamaño de la aguja de inyección influye en el tamaño de las gotas.
    5. Esterilice el conjunto de la aguja de mezcla mediante autoclave.
    6. Llene un Dewar estéril con nitrógeno líquido. Esterilice el exterior de la Dewar con isopropanol antes de colocar el Dewar en una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril.
      NOTA: La contaminación es una consideración importante durante la exposición directa de las gotas al nitrógeno líquido. Aunque no hubo contaminación utilizando nitrógeno líquido no esterilizado en el protocolo actual, el nitrógeno líquido se puede filtrar o irradiar para asegurar la esterilidad si es necesario16.
    7. Inserte un embudo con el mismo diámetro exterior que el diámetro interior del nitrógeno líquido Dewar en un tubo cónico de 50 ml para crear el dispositivo de recogida de gotas(Figura 1CaE).
    8. Sumerja el dispositivo de recogida de gotas en el nitrógeno líquido presionando lentamente hacia abajo en su posición vertical final utilizando fórceps grandes. Asegúrese de que el tubo cónico descansa en una posición vertical en la parte inferior de la Dewar(Figura 1DaE).
      NOTA: El embudo debe permanecer insertado y descansando sobre el tubo cónico. El nivel de nitrógeno líquido debe ser 1 cm por debajo de la altura de entrada del embudo, como se muestra en la Figura 1D.
    9. Monte una bomba de jeringa en una posición vertical en la pared de la campana de cultivo celular atando una cuerda de los pies de la bomba de la jeringa a tornillos que sobresoren de la pared de la campana de cultivo celular.
    10. Coloque el nitrógeno líquido Dewar con el dispositivo de recogida de gotas debajo de la bomba de jeringa montada verticalmente(Figura 1E).
  3. Preincubar con CPAs.
    1. Después de obtener hepatocitos de rata recién aislados, cuente la concentración de stock por exclusión azul Trypan y tome 40 millones de hepatocitos viables.
      NOTA: El manejo suave de los hepatocitos en suspensión es fundamental para prevenir la muerte celular.
    2. Centrífuga a 50 x g durante 5 min sin freno.
    3. Aspirar el sobrenadante y resuspender los hepatocitos en 3,4 ml de solución V1.
    4. Incubar sobre hielo durante 3 min.
    5. Añadir 150 s de DMSO y 150 l de EG a los hepatocitos y mezclar suavemente.
    6. Incubar sobre hielo durante 3 min.
    7. Una vez más, añadir 150 s de DMSO y 150 l de EG a los hepatocitos y mezclar suavemente.
    8. Cargue 3,5 ml en una jeringa de 3 ml.
  4. Realizar vitrificación.
    1. Inserte la jeringa con hepatocitos preincubados y las jeringas de solución V2 en el adaptador de la bomba de jeringa.
    2. Coloque dos adaptadores de púas de la manguera de bloqueo Luer hembra a las jeringas y deslice el tubo de silicona del conjunto de la aguja de mezcla sobre los accesorios de la barba(Figura 1F).
    3. Coloque todo el conjunto en la bomba de la jeringa(Figura 1E).
    4. Tres minutos después de la última adición de DMSO y EG a los hepatocitos, iniciar la bomba a 2 ml/min.
    5. Detenga la bomba después de que todos los hepatocitos se hayan añadido al nitrógeno líquido.

2. Almacenamiento criogénico

  1. Perforar 10 pequeños agujeros en la tapa de un tubo cónico de 50 ml con una aguja de 20 G y envolver el exterior de la tapa con una película flexible, como se muestra en la Figura 1B. Esto crea una válvula que permite el escape del nitrógeno líquido sobrante evaporante.
  2. Para recoger las gotas de hepatocitos vitrificados, primero retire el embudo del nitrógeno líquido Dewar. A continuación, utilice fórceps largos para extraer el tubo cónico que contiene las gotas del nitrógeno líquido y verter lentamente el exceso de nitrógeno líquido del tubo cónico.
  3. Cierre el tubo cónico con la tapa perforada y coloque directamente el tubo cónico cerrado con gotas de hepatocitos vitrificados de nuevo en el nitrógeno líquido Dewar.
  4. Transfiera el tubo cónico del nitrógeno líquido a un criotanque de vapor de nitrógeno líquido.

3. Recalentamiento de las gotas de hepatocitos vitrificados

  1. Prepare la solución de recalentamiento.
    1. Disolver 17,13 g de sacarosa en 100 ml de medios de cultivo de hepatocitos DMEM para crear la solución de recalentamiento. Filtrar estérilmente la solución de recalentamiento utilizando un filtro de 0,22 m y calentar a 37 oC.
  2. Recalienta los hepatocitos.
    1. Tome el tubo cónico con hepatocitos vitrificados del criotanque y transporte en un dewar de nitrógeno líquido a la campana de cultivo celular.
    2. Afloje ligeramente la tapa y vuelva a colocar el tubo cónico en el nitrógeno líquido.
    3. Agregue las gotas de hepatocitos vitrificados a un vaso vacío, agregue instantáneamente la solución de recalentamiento caliente (37 oC) e revuelva inmediatamente durante 10 s.
      NOTA: Es fundamental trabajar rápidamente para evitar la congelación durante elrecalentamiento. Dependiendo de los requisitos del estudio, algunas gotas vitrificadas se pueden recalentar a la vez.
  3. Descargue la solución de recalentamiento.
    1. Divida la solución de recalentamiento con hepatocitos en dos tubos cónicos de 50 ml.
    2. Centrifugar los dos tubos cónicos durante 2 min a 100 x g a 4oC sin freno.
    3. Aspirar el sobrenadante para dejar un volumen total de 12,5 ml utilizando la marca de graduación del tubo cónico como referencia y añadir 12,5 ml de DMEM helado por tubo cónico para diluir la solución de recalentamiento al 50%.
    4. Resuspenda los hepatocitos e incuba rinde sobre hielo durante 3 min.
    5. Añadir 25 ml de DMEM frío por metro cónico para diluir la solución de recalentamiento al 25%.
    6. Centrífuga durante 5 min a 50 x g a 4oC sin freno.
    7. Aspirar el sobrenadante y resuspender los hepatocitos en 2 ml del medio de cultivo deseado para su uso.
      NOTA: La centrifugación de gradiente de densidad se puede utilizar para eliminar los hepatocitos muertos de la suspensión celular si se desea.

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Resultados

Los hepatocitos primarios recién aislados de cinco hígados de rata diferentes se utilizaron para una comparación directa de la vitrificación de gotas a granel con la criopreservación clásica utilizando los protocolos preeminentes de congelación lenta reportados en la literatura4, 5. En resumen, los hepatocitos fueron suspendidos en UW complementados con BSA (2,2 mg/ml), glucosa (333 mM) y DMSO (10% v/v) y congelados utilizando un congelador de velocidad controla...

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Discusión

La criopreservación de hepatocitos por congelación lenta da como resultado una menor viabilidad y función metabólica. La vitrificación ofrece una alternativa prometedora para la criopreservación clásica, ya que la lesión por congelación se evita por completo9. Sin embargo, se requiere la preincubación con CPAs para reducir la velocidad de enfriamiento crítica8. En consecuencia, la vitrificación se ve obstaculizada por la toxicidad del CPA17 y limitad...

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Divulgaciones

Los autores declaran intereses financieros en competencia. Los Doctores de Vries, Weng, Toner, Tessier y Uygun tienen solicitudes provisionales de patente pertinentes para este estudio. El Dr. Uygun tiene un interés financiero en Organ Solutions, una empresa enfocada en el desarrollo de tecnología de preservación de órganos. Todos los intereses del investigador son administrados por MGH y Partners HealthCare de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses.

Agradecimientos

La financiación de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01DK096075, R01DK107875 y R01DK114506) y del Departamento de Defensa de los Estados Unidos (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) es muy reconocida.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BD Jeringas desechables de 3 mL con puntas Luer-LokFisher Scientific14-823-435
Vaso de precipitadosSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW Solución de almacenamiento en fríoBridge to LifeBUW-001
Albúmina de suero bovinoSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer Luer femenino a 1/16" de perfil bajo Lengüeta de tubo semirrígido, PPCole-ParmerEW-45508-12
Tanque de estrobo criogénico / CryotankChart IndustriesMVE 800
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
DMEM, polvo, alta glucosa, piruvatoLife Technologies12800-082
EtilenglicolSigma-Aldrich107-21-1
PinzasextralargasFisher Scientific10-316C
Fisherbrand Tubos de centrífuga de plástico de lectura fácil de alta velocidad - Cierre superior planoFisher Scientific06-443-18
Hilo de pescarStrenSOFS4-15
Nitrógeno líquidoAirgas7727-37-9
Masterflex L/S Tubo de silicona curado con platino, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14
Puntas de mezcla, para usar con 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene Embudo de polvo de polipropilenoThermoFisher4252-0100
Aguja 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - Película flexibleSigma-AldrichP7793-1EA
Hoja de afeitarFisher Scientific12-640
EspátulaCole-ParmerEW-06369-18  Filtro estéril
SteriflipFisher ScientificSE1M179M6
Sacarosa (Cristalino/Certificado ACS)BombaFisher Scientific S5-500
NewEra Pump Systems Inc.NE-1000
Contenedor de nitrógeno líquido de sobremesa Thermo-FlaskThermoFisher2122
de jeringa

Referencias

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