Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.
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Artículo de método
Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos
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Resumen
Resumen
La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Hay un sorprendente grado de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común. Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnoliformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y comunicarse, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo, los sistemas y circuitos de neurociencia, fisiología celular, ecología, biología evolutiva y comportamiento. Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos para los peces eléctricos. El uso de estos recursos ya ha facilitado importantes conocimientos con respecto a la conexión entre el genotipo y el fenotipo en estas especies. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales. Aquí informamos de un protocolo completo para la realización de mutagénesis CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos endógenos de reparación del ADN en peces débilmente eléctricos. Demostramos que este protocolo es igualmente eficaz tanto en la especie mormyrid Brienomyrus brachyistius como en el gymnotiform Brachyhypopomus gauderio mediante el uso de CRISPR/Cas9 para apuntar a indels y mutaciones puntuales en el primer exón de la canal de sodio scn4aa. Utilizando este protocolo, se obtuvieron embriones de ambas especies y se genotiparon para confirmar que las mutaciones pronosticadas en el primer exón del canal de sodio scn4aa estaban presentes. El fenotipo de éxito de knock-out se confirmó con grabaciones que muestran amplitudes de descarga de órganos eléctricos reducidas en comparación con los controles de tamaño no inyectados.
Introducción
La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común1,2,3.
Esto es quizás mejor ejem....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.
1. Selección de objetivos sgRNA
NOTA: Se proporciona un protocolo para el diseño manual de los sgRNA en el paso 1.1. Esto se utilizó para la selección de objetivos scn4aa. Se proporciona un protocolo adicional para facilitar este proceso (paso 1.2) utilizando el portal web EFISHGENOMICS. Se recomienda que los usuarios seleccionen el protocolo 1.2, que cuenta con varias "comprobaciones" automatizadas para garantizar el éxito en el diseño....
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Resultados
Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.
Los pece.......
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Discusión
La riqueza fenotípica de los peces débilmente eléctricos, junto con una reciente proliferación de recursos genómicos, motiva una fuerte necesidad de herramientas genómicas funcionales en el modelo de peces débilmente eléctricos. Este sistema es particularmente atractivo debido a la evolución convergente de numerosos rasgos fenotípicos en linajes paralelos de peces, que se mantienen fácilmente en el laboratorio.
El protocolo descrito aquí demuestra la eficacia de la técnica CRISPR/Cas9 en linaj.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen los heroicos esfuerzos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud y Hope Healey por su ayuda con la cría de peces, la recopilación de datos y el desarrollo temprano del protocolo. También nos gustaría dar las gracias a los tres críticos por sus sugerencias al manuscrito. Creemos que el producto final es de mejor calidad después de abordar sus comentarios. Este trabajo fue financiado por el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias #1644965 y #1455405 a JRG, y la DG del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería a VLS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20 mg/mL Glucógeno de grado de ARN | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 pb Escalera de ADN | NEB | N3236L | |
| Capilar de vidrio de borosilicato con filamento | Instrumento | Sutter BF100-58-10 | (D.O. 1,0 mm, D.I. 0,58 mm, 10 cm de longitud |
| )Proteína Cas9 con NLS; 1 mg/mL | PNA Biología | CP01 | |
| Dneasy Blood & Kit de tisú | Qiagen | 69506 | |
| Microinyector Eppendorf FemptoJet 4i | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microcargador Puntas de pipeta | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton jeringa | Fisher Scientific | 14-824-654 | denominada "jeringa de vidrio de precisión" en el protocolo |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | denominado "toallita de tareas delicadas" en el protocolo |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | utilizado para el ensayo de escisión in vitro |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | denominado "agente de desove" en el protocolo |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | denominado "termoplástico" en el protocolo |
| Extractor de pipetas | WPI | SU-P97 | marca |
| sutter QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Aguja reutilizable- requiere personalización | Fisher Scientific | 7803-02 | Personalice a 0.7 pulgadas de largo; estilo de punto 4 y ángulo 25 |
| T4 ADN polimerasa | NEB | M0203L | Uso con el tampón NEB 10x que se incluye |
| Herramientas recubiertas de teflón | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | denominado "politetrafluoroeteno" en el protocolo |
Referencias
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
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Reimpresiones y permisos
