Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común^1,2,3.

Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnotiformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies, que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y^{comunicarse 4}, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo^{1,5 ,6}, sistemas y circuitos neurociencia^7,8,9,10, fisiología celular^11,12, ecología y energía^{13 ,14,15,16,17}, comportamiento^18,19, y macroevolución^3,20,21 .

Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos, transcriptomicos y proteómicos para peces eléctricos^{1,22,23,24,25,26, 27,28}. El uso de estos recursos ya ha producido importantes perspectivas sobre la conexión entre genotipo y fenotipo en estas especies^{1,2,3,28,29 ,30}. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales³¹.

Una de estas herramientas es la técnica de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas recientemente desarrolladas junto con la técnica de endonucleasa Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición del genoma que ha entrado en uso generalizado tanto en los modelos^32,33,34 y organismos no modelo^35,36,37 por igual. La tecnología CRISPR/Cas9 ha progresado hasta un punto en el que un laboratorio capaz de la biología molecular básica puede generar fácilmente sondas específicas genéticas llamadas ARN de guía corta (SgRNAs), a un bajo costo utilizando un método de no clonación^38. CRISPR tiene ventajas sobre otras estrategias de derribo/desaqueo, como morpholinos^39,40, nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALENs), y nucleasas de dedos de zinc (ZFN), que son costosas y tiempo para generar para cada gen objetivo.

El sistema CRISPR/Cas9 funciona para crear nocauts genéticos apuntando a una región específica del genoma, dirigida por la secuencia sgRNA, y causando una rotura de doble cadena. La rotura de doble cadena es detectada por la célula y desencadena mecanismos endógenos de reparación del ADN preferentemente utilizando la vía de unión final no homóloga (NHEJ). Esta vía es altamente propensa a errores: durante el proceso de reparación, la molécula de ADN a menudo incorporará inserciones o deleciones (indels) en el sitio de rotura de doble cadena. Estos indels pueden resultar en una pérdida de la función debido a (1) cambios en el marco de lectura abierto, (2) inserción de un codón de parada prematura, o (3) cambios en la estructura primaria crítica del producto genético. En este protocolo, utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para apuntar mutaciones puntuales en genes diana utilizando el NHEJ en especies de peces débilmente eléctricos. Si bien es más simple y eficiente que otras técnicas, se espera que este método de mutagénesis resulte en una serie de severidades fenotípicas en F_0,que se atribuye al mosaico genético^{41,42,43 ,44}.

Selección de organismos
Con el fin de facilitar futuros estudios sobre la genómica comparativa de los peces débilmente eléctricos, es necesario seleccionar una especie representativa tanto para gimnotiformes como mormyrids para el desarrollo de protocolos. Después de las discusiones durante la reunión de Pescado Eléctrico de 2016 en Montevideo, Uruguay, hubo consenso de la comunidad para utilizar especies que ya podían ser criadas en el laboratorio y que tenían recursos genómicos disponibles. El gymnotiform Brachyhypopomus gauderio y el mormyrid Brienomyrus brachyistius fueron seleccionados como especies que se ajustan a estos criterios. En ambas especies, las señales naturales para inducir y mantener las condiciones de reproducción son fáciles de imitar en cautiverio. B. gauderio,una especie gimnoiforme de América del Sur, tiene la ventaja de bajos requisitos de cría: los peces se pueden mantener a una densidad relativamente alta en tanques relativamente pequeños (4 L). B. gauderio también tiene una rápida rotación generacional en condiciones cautivas. En condiciones de laboratorio, B. gauderio puede desarrollarse de huevo a adulto en aproximadamente 4 meses.

B. brachyistius, una especie de pez mormirid de Africa Occidental-Central, se reproduce fácilmente en cautiverio. B. brachyistius está fácilmente disponible a través del comercio de acuarios, ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios, y ahora tiene una serie de recursos genómicos disponibles. Su ciclo de vida abarca entre 1 y 3 años, dependiendo de las condiciones de laboratorio. Los requisitos de cría son algo más intensivos para esta especie, requiriendo tanques de tamaño moderado (50-100 L) debido a su agresión durante la reproducción.

Los laboratorios que estudian otras especies de peces eléctricos deben ser capaces de adaptar fácilmente este protocolo siempre y cuando la especie pueda ser criada, y los embriones de una sola célula pueden ser recogidos y criados en la edad adulta. Las tasas de vivienda, cría larvaria y fertilización in vitro (FIV) probablemente cambiarán con otras especies; sin embargo, este protocolo puede ser utilizado como punto de partida para los intentos de cría en otros peces débilmente eléctricos.

Un objetivo gene ideal para la prueba de concepto: scn4aa
Los peces mormyrid y gimnotiformo débilmente eléctricos generan campos eléctricos (electrogénesis) mediante la descarga de un órgano especializado, llamado órgano eléctrico. Las descargas de órganos eléctricos (EOD) son el resultado de la producción simultánea de potenciales de acción en las células de órganos eléctricos llamadas electrocitos. Los EOD son detectados por una serie de electrorreceptores en la piel para crear imágenes eléctricas de alta resolución del entorno de los peces^45. Los peces débilmente eléctricos también son capaces de detectar características de las formas de onda EOD de sus conespecíficos^18, así como sus velocidades de descarga^46,lo que permite que los EODfunciones funcionen adicionalmente como una señal de comunicación social análoga al canto de los pájaros o ranas vocalizaciones⁴⁷.

Un componente principal de la generación de potencial de acción en los electrocitos de peces débilmente eléctricos mormyrid y gymnotiform es el canal de sodio cerrado por tensión NaV1.4². Los teleosts no eléctricos expresan dos copias genéticas yólo, scn4aa y scn4ab,codificación para el canal de sodio cerrado con tensión NaV1.4³⁰. Tanto en los linajes de peces gimnotiformos como mormyrid débilmente eléctricos, scn4aa ha evolucionado rápidamente y ha sufrido numerosas sustituciones de aminoácidos que afectan a sus propiedades cinéticas^48. Lo más importante es que la scn4aa se ha compartimentado en ambos linajes del órgano eléctrico^2,3. La expresión relativamente restringida de scn4aa al órgano eléctrico, así como su papel clave en la generación de EODs, lo convierten en un objetivo ideal para los experimentos knockout de CRISPR/Cas9, ya que tiene efectos pleiotrópicos mínimamente nocivos. Debido a que los peces débilmente eléctricos comienzan a descargar sus órganos eléctricos larvales de 6 a 8 días después de la fertilización (DPF), la focalización de scn4aa es ideal para el fenotipado rápido después de la microinyección de embriones.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Selección de objetivos sgRNA

NOTA: Se proporciona un protocolo para el diseño manual de los sgRNA en el paso 1.1. Esto se utilizó para la selección de objetivos scn4aa. Se proporciona un protocolo adicional para facilitar este proceso (paso 1.2) utilizando el portal web EFISHGENOMICS. Se recomienda que los usuarios seleccionen el protocolo 1.2, que cuenta con varias "comprobaciones" automatizadas para garantizar el éxito en el diseño de sgRNA para destinos personalizados.

1. Diseñe objetivos sgRNA.
   1. Para generar oligos guía de sgRNA, es mejor apuntar exón 1, u otros exons de 5'. El UTR de 5' puede ser dirigido; sin embargo, es mejor apuntar a la secuencia de codificación de 5'. El uso de información genómica es preferible, pero es posible desarrollar sgRNA exitosos utilizando datos de transcriptoma. Es preferible anotaciones de límites intron/exón (datos genómicos) o límites de exón/exón.
   2. Las secuencias genómicas candidatas de 1.1 se buscan secuencias de destino putativas que coincidan con el patrón 5'-N(18)-NGG-3'. Esto se puede realizar automáticamente mediante software de análisis de secuencia de escritorio, scripts personalizados o mediante la inspección manual de secuencias.
   3. Las secuencias se pueden priorizar utilizando el método de Doench et al.⁴⁹ para la actividad en el destino. Además, las secuencias de destino se pueden evaluar mediante una búsqueda BLAST en bases de datos genómicas/transcriptomicas para el enlace fuera de destino.
   4. Asegúrese de que se pueden generar imprimaciones PCR estándar que flanqueen la secuencia de destino. Los imprimadores deben ser al menos 20 bp desde cualquier lado del sitio de corte (tres bases aguas arriba de la secuencia NGG). Idealmente, el producto PCR debe ser de 150 a 200 pares de bases (bp).
   5. Los oligómeros de diseño que cumplen los criterios anteriores utilizando la siguiente plantilla, que incluye un promotor T7 (5' de N₁₈) y una región complementaria (3' de N₁₈) para recocido al oligómero constante (1.1.6): 5'-TAATACGACTCACTAG-N₁₈ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
      NOTA: La secuencia N₁₈ no incluye la secuencia de motivos adyacentes del protoespaciador NGG (PAM). No incluya esto en el oligómero.
   6. Ordenar el oligómero constante(Tabla 1) que se utilizará para sintetizar todos los sgRNA, oligómeros para objetivos sgRNA (paso 1.1.5) y imprimaciones PCR (paso 1.1.4) como oligómeros desalados estándar de un servicio de producción de oligonucleótidos. Los oligómeros y imprimadores PCR se pueden pedir como oligómeros desalados estándar, no es necesaria ninguna purificación adicional.
2. Realizar el diseño automatizado de los objetivos sgRNA.
   1. Con datos genómicos, seleccione un gen objetivo. Los datos de transcriptoma podrían utilizarse en su lugar cuando se conocen los límites de exón/intron. Los objetivos se pueden identificar mediante el portal EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). El objetivo ideal estará dentro del exón 1; sin embargo, otros 5' exons y el 5' UTR pueden ser considerados.
   2. Una vez identificada la secuencia de destino, cargue la herramienta web EFISHGENOMICS CRISPR (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/) disponible libremente. Esta herramienta web utiliza una versión personalizada del algoritmo CRISPOR para la generación de destino^50,51.
   3. En el cuadro del paso 1, escriba el nombre de la secuencia e introduzca la secuencia del destino en el cuadro adecuado.
3. Seleccione el genoma adecuado del que deriva la secuencia. Actualmente, los datos genómicos están disponibles para B. brachyistius y B. gauderio. Las secuencias del genoma no son necesarias para el uso de esta herramienta, pero son útiles para evaluar posibles efectos no deseados fuera del objetivo.
4. Seleccione el PAM adecuado. Se recomienda el PAM de 20 bp-NGG, aunque hay varios motivos PAM adicionales para elegir, dependiendo de la proteína Cas9 utilizada.
5. Se generará un informe con la ubicación de la secuencia de destino en el genoma con secuencias de guía sugeridas. Seleccione tres objetivos con efectos fuera de destino predichos bajos, puntuaciones de especificidad altas y puntuaciones de alta eficiencia. Las secuencias de guía de puntuación más altas se resaltan con verde en el lado izquierdo. Si es posible, se deben evitar las secuencias de guía resaltadas en amarillo y rojo.
6. Al hacer clic en las secuencias de destino seleccionadas se genera un informe CRISPOR completo. La información clave de estos informes es para "expresión in vitro T7 a partir de oligonucleótidos superpuestos". De este informe, extraiga la siguiente información: oligos de sgRNA recomendado, imprimaciones de PCR para el sitio de destino y un oligómero constante que se utilizará para sintetizar todos los sgRNAs.
7. Solicite los oligómeros seleccionados (paso 1.6) de un servicio de producción de oligonucleótidos. Los oligómeros y imprimadores PCR se pueden pedir como oligómeros desalados estándar, no es necesaria ninguna purificación adicional.

2. Generar sgRNA

1. Oligómeros anales en el tubo pcR: añadir 1 l de oligómero constante de 100 m, 1 l de oligómero específico de ARNs de 100 M y 8 ml de H₂O libre de nucleasas
2. Los oligómeros anales en un termociclador con el siguiente programa: se calientan a 95 oC durante 5 min, se enfrían a 85 oC a -2 oC/s, se enfrían a 25 oC a 0,1 oC/s y se mantengan a 4 oC.
3. Para generar una plantilla de SgRNA, agregue 2,5 l de mezcla dNTP (10 mM), 2 ml de tampón de 10x, 0,5 ml de polimerasa de ADN T4 y 5 ml de H₂O libre de nucleasas a los oligómeros recocidos del paso 2.2. Incubar durante 20 min a 12oC.
4. Purifique la plantilla utilizando una columna de limpieza de PCR según las instrucciones del fabricante.
5. Elute en 20–30 l. Utilice un espectrofotómetro para estimar la concentración y la pureza. La plantilla debe ser de 100–200 ng/L y 1,8–1,9 A_260/280.
6. Verifique a través de un gel de agarosa ejecutando de 1 a 5 ml. La banda dominante debe ser 120 bp. Vea la Figura 1A para los resultados representativos.
7. Almacene la plantilla de sgRNA verificada por gel a -20 oC (largo plazo) o a 4 oC (a corto plazo, 1-4 semanas).
8. Transcribir sgRNA utilizando el kit de transcripción de ARN T7 añadiendo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a temperatura ambiente 8 l de mezcla dNTP (volúmenes iguales de dA, dT, dG, dC), 2 l de tampón de 10x (temperatura ambiente), 2 l de polimerasa de ARN T7, 100 a 200 ng de plantilla de sgRNA , y sin nucleasas H₂O a un volumen total de 20 L. Gire para recoger en la parte inferior. Incubar durante 2-4 h a 37oC.
9. Añadir 1 l de DNase e incubar 15 min adicionales a 37 oC.
   1. Limpie el ARNNs mediante la adición de 1 l de glucógeno, 30 l de H₂O libre de nucleasas, 30 ml de acetato de amonio de 5 M y 180 ml de 100% EtOH al sgRNA transcrito. Mezclar bien e incubar al menos 20 min a -80 oC (hasta que esté congelado) o a -20 oC durante la noche. Centrífuga a 4oC durante 15 min a velocidad máxima.
10. Retirar y desechar el sobrenadante sin perturbar el pellet, y lavar con 1 ml de RNase-libre 70% EtOH refrigerado a -20 oC. Girar 5 minutos adicionales a una velocidad máxima a 4 oC.
11. Retire y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet, y seque al aire el pellet durante 5 min.
12. Resuspender en 30 l de H₂O libre de nucleasas y determinar la pureza y el rendimiento mediante espectroscopia UV (rendimiento mínimo de 200 ng/L).
13. Verifique la presencia de sgRNA en un gel libre de RNase. El sgRNA aparece entre 50 y 150 bp como dos bandas debido a la estructura secundaria(Figura 1B).
14. Aliquot en 3 l y almacenar a -80 oC.

3. Validar la eficiencia de corte in Vitro

1. Extraer ADN genómico de la especie objetivo utilizando un kit de extracción de ADN comercial. Los recortes de aleta ventral se pueden utilizar sin tener que sacrificar el pez, porque los tejidos se regeneran.
2. Amplifique la región de ADN objetivo utilizando las imprimaciones diseñadas como se describe en los pasos 1.6 y 1.7 utilizando PCR estándar. Verifique el producto mediante electroforesis de gel. Se sugiere la secuenciación del fragmento para asegurarse de que se está amplificando la región adecuada, pero no es necesario. Los resultados representativos de la plantilla scn4aa se muestran en la Figura 2.
3. Limpie el fragmento de PCR con un protocolo establecido de laboratorio o empresa.
4. Almacene el ADN amplificado a -20 oC. Considere separarlo en alícuotas para reducir los ciclos de congelación-descongelación.
5. Determine los importes y volúmenes necesarios de cada componente. Considere la posibilidad de ejecutar controles negativos (excluyendo sgRNA o Cas9) y un control positivo (un sgRNA previamente probado que corta su ADN amplificado PCR objetivo) si está disponible, así como una serie de concentración del sgRNA.
6. Configurar la mezcla de reacción a continuación en el orden especificado en un tubo de PCR a temperatura ambiente, añadiendo el sgRNA y la proteína Cas9 últimos para obtener mejores resultados: 50–100 ng del producto de PCR de ADN objetivo, 1 l de 10x tampón 3, 1 l de 10x BSA (0,1 g/ml) , 50–200 ng de proteína Cas9 (1 mg/ml, 150 ng sugerido) y 30–200 de ng sgRNA (100 ng sugerido).
   1. Incubar la reacción a 37oC durante 1 h y, a continuación, a 65oC durante 10 min para inactivar la proteína Cas9.
   2. Ejecuta toda la muestra con un gel de agarosa de 2%-3% (tamaños de banda esperados entre 30–200 bp) junto con controles positivos y negativos. El escote exitoso puede mostrar parte del producto PCR, pero también tendrá dos bandas más pequeñas. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2.

4. Obtención de embriones

NOTA: Obtener embriones de peces débilmente eléctricos puede ser un desafío. El monitoreo cuidadoso de la calidad del agua, el tiempo adecuado para el cuidado de los peces y la alimentación regular son clave para un programa de reproducción exitoso. Los peces deben estar primero acondicionados durante varias semanas para la reproducción⁵² como se describe en el paso 4.1 del protocolo. A continuación, se presenta un protocolo que aumenta la gametogénesis natural (4.2) para su uso en el comportamiento natural de desove (4.3), se presenta una alternativa recientemente desarrollada técnica in vitro para la obtención de embriones cronometrados con precisión (4.4). El Protocolo 4.3 es igualmente eficaz para B. brachyistius y B. gauderio,y el protocolo 4.4 es superior en B. gauderio.

1. Acondicionado
   1. Mantener B. brachyistius en parejas/grupos pequeños (tanques de 100-150 L) o en tanques muy grandes (2 machos y 5-6 hembras en aproximadamente 475 L de tanque), ya que se vuelven muy agresivos en condiciones de reproducción. Debe haber al menos 1–2 tubos de PVC por pez para ser utilizados como refugio(Figura 3A,B).
   2. B. gauderio se puede criar a una densidad mucho más alta. Mantenga hasta ocho individuos en un tanque de 100 L (2 machos y 6 hembras). Debe haber al menos 1 tubo de PVC por pez para ser utilizado como refugio. La adición de hilo enredado aumenta el enriquecimiento y los puntos de ocultación. Añadir tubos de centrífuga de 50 ml con agujeros de 1 cm de diámetro perforados en ellos a la parte superior del tanque para permitir que los adultos desovaran naturalmente en los tubos(Figura 3C).
   3. Durante la temporada de cría, alimente a los peces a diario gusanos negros frescos complementados con gusanos de sangre congelados. El alimento puede ser enriquecido con vitaminas y suplementos, si se desea.
   4. Peces de la casa normalmente en una conductividad relativamente alta (300-600 s), solución equilibrada de pH. Durante la temporada de cría, reduzca gradualmente la conductividad por lo menos la mitad en el transcurso de 1-3 semanas para inducir la recrudecimiento de la gónada y el desove. Menor conductividad por adiciones diarias de agua de ósmosis inversa (RO), manteniendo mucha atención al pH cuando la conductividad es baja (pH <6).
   5. Las condiciones de reproducción se pueden mantener durante alrededor de 3 a 5 meses con la producción de huevos disminuyendo con el tiempo. Después de este tiempo, devolver el pescado a alta conductividad lentamente durante 1-3 semanas. Mantenga otros 3 meses en alta conductividad antes de volver a exponerse a las condiciones de reproducción.
2. Utilice inyecciones de agente de desove (SGnRHa + Domperidone).
   1. Identificar los peces hembra en condiciones de reproducción que aparecen en salsa(Figura 4). En B. gauderio la hembra tendrá gónadas hinchadas sólo caudal a la ventilación. B. las hembras brachyistius tendrán vientres hinchados y aparecerán con cuerpo profundo(Figura 4A). Los hombres generalmente no tienen un problema para producir espermatozoides. Sin embargo, los machos más grandes son preferidos debido al mayor volumen de espermatozoides recogido.
      NOTA: El agente de desove es una mezcla de hormonas comerciales que facilita la maduración de gametos y coordenadas de desove. Si el pez ha sido inyectado con agente de desove en el pasado, permita >4 semanas de descanso y una amplia alimentación entre las inyecciones. Sugerimos inyectar al menos 2 machos y 4–5 hembras para asegurar unas cuantas puestas de huevos y un montón de espermatozoides.
   2. Anestetizar peces en MS-222 (0,4 g/3 L) durante unos minutos, hasta que el pez no sea capaz de mantener su postura, es inmóvil, pero sigue teniendo movimiento opercular (etapa II^53).
   3. Pesar el pescado (g) para calcular la cantidad del agente de desove, (0,5 l/g) + 0,5 l. El adicional de 0,5 s tiene en cuenta los errores de pipeteo.
   4. Agregue el agente de desove a volúmenes 4x de búfer (1x PBS o DPBS) en un tubo PCR y mezcle bien. La solución se volverá turbia. Ayuda a dispensar el agente de desove en termoplástico y luego utilizar una pipeta para medir la dosis calculada. El agente de desove es viscoso, así que asegúrese de dispensar toda la dosis y tenga cuidado con el pipeteo.
   5. Pipetear la solución de inyección en termoplástico y dibujar en una jeringa de vidrio de precisión, evitando burbujas de aire. Recomendamos una aguja biselada de 28 G, 19-25 mm de longitud.
   6. Inyectar la solución en el músculo del tronco dorsal a una velocidad suave. Deje que la aguja se sente durante 2-4 s y luego retírela. Coloque inmediatamente el pescado en agua del sistema fresco para su recuperación.
   7. Después de aproximadamente 24 horas, prepárense para la recolección de embriones (ver 4.3 o 4.4). Reúna todos los materiales necesarios, incluyendo lo que se necesita para la microinyección de una sola célula (ver sección 5).
3. Obtener embriones a través de desove natural.
   1. Adultos inyectados por agentes de desove de la casa (4.2) en tanques grandes de 450 L. Las relaciones sexuales más efectivas han sido típicamente 1-2 machos y 3-4 hembras con escondites adecuados hechos de tubos de PVC, y sustrato de mármol oscuro en el fondo del tanque para evitar el consumo de huevo. Los mármoles son típicamente más importantes para B. brachyistius que B. gauderio, que prefieren depositar sus huevos pegajosos en grietas o tubos centrífugos de 50 ml como se describió anteriormente.
   2. Coloque los peces en un ciclo de luz inverso para que coincida con el desove nocturno con las horas de trabajo regulares de laboratorio. Usando un sistema de seguridad de nivel de consumidor listo para usar, monitoree los peces con iluminación infrarroja para minimizar las perturbaciones desde un PC conectado remotamente(Figura 3).
   3. Los peces desovarán espontáneamente durante el fotoperiodo oscuro aproximadamente 24 h después de la inyección del agente de desove.
   4. Cuando comience el desove, recoja los huevos cada hora mientras se produce el comportamiento de desove. En B. brachyistius, recoja los huevos usando un sifón de pequeño diámetro sobre una fina red de malla de algodón para minimizar el daño a los huevos recién desoves. Recoger b. huevos de gauderio de tubos centrífugos de 50 ml o sustrato del tanque. Trabaje eficientemente con una perturbación mínima en el desove de peces mediante el uso de una lámpara de cabeza con una luz roja de baja intensidad. Como el primer escote se produce aproximadamente 1 h después de la fertilización (HPF), una gran porción de huevos será adecuada para la microinyección de una sola célula.
   5. Proceder inmediatamente a la microinyección (ver sección 5).
4. Apriete a los machos para la fertilización in vitro de B. gauderio.
   1. Prepare la solución extensora de espermatozoides (SES) como se describe en The Zebrafish Book⁵⁴: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM de acetato de sodio, 0,4 mM CaCl₂y 0,2 mM MgCl₂.
      1. Utilice ddH₂O para llevar al volumen y ajustar el pH a 7,7 con 1 M NaOH.
      2. Conservar en nevera.
      3. Filtrar a través de un filtro de 0,22 m antes de su uso.
   2. Anestetizar peces en MS-222 (0,4 g/3 L) durante unos minutos, hasta que el pez no sea capaz de mantener su postura, es inmóvil, pero sigue teniendo movimiento opercular (etapa II^53). Colocar 500 alícuotas de SES en el hielo.
   3. Seque las manos y pesque bien, especialmente alrededor de la cabeza y la ventilación. Coloque el lado ventral hacia arriba, antes de la izquierda (para personas diestras) en un soporte de espuma/esponja de poliestireno cubierto con una toalla de papel húmeda y empapada MS-222. La cabeza debe ser lo más paralela posible a la mesa.
      NOTA: Los pasos 4.4.4–4.4.6 deben hacerse lo más rápido posible, y los peces sólo deben estar sin agua durante 30–60 s.
   4. Aplique presión en la dirección caudal a la rostral con la luz apretando medialmente sobre las gónadas hacia la ventilación. El pescado puede expulsar los desechos. Tenga cuidado de limpiar la ventilación con una delicada limpieza de tareas si se expulsa algún residuo. No recoja los desechos con espermatozoides. Dependiendo del tamaño del macho, 10-60 l es común.
   5. Usando un micropipetter con una punta, recoja cuidadosamente los espermatozoides a medida que se exprime del macho en incrementos de 50 ol. Coloque los espermatozoides directamente en alícuotas de SES de 500 ol en hielo. Puede ser útil que otro investigador ayude a recoger esperma mientras que los otros aprietas. Los espermatozoides deben utilizarse lo antes posible, pero siguen siendo viables durante al menos 1 h.
   6. Inmediatamente después de recoger, poner el pescado en agua fresca del sistema para su recuperación. Los peces sólo deben estar sin agua durante 30-60 s.
5. Apriete a las hembras para la fertilización in vitro de B. gauderio.
   1. Anestetizar peces en MS-222 (0,4 g/3 L) durante unos minutos, hasta que el pez no sea capaz de mantener su postura, es inmóvil, pero sigue teniendo movimiento opercular (etapa II^53). Coloque la hoja de politetrafluoroeteno en la estación de trabajo.
      NOTA: Las secciones 4.5.1–4.5.5 deben hacerse lo más rápido posible y los peces sólo deben estar sin agua durante 30–60 s.
   2. Manos secas, herramientas, lámina de politetrafluoroeteno y peces a fondo, especialmente alrededor de la cabeza y la ventilación. Colocar en el lado con la cabeza orientada hacia antes (para personas diestras).
   3. Aplique presión en la dirección caudal a la rostral con la luz apretando medialmente sobre las gónadas hacia la ventilación. El pescado puede expulsar los desechos. Tenga cuidado de limpiar la ventilación con una delicada limpieza de tareas si se expulsa algún residuo. Dependiendo del tamaño del pescado, 20–150 huevos es común. Usando una espátula/herramienta recubierta de politetrafluoroeteno recoge cuidadosamente los huevos a medida que se exprimen de la cloaca. Mueva rápidamente los huevos a un pequeño plato de Petri y cúbralos. Asegúrese de que los huevos permanezcan secos durante este proceso. Alternativamente, después de apretar, toque la masa de huevo a la base de un pequeño plato de Petri o a la hoja de politetrafluoroeteno a medida que son expulsados de la hembra.
   4. Inmediatamente después de recoger, poner el pescado en agua fresca del sistema para su recuperación.
6. Realizar fertilización de óvulos para la fertilización in vitro de B. gauderio.
   1. Añadir 100 l de espermatozoides bien mezclados en SES (ver paso 4.4) directamente sobre la masa del óvulo.
   2. Añadir 1 ml de agua del sistema (filtrada a través de un filtro de 0,22 m) y mezclar bien durante 30–60 s.
   3. Agregue un 1–2 ml de agua adicional del sistema (deje algo de espacio en la placa Petri) y colóquelo en la incubadora. Registre el tiempo de FIV en el plato de Petri y pase a una incubadora de 29 oC. Establezca un temporizador de 50 minutos para comprobar el progreso del desarrollo (por ejemplo, la formación de la célula única en el polo animal, véase la Figura 6). Durante este tiempo, prepare los materiales para la microinyección.

5. Microinyección de células únicas

1. Tire de las agujas de microinyección antes de las inyecciones de agente de desove (paso 4.2) o el desove natural (paso 4.3). Utilice un capilar de vidrio borosilicato con un filamento (D.O. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm de longitud) y un tirador de agujas para extraer agujas de microinyección. Prepare de 2 a 4 agujas por inyección de tratamiento planificada.
   NOTA: Se prefieren las agujas de carga posterior con un filamento, ya que el filamento absorbe la solución hacia la punta y elimina las burbujas. Sin embargo, se pueden utilizar agujas sin filamento y la carga frontal no debería tener ningún efecto en el resultado. La aguja debe tener un cono largo, pero resistente. Utilice el programa de tracción de agujas con las siguientes especificaciones como punto de partida: calor 500; Tire de 70; Velocidad 70; y El tiempo 100. Las morfologías representativas de las agujas se muestran en la Figura 5A.
2. Prepare la solución inyectable y prepare la aguja.
   1. Añadir 0,9 l de sgRNA y 0,9 l de enzima Cas9 (1 mg/ml) a 0,2 ml de 10% o 100% de fenol rojo (para una concentración de color rojo fenol final del 1% y del 10 %, respectivamente) en un tubo pcR. Mezcle bien y deje sentarse en hielo de 2 x 5 minutos para permitir que el sgRNA y cas9 se asintan. Calcule la concentración final de sgRNA, Cas9 y fenol rojo en la solución de inyección.
      NOTA: Si hay problemas con la obstrucción de la aguja o la eficiencia de corte utilizando la receta anterior, puede ser útil utilizar una mezcla de sal/buffer de concentración final 1x para estabilizar Cas9 y evitar la obstrucción de la aguja.
   2. Utilice una punta de pipeta de microcargador para volver a cargar los 2 ml de solución en la aguja de microinyección. Expulse el líquido lo más cerca posible de la punta.
   3. Cargue la aguja en el micromanipulador y ajuste los ajustes de presión (comience con 775 p_i, 0,1 x 0,2 s y 8-12 p_c).
   4. Bajo el alcance, utilice un par de fórceps finos para romper la punta de la aguja en un ángulo biselado. Romper hacia donde el cónico de la aguja comienza a tener rigidez. Lo mejor es acercarse a la punta, probar el tamaño de la solución inyectable y luego romper más si es necesario. El orificio de la aguja debe permanecer lo más pequeño posible manteniendo un cónico rígido(Figura 5A).
   5. Utilice aceite mineral y un micrómetro para medir el tamaño de la solución inyectable. 1–2 nL se utiliza típicamente; El diámetro de 0,1 mm es de 0,5 nL.
   6. Ajuste la punta de la aguja o los ajustes de presión para obtener un volumen de inyección dentro de las especificaciones.
3. Identifique los cigotes en desarrollo y prepare la etapa de inyección. Configure la etapa de inyección. Tome una placa Petri de 100 mm de diámetro. Invierta la parte inferior y colóquela debajo de la parte superior invertida. Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio dentro de la parte superior invertida. Dependiendo de cómo se monte el micromanipulador en el endoscopio, la altura añadida de la base invertida puede ser innecesaria.
   1. Observe los óvulos en desarrollo e identifique los supuestos cigotes fertilizados de 50 a 60 minutos después de la FIV. El polo animal comenzará a formarse y habrá un exceso de pequeñas gotas de grasa alrededor de la interfaz de la yema / célula animal(Figura 6).
   2. Recoger de 10 a 20 huevos con la menor escasa agua posible utilizando una pipeta de transferencia de plástico (cortar ligeramente la punta para permitir que los huevos pasen) y colocar en el borde del tobogán. El agua será perversa debajo del tobogán y tirar de los huevos contra el borde.
   3. Utilice una toallita de tarea delicada y presione suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y permita que los huevos se adhieran firmemente al borde de la diapositiva. Debe haber suficiente agua para mantener los huevos húmedos mientras se mantiene poca humedad de pie para evitar el movimiento del óvulo durante la inyección.
4. Inyecte directamente en una sola célula.
   1. Alinee los huevos contra la corredera verticalmente, perpendicular a la aguja que se aproxima(Figura 5B).
   2. Con el micromanipulador, coloque la aguja contra el coro. En aproximadamente un ángulo de 45o, inserte la aguja en el coro y, a continuación, en la celda única. Puede ser útil entrar en la celda única a través de la yema. Mover tanto la etapa de inyección con la mano libre como el micromanipulador puede proporcionar más control sobre el proceso de inyección(Figura 5B).
   3. Inyecte solución sgRNA/Cas9/phenol red en una sola célula. Retire con cuidado la aguja. Proceda al siguiente huevo y repita los pasos 5.4.1–5.4.3 hasta que se inyecten todos los óvulos.
   4. Retire los huevos rotos durante la inyección con fórceps finos. Utilice 0,22 m de agua filtrada del sistema en una botella de chorro para eliminar suavemente los huevos de la etapa de inyección en una nueva placa Petri de 100 mm de diámetro.
   5. Repita los pasos 5.3.3–5.4.6 hasta que todos los óvulos se hayan inyectado o se hayan desarrollado hasta la etapa de dos células. Asegúrese de reservar aproximadamente 20 supuestos óvulos fertilizados como un control sin inyección para determinar las tasas de fertilización y el éxito de la inyección. Para embragues más grandes, utilice embriones no inyectados que se hayan desarrollado hasta la etapa de dos células, y para las garras más pequeñas reservan los supuestos óvulos fertilizados.
   6. Además, considere un control de sgRNA/inyección inyectando de 15 a 25 embriones con Cas9 complejo con un sgRNA contra un gen que no está presente en el genoma. El gen GFP recomendado para embriones de tipo salvaje. Registre el número de huevos, los padres, la hora de la FIV y la fecha en cada plato de Petri. Incluya el objetivo de sgRNA o la etiqueta como no inyectado. Pasar a una incubadora de 29oC.

6. Esposo de animales

1. Cuida los huevos.
   1. Compruebe la viabilidad del huevo de 4 a 6 horas después de las inyecciones.
   2. Registre el número de huevos muertos, así como los que no están fecundados. Los huevos no fecundados se detendrán alrededor de la etapa de ocho células y tienen un patrón de roseta de las células en el polo animal(Figura 6). Dependiendo del número de huevos muertos y la cantidad de restos de huevo en el agua, retire al menos entre el 50% y el 80% del agua y sustitúyala por agua filtrada del sistema. Puede ser útil fregar la parte inferior de la placa Petri si se forma una película de escombros celulares o una biopelícula.
   3. Durante los próximos 2-3 días, revise los huevos de 1 a 2 veces al día. Repita los pasos 6.1.2–6.1.3 cada vez que se revisen los huevos.
   4. Después de 2 o 3 días las larvas eclosionarán. Retire todas las cubiertas de huevo a medida que eclosionan. El pipeteo suave puede ayudar a liberar larvas semi-hatched.
2. Cuidar las larvas.
   1. Revise los huevos 1 x 2 veces al día. Repita los pasos 6.1.2–6.1.3 cada vez que se revisen las larvas.
   2. De 6 a 14 DPF, alimenta las anguilas de vinagre a las larvas. Un ligero exceso de comida es bueno, porque las anguilas de vinagre permanecerán vivas en el plato. Agregue las anguilas de vinagre cada vez que el plato sea revisado y limpiado.
   3. De 11-14 DPF, agregue 5-10 Artemia recién eclosionado por larvas, además de anguilas de vinagre. Durante este tiempo las larvas aprenderán a comer la natación libre Artemia.
   4. A 15 DPF, mueva las larvas a tazas de huevo (ver sección 6.2.5) en un tanque con agua corriente, filtración y aireación. No debe haber más de 25 embriones por taza. Las tazas de huevo son tazas de plástico con una malla en la parte inferior. Se puede añadir una parte superior/inferior de un plato Petri de 100 mm en la parte inferior de la taza de huevo para ayudar a evitar que los alimentos caigan a través de la malla. Las tazas de huevo permiten que el pescado se alimente en un mayor volumen de agua por razones de calidad del agua, manteniendo grupos discretos. Continúe agregando anguilas de vinagre y 15 x 30 Artemia recién eclosionadas por larvas de los días 15-18. Limpie la pieza de plato petri diariamente y use una pipeta para eliminar las masas de Artemiamuerta.
   5. Desde los días 18–30, alimentar sólo Artemiarecién nacido . Aumentar la cantidad de alimentación a medida que los peces crecen y si se ve morder la cola.
   6. Después de aproximadamente 30 días, mueva el pescado a tanques de 10 L (2,5 galones), aproximadamente 25 individuos por tanque. Asegúrese de que haya filtración, aireación y lugares para esconderse. Considere los medios de biofiltración cilíndricos y los tubos de PVC de diámetro pequeño.
   7. Alimentar Artemia recién nacido y gusanos negros de aproximadamente 30-45 días en adelante. Mantener la limpieza estándar y los cambios de agua para el tanque (es decir, a un mínimo de 10% – 20% de cambio de agua por 1 semana).
   8. Después de 45 DPF, alimente sólo a los gusanos negros hasta 60 DPF.
   9. Después de 60 DPF, mueva cohortes de aproximadamente 15 peces a tanques de 40 L (10 galones) y comience los procedimientos de cría de adultos. Añadir tubos de PVC y un hilo "mop" (una masa de hilo marrón atado alrededor de un corcho) para escondites(Figura 3C). Los peces deben estar cerca del tamaño de la cría (10-12 cm) después de aproximadamente 3 x 4 meses después de la fertilización.

7. Esposo adulto

1. Alimente a los peces diariamente con suficientes gusanos negros para que una pequeña cantidad de gusanos negros estén presentes en la próxima alimentación. Esta alimentación ad libitum permite un crecimiento máximo.
2. Unas cuantas veces a la semana, puede ser útil complementar la alimentación de gusanos negros con gusanos de sangre.
3. Limpie los tanques cada 2-4 semanas con un cambio de agua del 20%-30%. Si la fregona de hilo se llena de biopelícula/algas, frota con agua RO.

Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.

Los peces adultos fueron acondicionados para su reproducción (Sección 4.1), luego se inyectaron con un agente de desove (Sección 4.2) y posteriormente se exprimieron (B. gauderio) para la FIV como se describe en la Sección 4.4 o se les permite desovar naturalmente (B. brachyistius) como descrito en la Sección 4.3. Estos esfuerzos produjeron embriones de una sola célula para la microinyección en ambas especies. Como se describe en la Sección 5, se inyectaron 1.5-2.0 nL del complejo rojo scn4aa sgRNA/Cas9/fenol (65-190 ng/uL sgRNA, 450 ng/uL Cas9, 1%-10% fenol rojo, concentraciones finales) en la etapa de una célula. Los huevos del mismo embrague se utilizaron como controles sin inyección. Todos los embriones fueron atendidos como se describe en la Sección 6. Después de la FIV, entre el 40% y el 90% de los óvulos fueron fertilizados, y entre el 70% y el 90% de los embriones sobrevivieron a la eclosión después de la inyección.

Alrededor del 75% de los peces sobrevivieron a 6-11 DPF y luego fueron fenografiados. Los peces larvales se colocaron en una placa Petri de 35 mm incrustada en un plato más grande con electrodos de grabación Ag/Cl inmovilizados Sylgard(Figura 7A). El movimiento de embriones se restringió utilizando moldes de agarosa del 3% hechos con agua del sistema y cortados para adaptarse al embrión(Figura 7B). La misma cámara de registro se utilizó para ambas especies y el mismo molde de agarosa se utilizó entre las comparaciones de especies. Los embriones se registraron durante 60 s, lo que es suficiente para capturar cientos de EOD. Se seleccionaron los controles de edad y sin inyección coincidentes con el tamaño para la comparación. En este momento, entre el 10% y el 30% de los embriones supervivientes muestran una EOD de amplitud reducida. Los embriones que mostraban una reducción en la amplitud de la EOD sin defectos morfológicos obvios y el control de embriones enteros no inyectados fueron digeridos para la extracción de ADN y la posterior PCR del sitio objetivo scn4aa. A menudo había un rango de penetración del fenotipo, con algunos individuos teniendo una reducción más fuerte en la amplitud de EOD que otros.

Después de la limpieza y clonación de PCR, se seleccionaron más de 30 clones de cada embrión para la secuenciación de Sanger. Se identificaron mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en individuos B. gauderio (Figura 8A,B)y B. brachyistius (Figura 9A,B) con fuerte reducción de amplitud EOD(Figura 8C y Figura 9C , respectivamente), donde los controles no inyectados sólo tenían genotipos de referencia. La visualización de la amplitud de EOD entre los mutantes confirmados ("CRISPR") y los controles de edad/tamaño no inyectados demostró que tanto el mutante scn4aa B. brachyistius (Figura 10A)como B. gauderio (Figura 10B ) los embriones tenían una amplitud EOD significativamente menor que los controles (p < 2,2 x 10-16, prueba t de dos muestras de Welch). La focalización de CRISPR/Cas9 de scn4aa tuvo éxito tanto en B. brachyistius como en B. gauderio e implican scn4aa en la descarga de electrocitos larvales/tempranos en ambas especies.

Figura 1: síntesis y transcripción de plantillas sgRNA. (A) Imagen de gel de síntesis de plantillas sgRNA. Las etiquetas corresponden a diferentes sgRNA para myod (MYO2, MYO1) y tres sgRNAs para scn4aa (S1-S3). Después de recocido de los oligómeros, se produce una plantilla de 120 bp. (B) Imagen de gel de transcripción sgRNA para tres sgRNA para B. gauderio (bg2017) y dos para B. brachyistius (bb2016, 2017). El sgRNA aparecerá como dos bandas debido a la estructura secundaria y estará entre 50-150 bp cuando se utiliza una escalera dsDNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen representativa del gel de ensayos CRISPR exitosos (sg1) y no exitosos (sg2). Una cantidad equivalente de plantilla sin componentes CRISPR se muestra en el carril scn4aa. Tenga en cuenta las bandas duplicadas en sg1 que muestran que se ha producido el corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuraciones de tanques de cría para peces débilmente eléctricos. (A) Esquema de la configuración típica para la supervisión inalámbrica de vídeo del comportamiento de generación. Tres cámaras CCTV disponibles comercialmente (Swann, Inc.) capaces de producir luz infrarroja están dirigidas a la parte superior del agua y conectadas a una grabadora de vídeo digital (DVR). El vídeo se supervisa en tiempo real para el comportamiento de generación en una habitación adyacente desde un ordenador conectado a la red (PC). (B) Comportamiento de desove capturado con tal configuración en B. brachyistius. (C) Una configuración de cría típica para B. gauderio con tubos de ocultación de PVC y fregonas de hilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Criar machos y hembras. (A) B. brachyistius y (B) B. gauderio. Ambas especies son sexualmente dimórficas y se distinguen visualmente fácilmente cuando son sexualmente maduras. Ambas hembras son gravid en estas fotos, exhibiendo vientres característicos hinchados que están llenos de huevos maduros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Microinyección. (A) Las puntas de las agujas capilares de vidrio deben romperse para proporcionar un volumen de microinyección adecuado. La punta de la izquierda es ininterrumpida. Las puntas media y derecha se rompen con un bisel ligeramente inclinado para perforar el coro de huevo. (B) Los huevos se foran contra un portaobjetos de vidrio (1%-10% de color rojo fenol se incluye como un marcador para visualizar la entrega de la inyección) y se inyectan con agujas capilares de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Etapas de desarrollo. (A) B. gauderio y (B) B. brachyistius. Todos los óvulos se asumen fertilizados y el desarrollo se controla a 24 HPF. Entre los embriones de 12 a 24 HPF son visibles en óvulos viables, de lo contrario los óvulos presentan degradación. Varias divisiones parecen tener lugar en la activación del óvulo, independientemente de la fertilización. Los huevos no fertilizados exhiben patrones inusuales de escote que son mucho más simétricos en los huevos fertilizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Fotografía de la cámara de grabación larval utilizada en este estudio. (A) Los electrodos están incrustados dentro de Sylguard, pero se extienden en la placa de 35 mm que contiene un embrión restringido a través de un molde de agarosa del 3%. (B) Imagen de aumento más alta que resalta el movimiento restringido del embrión debido a la agarosa. Tenga en cuenta las piezas de agarosa que se pueden extraer a medida que el embrión cambia de tamaño. El embrión B. gauderio se enfrenta al electrodo positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en B. gauderio. (A) Treinta y dos secuencias clonadas del ADN genómico de mutaciones inducidas por Cas9 en un solo embrión scn4aa dirigido f0B. gauderio (11 DPF). La secuencia de referencia se subraya con el sitio de destino sgRNA resaltado en gris, la secuencia de motivos adyacentes protoespaciales (PAM) resaltada en rojo y el sitio de corte Cas9 marcado con "a". Se da el cambio de la secuencia de tipo salvaje esperada y el número de clones para cada secuencia se indica entre paréntesis. (Abreviaturas: + - inserción, - eliminación, indel) Cualquier diferencia de secuencia asociada no CRISPR está en negrita. Figura modelada a partir de Jao et al.60. (B) Secuencia de aminoácidos predicha a partir de clones secuenciados de scn4aa knockdown B. gauderio de (A). Los cambios inducidos por Cas9 de la secuencia de tipo salvaje se resaltan en rojo y se da el número de cambio inducido por nucleótidos. (C) Vigésimo segundo grabaciones eléctricas de cinco larvas de tamaño igualado, todas registradas 6 DPF en la misma cámara de grabación. La configuración de ganancia es idéntica para todos los seguimientos. Los rastros en rojo son de larvas de B. gauderio con mutaciones confirmadas (un individuo mostrado en la Figura 8A, B arriba), los rastros en negro son de larvas B. gauderio no inyectadas. En general, la edición CRISPR/Cas9 de scn4aa mostró una reducción en la amplitud de EOD, aunque el efecto fue heterogéneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en B. brachyistius. (A) Cuarenta y dos secuencias clonadas del ADN genómico de mutaciones inducidas por Cas9 en un solo embrión scn4aa dirigido a F0B. brachyistius (11 DPF). La secuencia de referencia se subraya con el sitio de destino sgRNA resaltado en gris, la secuencia de motivos adyacentes protoespaciales (PAM) resaltada en rojo y el sitio de corte Cas9 marcado con "a". Se da el cambio de la secuencia de tipo salvaje esperada y el número de clones para cada secuencia se indica entre paréntesis. (Abreviaturas: + - inserción, - eliminación, indel) Cualquier diferencia de secuencia asociada no CRISPR está en negrita. Figura modelada a partir de Jao et al.60. (B) Secuencia de aminoácidos predicha a partir de clones secuenciados a partir de scn4aa knockdown B. brachyistius in (A). Los cambios inducidos por Cas9 de la secuencia de tipo salvaje se resaltan en rojo y se da el número de cambio inducido por nucleótidos. (C) Diez segundos grabaciones eléctricas de cuatro larvas de tamaño igualado, todas registradas 10 DPF en la misma cámara de grabación. La configuración de ganancia es idéntica para todos los seguimientos. Los rastros en rojo son de larvas de B. brachyistius con mutaciones confirmadas (un individuo mostrado en A, B arriba), los rastros en negro son de larvas de B. brachyistius no inyectadas. En general, la edición CRISPR/Cas9 de scn4aa mostró una reducción en la amplitud de EOD, aunque el efecto fue heterogéneo. Los EOD invertidos son de la orientación de cambio de pescado durante la grabación. No hay diferencia entre los peces experimentales y los controles a pesar de esto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Diagramas de caja de amplitud EOD promedio de los hermanos CRISPR y no inyectados de tamaño/edad. (A) Amplitud EOD de larvas B. brachyistius a 10 DPF. Grabado con una ganancia de 100, CRISPR n a 56 EODs de dos individuos, sin inyectar n a 114 EODs de tres individuos. (B) Amplitud EOD de larvas B. gauderio a 6 DPF. Grabado con una ganancia de 500, CRISPR n 34 EODs de dos individuos, sin inyectar n a 148 EODs de tres individuos. La amplitud de los peces CRISPR fue significativamente menor que los controles no inyectados (p < 2.2 x 10-16, Welch dos muestras t-test). Todos los individuos fueron grabados con la cámara de grabación descrita en la Figura 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Oligonucleótidos necesarios para el protocolo.

Los autores no tienen nada que revelar.