Artículo de método

Dieta de cafetería de estilo occidental palatable como un método confiable para modelar la obesidad inducida por la dieta en roedores

DOI:

10.3791/60262

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1 de noviembre de 2019

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, UNSW Sydney

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe el uso de una dieta de cafetería de estilo occidental altamente apetecible para modelar la alimentación excesiva y la obesidad en roedores. Aquí, proporcionamos un esquema detallado de la selección, preparación y medición de alimentos, y explicamos factores metodológicos que ayudan a generar un fenotipo robusto y reproducible.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La obesidad está aumentando rápidamente en la incidencia en los países desarrollados y en desarrollo y se sabe que induce o exacerba muchas enfermedades. La carga sanitaria de la obesidad y sus condiciones comorbilidades ponen de relieve la necesidad de una mejor comprensión de su patogénesis, pero las limitaciones éticas limitan los estudios en los seres humanos. Con este fin, los modelos de obesidad externamente válidos en animales de laboratorio son esenciales para la comprensión de tener sobrepeso y obesidad. Mientras que muchas especies se han utilizado para modelar la gama de cambios que acompañan a la obesidad en los seres humanos, los roedores se utilizan más comúnmente. Nuestro laboratorio ha desarrollado una dieta de cafetería de estilo occidental que conduce constantemente a un aumento considerable de peso y marcadores de enfermedad metabólica en roedores. La dieta expone a los roedores a una variedad de alimentos altamente apetecibles para inducir la hiperfagia, modelando el ambiente alimentario occidental moderno. Esta dieta induce rápidamente el aumento de peso y la acumulación de grasa corporal en ratas permitiendo el estudio de los efectos de comer en exceso y la obesidad. Si bien la dieta de la cafetería puede no proporcionar el mismo control sobre el perfil de macronutrientes y micronutrientes que las dietas purificadas con alto contenido de grasa o alto contenido en grasas, con alto contenido de azúcar, la dieta de la cafetería normalmente induce un fenotipo metabólico más grave que el observado con dietas y está más en línea con las alteraciones metabólicas observadas en la población humana con sobrepeso y obesidad.

Introducción

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La obesidad y sus comorbilidades relacionadas hacen una enorme contribución a la carga sanitaria mundial1 y representan el 7% de la carga de morbilidad en Australia2. Un factor de riesgo principal para la obesidad es el consumo de dietas poco saludables que son altas en grasas saturadas y carbohidratos refinados, y bajos en fibra y micronutrientes3. La identificación de objetivos de intervención terapéutica para la obesidad requiere modelos que puedan evaluar sistemáticamente los efectos en múltiples sistemas bioquímicos y fisiológicos. Nuestra comprensión de la etiología de la obesidad ha avanzado sustancialmente mediante el trabajo utilizando modelos de roedores, donde los efectos conductuales, metabólicos y moleculares pueden ser estudiados a través del tiempo en condiciones controladas donde los factores ambientales pueden ser fácilmente Manipulado.

El modelo de dieta de cafetería (CAF) de obesidad inducida por la dieta consiste en complementar la dieta de coma estándar de los roedores con una variedad de alimentos palpables que son altos en grasas saturadas, carbohidratos refinados, o ambos. Algunos ejemplos de estos alimentos son las tortas, las galletas dulces y los refrigerios salados con alto contenido de grasa (como carnes procesadas, queso y patatas fritas). Promueve de forma fiable la hiperfagia y el rápido aumento de peso en roedores. Las características clave del modelo son la provisión de una variedad de alimentos altamente agradables, diseñados para simular el entorno alimentario moderno. El acceso a la variedad aumenta la ingesta de alimentos en ratas a corto plazo4 y en humanos5 incluso cuando los alimentos se igualan para la palatabilidad y varían sólo en sabor y señales olfativas4,6. Sin embargo, un estudio mostró que proporcionar dietas purificadas igualadas de energía y macronutrientes que variaban en sabor y textura no tuvo ningún efecto en el aumento de peso corporal a largo plazo en ratas7,lo que sugiere que la composición de nutrientes y efectos post-orales distintos de diferentes alimentos también pueden contribuir a comer en exceso. La exposición a múltiples sabores y texturas supera la saciedad sensorialmente específica, que describe la disminución en el deseo de comer un alimento recién comido en relación con una alternativa5. En muchas cohortes de nuestro laboratorio, hemos observado de manera similar que el uso de alimentos altamente apetecibles amplifica aún más la alimentación excesiva.

Esta dieta CAF se ha utilizado durante más de 40 años, desde que Sclafani8 informó que las ratas hembra expuestas a una variedad de "alimentos de supermercado" (malvaviscos, chocolate, mantequilla de maní, galletas, salami y queso entre ellos) mostraron aumento de peso acelerado en relación con los controles. Este y otros estudios tempranos señalaron que las dietas al estilo CAF parecían acelerar el aumento de peso más eficazmente que las dietas puras con alto contenido de grasa o alto en carbohidratos 8,9. El trabajo en la década de 1980 caracterizó los perfiles macronutrientes10 y los patrones de comida11 de ratas alimentadas con dietas CAF, y mostró profundos cambios en la masa grasa y los niveles de insulina9,10 y termogénesis12. Nuestro grupo ha utilizado la dieta CAF para modelar la obesidad durante más de dos décadas13,14 y durante este tiempo hemos utilizado varias variantes de la dieta. Las ratas se presentan con al menos dos alimentos dulces y dos salados cada día, además de la comida regular y el agua. En los últimos años hemos comenzado a complementar alimentos sólidos CAF con 10% solución de sacarosa. La capacidad de adaptar la dieta CAF a diferentes diseños experimentales es una fortaleza del modelo.

Las dietas de CAF promueven la hiperfagia inmediata (es decir, dentro de los primeros 24 h) y ganancias constantes en peso corporal y masa grasa. Sin embargo, una consecuencia de maximizar la variedad es que la ingesta de macronutrientes y micronutrientes no está controlada, un punto de vista como un defecto insuperable15. Los estudios de obesidad inducida por la dieta utilizan con mayor frecuencia dietas purificadas con alto contenido de grasa (HF) o combinadas con alto contenido de azúcar (HFHS), que ofrecen un control preciso sobre el contenido nutricional y consumen menos mano de obra que el modelo CAF, que requiere monitoreo diario y planificación y ejecución cuidadosas de la programación. La relevancia traslacional de las dietas de IC purificadas disponibles comercialmente es un tema de debate en curso, ya que su perfil de ácidos grasos y las proporciones de grasa y sacarosa pueden no alinearse con la ingesta dietética humana16. Si bien la dieta CAF no ofrece el mismo grado de control sobre la composición de nutrientes que las dietas purificadas, tiene como objetivo modelar la palatabilidad y variedad que caracteriza las opciones alimentarias en la mayoría de las sociedades modernas.

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Protocolo

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El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para su uso en ratas. Si bien hemos utilizado la dieta CAF con éxito en ratones17,18, la molienda de alimentos blandos puede introducir más errores reduciendo la fiabilidad de las medidas de ingesta de alimentos19. Este protocolo es aprobado por el Comité de Cuidado y Etica Animal de la Universidad de Nueva Gales del Sur y cumple con las directrices australianas para el uso y cuidado de animales con fines científicos (8a Edición) proporcionadas por la Australian National Health y Consejo de Investigación Médica.

NOTA: Se han observado muy pocos efectos adversos en nuestros estudios a corto plazo (es decir, <10 semanas de acceso ad libitum CAF); no hay evidencia de cambios en el bienestar general, actividad, sociabilidad o comportamiento similar a la ansiedad en ratas en la dieta CAF20. Después de intervalos más largos (>16 semanas) se han observado incidentes cardiovasculares muy ocasionales en ratas alimentadas por CAF.

1. Aclimatación y Vivienda animal

  1. Aclimatar ratas a las instalaciones durante 5-7 días después de la llegada con acceso gratuito para controlar la dieta y el agua. Manipule ratas todos los días a partir de 24 h después de la llegada; La dieta CAF implica la interacción diaria con la jaula por lo que el manejo regular es importante.
  2. Asegurar que se proporcione enriquecimiento ambiental a todas las jaulas. Una jaula estándar contiene una caja de polimetilmetacrilato rojo, material de anidación y un palo de mascar de madera, lo cual es importante porque los alimentos blandos proporcionados dentro de la dieta CAF pueden resultar en ratas que desarrollan maloclusión sin acceso a artículos más difíciles de masticar.
  3. Antes de comenzar la dieta CAF, asigne jaulas a los grupos CAF o chow y asegúrese de que se igualan para el peso corporal inicial comparando la media y el rango de pesos corporales entre grupos y reasignando según sea necesario. Como la exposición a la iluminación puede afectar los ritmos circadianos, la ingesta de alimentos y la actividad, asegúrese de que las jaulas de CAF y chow se distribuyan uniformemente en la sala de la colonia.
    NOTA: Los roedores forman jerarquías sociales cuando están alojados en grupos (especialmente los hombres). Los efectos del estrés social se controlan parcialmente asegurando que las ratas se alojan con otras personas de un peso corporal similar (para reducir el acoso dentro de una jaula). Además, la dieta de la cafetería debe distribuirse uniformemente alrededor de la jaula para que todas las ratas tengan acceso a la dieta.

2. Selección y configuración de la dieta

  1. Programación
    1. Asegúrese de que la comida y el agua regulares estén siempre disponibles y se complementen con un mínimo de dos productos dulces y dos sabrosos cada día (un ejemplo de un horario semanal se muestra en la Tabla 1;opciones de alimentos durante 3 días que se muestran en la Figura 1). Los extras opcionales son una solución de sacarosa alta en grasa, alta azúcar y 10%.
    2. Elija alimentos dentro de cada categoría que sean similares en proporciones de macronutrientes: todos los artículos dulces son relativamente más altos en carbohidratos que la grasa y todos los artículos salados son más altos en grasa que los carbohidratos. Intenta proporcionar proporciones similares de grasa, carbohidratos, azúcar y proteínas en cada conjunto diario de alimentos CAF.
    3. Supervise regularmente el consumo durante todo el experimento para que el menú pueda adaptarse, si es necesario, para mantener la hiperfagia. La Tabla 2 proporciona información sobre la densidad de energía y macronutrientes para varios ejemplos de alimentos, y sugiere cantidades de partida para ratas Sprague Dawley macho de 200 g.
    4. Evite alimentar cualquier alimento individual en días consecutivos o con demasiada frecuencia en una semana, ya que esto puede disminuir la ingesta de ese alimento. Si esto ocurre, omita los alimentos del horario durante unos días antes de volver a incorporarlos.
      NOTA: Las ratas pueden mostrar neofobia y la mayoría de los alimentos nuevos requieren exposiciones repetidas para determinar si se consumirán. Las ratas no suelen preferir alimentos que contienen levadura (pan, pizza, etc.) o aquellos con sabores cítricos o de café.
  2. Alimentos húmedos
    1. Considere la posibilidad de presentar alimentos con mayor contenido de humedad en un recipiente como un tinrín, para evitar ensuciar la ropa de cama. Los contenedores vacíos también deben proporcionarse a las jaulas de control si esto se hace.
  3. Abastecimiento de dieta
    1. Asegúrese de que los alimentos CAF utilizados sean básicos u obtengan suficiente para todo el experimento para que los alimentos permanezcan consistentes y no necesiten ser sustituidos.
  4. Almacenamiento de la dieta
    1. Almacene los alimentos como se indica en el envase o a -20 oC y desconde la noche anterior a su uso. Almacene los productos secos (biscuits) en un recipiente hermético.
  5. Solución de sacarosa (opcional)
    1. Preparar la solución de sacarosa, típicamente 10% (p/v) a granel (2-5 L) y almacenar a 4 oC cuando no esté en uso.
    2. Sustituya las botellas de sacarosa semanalmente (como mínimo) para evitar el crecimiento bacteriano o fúngico. Inspeccione las botellas diariamente y reemplácelas si se observan signos de crecimiento.
      NOTA: Se proporciona sacarosa además de agua, que siempre está disponible.

3. Preparación de la dieta de la cafetería

  1. Descongelación
    1. Sacar las cantidades apropiadas de alimentos CAF para descongelar 24 horas antes de su uso. Los alimentos se pueden descongelar con un microondas, pero no deben presentarse mientras estén calientes.
  2. Reposición diaria de la dieta CAF
    1. Cambiar los alimentos de la dieta CAF diariamente asegura que la variedad se maximice, y la suciedad de la jaula se minimice. A medida que las ratas comen la mayor parte de su ingesta diaria en la porción inicial del ciclo oscuro, programe el reabastecimiento de alimentos de CAF cerca del inicio del horario oscuro para que los alimentos estén frescos en este momento. Reponer la dieta CAF en un día en que no se está midiendo la ingesta de alimentos.
    2. Alimentar a los grupos de comida de una manera que se asegure de que este grupo tiene una experiencia diaria similar, como se indica a continuación.
      1. Gire las botellas de agua (spouts up), coloque la jaula en el espacio de trabajo y retire la tapa.
      2. Perturbar ligeramente la ropa de cama durante aproximadamente 20 s, para simular el proceso de recolección de alimentos de la ropa de cama de las jaulas CAF.
      3. Coloque un pequeño puñado de pellets de chow de la tolva de alimentos en la ropa de cama, para equiparar la exposición a los alimentos en la ropa de cama de la jaula.
      4. Vuelva a colocar la tapa de la jaula y vuelva al bastidor, reemplazando las botellas de agua solo cuando la jaula esté asentada para minimizar los derrames.
    3. Alimentar a los grupos de cafetería
      1. Prepare los artículos de la dieta CAF en un recipiente etiquetado para cada jaula.
      2. Gire las botellas de agua (spouts up), coloque la jaula en el espacio de trabajo y retire la tapa.
      3. Retire la mayor cantidad posible de la dieta de la antigua cafetería de la ropa de cama.
      4. Coloque una dieta fresca en la cafetería en la jaula.
      5. Cierre la jaula y vuelva al bastidor.
      6. Sustituya las botellas de agua y sacarosa.
        NOTA: Para evitar exponer ratas de comer a la dieta CAF, considere la posibilidad de alimentar jaulas de comida antes de las jaulas de CAF, o viceversa. Los guantes deben cambiarse entre el manejo de ratas de diferentes grupos de dieta.
  3. Recargar las botellas de comida, agua y sacarosa según sea necesario. Hacer esto después de otros procedimientos es más eficiente, ya que las cajas son más pesadas después de rematar los alimentos y el agua.
    NOTA: Las cajas CAF se suelen más rápidamente y necesitan cambiarse más a menudo para evitar el estrés inducido por la exposición a la ropa de cama húmeda, así como olores fuertes. Inspeccione la ropa de cama diariamente y cámbiela según corresponda.

4. Ingesta de alimentos más de 24 H

NOTA: Las mediciones de ingesta de alimentos se realizan durante un período discreto de 24 h varias veces por semana.

  1. Al iniciar la dieta CAF, mida el peso corporal y 24 h de ingesta de alimentos al menos dos veces por semana para controlar la eficacia de la dieta. Comience las mediciones de ingesta de alimentos cerca del inicio de la fase oscura. El objetivo es presentar el mismo conjunto de alimentos CAF en los días de medición de la ingesta de alimentos, ya que la equiparación de las densidades de sabor y energía permitirá un monitoreo preciso de los cambios a lo largo del tiempo.
    NOTA: Esto puede no ser posible para estudios que requieren >2 mediciones de ingesta de alimentos por semana, ya que las exposiciones excesivas a los mismos alimentos pueden reducir la hiperfagia con el tiempo.
  2. CAF y controlar las medidas de ingesta dietética
    1. Preparar la dieta CAF y colocar en un recipiente etiquetado para cada jaula, pesando y registrando cada componente. La Figura 1 muestra un conjunto completo de alimentos CAF. La Tabla 3 consiste en un ejemplo de hoja de monitoreo de la ingesta de alimentos.
    2. Rellene los niveles de agua, sacarosa y comida según sea necesario.
  3. Para jaulas de comida (control)
    1. Gire las botellas de agua (spouts up), coloque la jaula en el espacio de trabajo y retire la tapa.
    2. Pesar las ratas y luego transferirlas a una jaula con ropa de cama fresca, junto con enriquecimiento ambiental.
    3. Peso récord de botellas de agua y comida.
    4. Vuelva a colocar la tapa de la jaula, devuelva la jaula al estante y, a continuación, gire las botellas de agua. Se pueden añadir pequeños letreros que indiquen "FOOD INTAKE" a la jaula para notificar a los asistentes e investigadores que no toquen las botellas y la comida.
  4. Para las jaulas CAF:
    1. Realice los mismos pasos que en el paso 4.3. Además, esparza el recipiente prepesado de alimentos CAF alrededor de la jaula con ropa de cama fresca antes de que las ratas sean transferidas.
    2. Dejar ratas durante un período de 24 horas con mínima perturbación. Registre cualquier interrupción imprevista (por ejemplo, la llegada de ratas nuevas a la sala de la colonia o cambios en el ruido ambiental).
  5. Finalizar la medición de la ingesta de alimentos
    1. Registre el peso de las botellas de agua y la comida para las jaulas de comida, buscando cuidadosamente en la ropa de cama trozos de comida. Retire el letrero de "ingesta de alimentos" de las jaulas una vez completado.
    2. Preparar una dieta fresca de CAF para jaulas CAF.
    3. Para cada jaula CAF
      1. Peso récord de agua, comida y sacarosa.
      2. Retire la tapa de la jaula y el enriquecimiento ambiental.
      3. Retire cuidadosamente los fragmentos de CAF de la ropa de cama y colóquelos en recipientes separados. Retire primero las piezas más grandes y luego tamifre sistemáticamente toda la ropa de cama de la jaula de un extremo al otro usando movimientos de barrido suaves.
        NOTA: Aplique el mismo grado de cuidado a cada jaula al recolectar alimentos. Registre dónde una jaula ha sido particularmente desordenada, en algunos casos las ratas triturarán pastel y/o galleta en un polvo fino que es difícil de recoger. Esto puede inflar artificialmente las medidas de ingesta de alimentos.
      4. Distribuir la nueva dieta CAF alrededor de la jaula, devolver el enriquecimiento ambiental, cerrar la tapa de la jaula y devolverla al estante, eliminando el signo de "ingesta de alimentos".
      5. Registre el peso de cada alimento CAF hasta 0,1 g. Restar los alimentos restantes del peso inicial de los alimentos para obtener el total de alimentos consumidos por jaula, y luego dividir por el número de ratas en cada caja (suponiendo así la misma ingesta).
      6. Multiplique la cantidad consumida (g/rata) por la densidad de energía (kJ/g) de cada alimento proporcionado por el fabricante.
        NOTA: Para calcular la ingesta de macronutrientes utilizamos asumir densidades de energía de 16,7 kJ/g para carbohidratos y proteínas, y 37 kJ/g para la grasa.

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Resultados

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Como se muestra en la Figura 2A,la alimentación de la dieta CAF produce un aumento de 2,5 veces en la ingesta de energía en relación con los controles de la coma, basado en datos de tres cohortes de ratas macho Sprague Dawley, que es consistente durante 6 semanas. Otros estudios han confirmado que esta extensión de la hiperfagia se mantiene en más de 1021 y 16 experimentos de22 semanas. La curva de peso(Fig...

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Discusión

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Al exponer a las ratas a una variedad de alimentos altamente apetecibles ricos en grasas y azúcares, el protocolo de dieta CAF descrito aquí proporciona un modelo confiable y robusto de la llamada "dieta occidental" que consumen muchas personas. La hiperfagia, evaluada como un aumento significativo en la ingesta de energía en relación con los controles, se observa dentro de las primeras 24 horas de exposición, con diferencias de peso corporal estadísticamente significativas observadas en cuestión de semanas. Por lo tanto...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran intereses o divulgaciones en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La labor fue apoyada por las subvenciones del proyecto NHMRC (#568728, #150262, #1126929) a MJM.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
de plástico de 2-5 LPara preparar una solución de sacarosa al 10%, si procede
Se recomienda la tablaPlástico
CongeladorPara almacenar alimentos CAF
Comida de mantenimiento para roedoresde Gordon's Gordon's Specialty Stockfeeds (Australia)Dieta de mantenimiento utilizada en nuestro laboratorio (14 kJ/g; 65% de carbohidratos, 13% de grasas y 22% de proteínas, como energía)
Grandes cajasTodos los artículos anteriores se pueden almacenar en contenedores para facilitar el acceso
Cucharapara la preparación de la dieta CAF
MicroondasPara la descongelación de la dieta CAF (cuando sea necesario)
CuchilloPara la preparación de la dieta CAF
Toallade papelImportante para limpiar las superficies de trabajo y el cuchillo durante la preparación de CAF
RecipientesEstos son para pesar los alimentos de CAF en los días de medición
Embudo dePara preparar una solución de sacarosa al 10%, si corresponde
LuzComo la dieta CAF debe refrescarse cerca del inicio de la fase oscura cada día, una luz roja ayudará cuando se trabaje en la oscuridad
Latas de atúnPara presentar los alimentos CAF "más húmedos". Los recipientes de plástico también pueden ser adecuados
Recipiente de pesaje x 3Se deben usar recipientes separados para pesar ratas, comida y biberones, y alimentos CAF
BásculaSe recomienda una sensibilidad de hasta 0,1 g
AzúcarPara una solución de sacarosa al 10%, si corresponde
Botella de cortar de almacenamiento de plástico grande sin dentar de plástico plástico roja de pesaje blanca

Referencias

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