Introducimos un método de análisis cinemático que utiliza un aparato de captura de movimiento tridimensional que contiene cuatro cámaras y software de procesamiento de datos para realizar evaluaciones funcionales durante la investigación fundamental que involucra modelos de roedores.
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Artículo de método
Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos
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Resumen
Resumen
En comparación con el índice funcional ciático (FiSi), el análisis cinemático es un método más confiable y sensible para realizar evaluaciones funcionales de modelos de roedores de lesión del nervio ciático. En este protocolo, describimos un nuevo método de análisis cinemático que utiliza un aparato de captura de movimiento tridimensional (3D) para evaluaciones funcionales utilizando un modelo de lesión por aplastamiento del nervio ciático de rata. En primer lugar, la rata está familiarizada con la pisada. Los marcadores se unen a los puntos de referencia óseos designados y la rata se hace para caminar en la cinta de correr a la velocidad deseada. Mientras tanto, los movimientos posteriores de las extremidades de la rata se graban utilizando cuatro cámaras. Dependiendo del software utilizado, los trazados de marcadores se crean utilizando los modos automático y manual y los datos deseados se producen después de ajustes sutiles. Este método de análisis cinemático, que utiliza un aparato de captura de movimiento 3D, ofrece numerosas ventajas, incluyendo una precisión y precisión superiores. Se pueden investigar muchos más parámetros durante las evaluaciones funcionales integrales. Este método tiene varias deficiencias que requieren consideración: El sistema es caro, puede ser complicado de operar y puede producir desviaciones de datos debido al cambio de piel. Sin embargo, el análisis cinemático utilizando un aparato de captura de movimiento 3D es útil para realizar evaluaciones funcionales de las extremidades anteriores y posteriores. En el futuro, este método puede ser cada vez más útil para generar evaluaciones precisas de diversos traumas y enfermedades.
Introducción
El índice funcional ciático (FiSi) es el método de referencia para llevar a cabo evaluaciones funcionales del nervio ciático1. El SFI ha sido ampliamente adoptado y se utiliza con frecuencia dentro de varios estudios de evaluación funcional sobre lesiones del nervio ciático de rata2,3,4,5,6. A pesar de su popularidad, hay varios problemas con SFI, incluyendo automutilación7,riesgo de contractura conjunta, y manchado de las huellas8. Estos problemas afectan seriamente a su valor pronóstico9. Por lo tanto, se requiere un método alternativo, menos propenso a errores como sustituto de la SFI.
Uno de estos métodos alternativos es el análisis cinemático. Esto incluye un análisis completo de la marcha utilizando marcadores de seguimiento conectados a puntos de referencia óseos o articulaciones. El análisis cinemático se utiliza cada vez más para las evaluaciones funcionales9. Este método se está reconociendo progresivamente como una herramienta fiable y sensible para la evaluación funcional10 sin las deficiencias atribuidas al SFI11,12.
En este protocolo, describimos una serie de análisis cinemáticos que utilizan un aparato de captura de movimiento 3D que consta de una cinta de correr, cuatro cámaras de dispositivoacoplado cargado (CCD) de 120 Hz y software de procesamiento de datos (ver Tabla de materiales). Este método de análisis cinemático difiere del video general a pie o análisis de marcha13,14. Dos cámaras se colocan en diferentes direcciones para grabar los movimientos de las extremidades posteriores desde un solo lado. Posteriormente, se construye un modelo digital 3D de la extremidad posterior utilizando gráficos por ordenador9. Podemos calcular los ángulos articulares designados, como la cadera, la rodilla, el tobillo y la articulación de los dedos de los dedos, recapitulando de cerca las dimensiones reales de las extremidades. Además, podemos determinar varios parámetros como la longitud de zancada/paso y la relación de la fase de postura con la fase de oscilación. Estas reconstrucciones se basan en un modelo digital 3D completamente reconstruido de las extremidades posteriores, generado a partir de datos transmitidos por dos conjuntos de cámaras. Incluso la trayectoria imaginaria del centro de gravedad (CoG) se puede calcular automáticamente.
Utilizamos este aparato de captura de movimiento 3D para introducir y evaluar múltiples parámetros cinemáticos que revelan cambios funcionales a lo largo del tiempo en el contexto del modelo de lesión por aplastamiento del nervio ciático de rata.
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Protocolo
El protocolo fue aprobado por el comité de experimentación animal de la Universidad de Kioto, y todos los pasos del protocolo se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité de Experimentación Animal, Universidad de Kioto (número de aprobación: MedKyo17029).
1. Familiarizar a las ratas con la cinta de correr caminando
- Configure dos láminas de plástico transparentes a ambos lados de la cinta de correr para dejar que una rata Lewis de 12 semanas de edad camine en dirección recta y frontal, y luego encienda la rejilla de descarga eléctrica.
- Que cada rata camine por la cinta de correr. Acelere gradualmente la cinta de correr a la velocidad deseada (20 cm/s o 12 m/min) y deje que la rata camine normalmente a esta velocidad durante 5 minutos. Después de cada sesión de caminata, proporcione un descanso de 1-2 minutos. Repita este proceso 3 veces al día, 5 días por semana, durante 1 semana.
NOTA: Comience la cinta de correr caminando 1 semana antes del paso 2. - Las ratas de la casa en grupos de tres por jaula con un ciclo de 12 h de luz-oscuridad y alimentarlos con alimentos comerciales para ratas y agua del grifo ad libitum.
2. Realizar la lesión por aplastamiento del nervio ciático
- Coloque la rata en una cámara de inducción de anestesia e introduzca una solución para inhalación de isoflurano del 5%.
- Proporcionar una inyección intraperitoneal de un anestésico combinado preparado con 0,15 mg/kg de clorhidrato de medetomidina, 2 mg/kg de midazolam y 2,5 mg/kg de tartrato de butahuol a la rata. Compruebe la falta de reflejos de pedal. A continuación, afeitar un área desde el trocánter más alto izquierdo hasta el medio del muslo con una afeitadora eléctrica.
- Extienda un pedazo de tela aséptica, coloque la rata sobre él y haga que se encuentre en la posición lateral izquierda. Coloque también instrumentos quirúrgicos estériles en el paño.
- Cree una incisión recta desde el trocánter mayor hasta el muslo medio con una cuchilla quirúrgica no 10. A continuación, realice una disección contundente entre el cuádriceps femoris y el bíceps femoris usando un hemostat quirúrgico para exponer el nervio ciático.
- Separar el nervio ciático del tejido circundante con dos pares de microfuerzas y aplastar el nervio ciático durante 10 s, utilizando un hemostat quirúrgico estándar, para crear una lesión de aplastamiento de 2 mm de largo en el sitio directamente debajo de la tuberosidad glútea.
- Realizar una puntada epineural de nylon 9-0 en el extremo proximal de la lesión usando un par de microfólceps y luego cerrar el músculo y la piel con 4-0 suturas de nylon.
- Proporcionar una inyección intraperitoneal de un antagonista anestésico preparado con 0,3 mg/kg de clorhidrato de atipamezol a la rata, para despertarlo en un plazo de 10 minutos. Después de que la rata se recupere de la anestesia, observe los movimientos del dedo del pie izquierdo mientras la rata es suspendida por la base de su cola. Si el dedo del dedo del dedo del morded, la cirugía fue exitosa.
- Aunar las ratas individualmente después de la cirugía con un ciclo de 12 h de luz-oscuridad y alimentarlos con alimentos comerciales para ratas y agua del grifo ad libitum.
3. Colocación de los marcadores
- Coloque la rata entrenada en una cámara de inducción de anestesia e introduzca una solución de inhalación de isoflurano al 5%. Compruebe la falta del reflejo del pedal pellizcando el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dote.
- Permita que la rata sea anestesiada continuamente usando una máscara anestésica (solución para inhalación de isoflurano del 2%). Mientras la rata recibe anestesia estable, ave un área desde la parte inferior de la espalda hasta el maléola bilateral usando una afeitadora eléctrica.
ADVERTENCIA: Para evitar exponer a los investigadores al isoflurano con fugas, asegúrese de que la máscara cubra firmemente la cabeza y la cara de la rata.
NOTA: Para evitar lesiones en la rata, abunda el cabello lo más suavemente posible. - Coloque la rata en la posición propensa. Utilice un rotulador negro para marcar los siguientes puntos de referencia óseos en la piel arasda: Una línea a través de los procesos espinosos desde la lumbar hasta las vértebras sacras, las espinas ilíacas superiores anteriores, los trocánteros mayores, las articulaciones de la rodilla, el maléolo lateral, el quinto articulaciones metatarsofalángicas, y la punta del cuarto dedo del dedo del dedo.
NOTA: La línea a través de los procesos espinosos se utiliza para determinar si los marcadores bilaterales son axialmente simétricos. - Utilice un adhesivo líquido para unir marcadores hemisféricos a estos puntos de referencia óseos, excepto por la línea a través de los procesos espinosos desde la lumbar hasta las vértebras sacras, y la punta del cuarto dedo del pie. Utilice colores distintos para cada otro punto de referencia para evitar confusiones. La punta del cuarto dedo del dedo del dedo del dedo está marcada con tinta rosa.
ADVERTENCIA: Tenga cuidado de no gotear adhesivo sobre la piel expuesta del operador. - Después de colocar todos los marcadores, vuelva a colocar la rata en la jaula. No ponga la rata en la cinta de correr hasta que se recupere completamente de la anestesia.
NOTA: La reducción de la conciencia puede influir seriamente en la marcha normal si la rata no se recupera completamente de la anestesia.
4. Calibración y configuración del software
- Coloque dos láminas de plástico transparentes a ambos lados de la cinta de correr y coloque la caja de calibración en el centro de la cinta de correr. Abra el software de grabación y, a continuación, haga clic en el icono Imagen de calibración en la pantalla (Archivo complementario 1).
- Haga clic en el icono Grabación para grabar de 1 a 2 s de vídeo desde cuatro direcciones utilizando cámaras CCD de 120 Hz. Haga clic en el icono Grabación de nuevo para detener la grabación.
NOTA: El vídeo se guardará automáticamente una vez que se detenga la grabación. - Abra el archivo de vídeo en el software de cálculo. Haga clic y arrastre los puntos característicos de los modelos 3D de la caja de calibración en la esquina inferior derecha de la pantalla a los marcadores correspondientes en las cuatro imágenes, que se transforman automáticamente a partir del vídeo en el patrón de calibración(Archivo complementario 2). A continuación, haga clic en el icono Guardar.
NOTA: No cambie las posiciones de las cámaras una vez completada la calibración.
5. Grabación de la caminata
- Saque la caja de calibración de la cinta de correr, encienda la rejilla de descarga eléctrica y coloque la rata completamente despierta en la cinta de correr. Abra el software de grabación e introduzca la información básica sobre la rata, incluido su número de serie, la velocidad de marcha y el nombre del operador principal.
- Encienda la cinta de correr y ajuste la velocidad a 20 cm/s. Después de que la rata se adapte a la velocidad y sea capaz de caminar normalmente, haga clic en el icono Grabación en la pantalla para grabar la rata que camina con las cuatro cámaras. Una vez que se registren suficientes pasos (>10), haga clic en el icono de nuevo para detener la grabación y apague la cinta de correr.
NOTA: El vídeo se guardará automáticamente una vez que se detenga la grabación. - Vuelva a colocar la rata en la cámara de inducción de anestesia para anestesia. Mientras la rata está bajo anestesia continua (administrada a través de la máscara anestésica), retire los marcadores hemisféricos.
NOTA: Retire los marcadores tan suavemente como sea posible para evitar causar dolor a la rata. - A la hora designada (por ejemplo, 1 semana, 3 semanas o 6 semanas después de la cirugía), realice la medición cinemática en la rata repitiendo los pasos 3.1–5.3. Realice la medición cinemática sólo una vez, al principio del experimento, para las ratas que no recibieron cirugía (es decir, el grupo de control).
6. Rastreo de marcadores
- Abra el software de cálculo y abra el archivo de vídeo en la interfaz.
- Haga clic y arrastre la barra de control bilateral en la barra de progreso del vídeo para asegurarse de que solo se muestra un registro de recorrido de la cinta de correr de 10 pasos(Archivo complementario 3). Haga clic y arrastre cada punto característico desde el modelo 3D en la esquina inferior derecha de la pantalla hasta el marcador correspondiente en cada una de las cuatro imágenes iniciales de los vídeos que fueron tomadas por las cámaras(Archivo complementario 4).
- Haga clic en el icono Seguimiento automático para iniciar el proceso de seguimiento automático de marcadores(Archivo suplementario 5, Archivo complementario 6). Si el sistema no traza con precisión un marcador, haga clic en el icono Digitalizar manualmente para cambiar al modo de seguimiento manual(Archivo complementario 7), haga clic en el punto de característica de seguimiento en el modelo 3D y, a continuación, en el marcador de respuesta en la imagen.
- Una vez que se hace clic en el marcador, asegúrese de que la imagen cambia al siguiente fotograma del vídeo. Ahora haga clic continuamente en el marcador hasta que se complete el proceso de seguimiento de marcadores. Una vez terminado, haga clic en el icono Guardar.
7. Análisis cinemático
- Abra el software de análisis y, a continuación, abra el archivo de vídeo procesado en la interfaz.
- Haga clic en el icono Configuración y seleccione y agregue parámetros designados como el ángulo del tobillo, el ángulo del dedo del pie y el desplazamiento pélvico (ejes X y Z) a la Lista de visualización en la ventana emergente de la derecha (Archivo complementario 8). Haga clic en Aceptar, para que las curvas que representan los cambios de valor en los parámetros aparezcan en la interfaz.
- Haga clic en el icono Medición y seleccione Procesamiento suave en su menú desplegable. Introduzca 20 Hz en la ventana emergente para eliminar frecuencias superiores a 20 Hz dentro de las curvas(Archivo complementario 9).
- Asegúrese de que hay cinco paneles en la interfaz: el vídeo a pie de la rata, el modelo 3D dinámico, curvas que representan cambios de valor en los parámetros del ciclo de 10 pasos, curvas que representan cambios de valor medio en los parámetros, e histogramas y diagramas esquemáticos que representan la relación de la posición y la fase de oscilación(Archivo suplementario 10).
- Haga clic con el botón derecho en el panel para las curvas que representan los cambios de valor medio en los parámetros y seleccione Salida de datos en el menú desplegable (Archivo suplementario 11). Esto producirá los valores medios de los ángulos de las articulaciones de las extremidades posteriores, incluidos los ángulos del tobillo y del dedo del pie, el desplazamiento pélvico y cualquier otro parámetro deseado en los períodos de ciclo de 10 pasos.
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Resultados
Seleccionamos cuatro parámetros para investigar los cambios funcionales a lo largo del tiempo en un modelo de lesión de aplastamiento del nervio ciático de rata. Estos fueron la relación entre la fase de posición a oscilación, la trayectoria del centro de gravedad (CoG), los ángulos del tobillo y los ángulos de los dedos del pie en la fase9de los dedos del pie. Veinticuatro ratas fueron asignadas aleatoriamente a uno de los cuatro grupos: el grupo de control (C), las ratas en la primera (1w), la t...
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Discusión
En este protocolo, una rata estable y continuamente caminante es el componente más vital del análisis cinemático. La velocidad de la cinta de correr se estableció en 20 cm/s. Esta velocidad de marcha no se considera de ninguna manera "alta" si las ratas se mueven sin restricciones de espacio16. Sin embargo, esta velocidad es demasiado rápida para que las ratas no entrenadas caminen fácilmente en la cinta de correr y probablemente resultaría en una marcha anormal y movimientos no uniformes. Estos e...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Number JP19K19793, JP18H03129 y JP18K19739.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sutura de nylon 9-0 | Bear Medic Corporation. | T06A09N20-25 | |
| Aparato anestésico para animales pequeños | SHINANO MFG CO., LTD. | SN-487-0T | |
| Solución de inhalación de isoflurano | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Analizador de Kine | KISSEI COMTEC CO., LTD. | N.D. | Un software de análisis |
| Adhesivo líquido | KANBO PRAS CORPORATION | PT-B180 | |
| Micro pinzas | BRC CO. | Grabadora de | |
| movimiento | 16171080 KISSEI COMTEC CO., LTD. | N.D. | Un software de grabación |
| hemostático quirúrgico estándar | Fine Science Tools, Inc. | 12501-13 | |
| Cuchilla quirúrgica No.10 | FEATHER Safety Razor CO., LTD | 100D | |
| Hemostático quirúrgico | World Precision Instruments | 503740 | |
| Aparato de captura de movimiento tridimensional (KinemaTracer para animales) | KISSEI COMTEC CO., LTD. | N.D. | Un sistema de análisis de movimiento en 3D que consta de cámaras |
| Calculadora tridimensional (3D) | KISSEI COMTEC CO., LTD. | N.D. | Un software de rastreo de marcadores |
| Cinta de correr | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | una cinta de correr con el schocker eléctrico afiliado, vainas transparentes y un aparato de control de velocidad |
Referencias
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