Summary
सह संस्कृति बातचीत इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परख सस्ती, उच्च throughput, और सरल कर रहे हैं. इन परखसह संस्कृति में माइक्रोबियल बातचीत का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बातचीत पैटर्न की पहचान, और मानव और पर्यावरण रोगजनकों के खिलाफ ब्याज की एक माइक्रोबियल तनाव की निरोधात्मक क्षमता की विशेषता.
Abstract
सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के अध्ययन ने माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में अंतर्दृष्टि के लिए उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल से लेकर कई खोजों को प्रेरित किया है। माइक्रोबियल बातचीत के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया कई दृष्टिकोण विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और महंगे और समय गहन कर रहे हैं। इस कागज सह संस्कृति बातचीत assays कि सस्ती हैं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, बड़े नमूना संख्या के लिए स्केलेबल, और आसानी से कई प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अनुकूलनीय. सूक्ष्मजीवों को एक साथ सुसंस्कृत किया जाता है, जिसमें प्रत्येक अच्छी तरह से सूक्ष्मजीवों के एक युग्मवार संयोजन का प्रतिनिधित्व करता है। एक परीक्षण जीव प्रत्येक अच्छी तरह से एक तरफ सुसंस्कृत और पहले मोनोकल्चर में incubated है. बाद में, लक्ष्य जीवों को एक साथ एक 3 डी मुद्रित टीका टिकट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से विपरीत पक्ष पर टीका लगाया जाता है। सह संस्कृति के बाद, पूरा परख इस तरह के विकास या निषेध के रूप में दृश्य phenotypes, के लिए रन बनाए हैं. इन परख phenotypes की पुष्टि या ब्याज के अलग के बीच पैटर्न की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस सरल और प्रभावी विधि का उपयोग करके, उपयोगकर्ता सूक्ष्मजीवों के संयोजन का तेजी से और कुशलता से विश्लेषण कर सकते हैं। यह सह-संस्कृति दृष्टिकोण एंटीबायोटिक खोज के साथ-साथ संस्कृति-आधारित माइक्रोबायोम अनुसंधान पर लागू होता है और पहले से ही दोनों अनुप्रयोगों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा चुका है।
Introduction
प्रकृति में, सूक्ष्मजीवों शायद ही कभी अलगाव में मौजूद हैं; फलस्वरूप, वे लगातार अन्य जीवों के साथ बातचीत कर रहे हैं. इसलिए, अध्ययन कैसे सूक्ष्मजीवों एक दूसरे के साथ बातचीत माइक्रोबियल व्यवहार1की एक भीड़ को समझने के लिए आवश्यक है। सूक्ष्मजीवी बातचीत पारस्परिक, commensal, या विरोधी हो सकता है. ये क्षेत्र न केवल सूक्ष्मजीवों को ही प्रभावित कर सकते हैं बल्कि उन वातावरणों को भी प्रभावित कर सकते हैं और यह मेजबान भी कर सकते हैं कि सूक्ष्मजीव1,2उपनिवेश बनाते हैं .
कई वैज्ञानिक नए एंटीमाइक्रोबियल अणुओं की पहचान करने के लिए माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन करते हैं। माइक्रोबियल इंटरैक्शन के अध्ययन के माध्यम से पहला नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण एंटीमाइक्रोबियल अणुओं में से एक पाया गया। सर अलेक्जेंडर फ्लेमिंग ने एक दूषित पेनिसिलियम एसपीपी का अवलोकन किया जो एक स्टेफिलोकोकस तनाव के विकास को बाधित करता है, जिसके कारण सामान्य रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबायोटिक पेनिसिलिन3की खोज हुई। सूक्ष्मजीवों द्वारा अपने प्रतिस्पर्धियों का विरोध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तंत्रों का अभिलक्षण एंटीमाइक्रोबियल अणुओं की खोज के लिए एक उपयोगी संसाधन बना हुआ है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया था कि Streptomyces sp. तनाव Mg1 एंटीबायोटिक linearmycins, जो बैसिलस subtilis4के खिलाफ एक lytic और अपमानजनक गतिविधि है पैदा करता है.
इसके अलावा, एक गैर ribosomally संश्लेषित पेप्टाइड lugdunin नाम हाल ही में अवलोकन के बाद पता चला था कि नाक commensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus ऑरियस5को रोकताहै. अध्ययनों से यह भी पता चला है कि सूक्ष्मजीवों के बीच पारस्परिक संबंध एंटीमाइक्रोबियल अणुओं की खोज के लिए विरोधी बातचीत के समान रूप से शक्तिशाली हैं। उदाहरण के लिए, जनजाति Attini में कई कवक खेती चींटियों सहजीवी बैक्टीरिया उनके एक्सोस्केलेटन पर Peudonocardia कहा जाता है कि उनके कवक फसल6के एक अविकल्पी रोगज़नक़ को बाधित करने के लिए एंटीफंगल अणुओं का उत्पादन . चूंकि माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन एंटीमाइक्रोबियल अणुओं की खोज के लिए फायदेमंद रहा है, उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के उपयोग से नए एंटीमाइक्रोबियल अणुओं की खोज हो सकती है।
लागत और प्रदर्शन में आसानी के संबंध में, माइक्रोबियल बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल के तरीके सरल से जटिल करने के लिए सीमा। उदाहरण के लिए, एक agar प्लग परख एक सस्ती और सरल तरीका है कि कई सूक्ष्मजीवों7के बीच विरोध की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, एक agar प्लग परख एक कुशल प्रक्रिया नहीं है और कई pairwise संयोजन के लिए श्रम गहन हो सकता है. एक उच्च थ्रूपुट तरीके से ब्याज के लक्ष्य पर माइक्रोबियल उत्पादित उत्पादों के प्रभाव का आकलन करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं डिस्क प्रसार assays8का उपयोग करें। ये परख आसान और सस्ती होती है और 7नमूनोंकी अधिक संख्या के लिए स्केलेबल हो सकती है . हालांकि, इस परख माइक्रोबियल अर्क के उत्पादन की आवश्यकता है और लक्ष्य जीवों और एंटीबायोटिक दवाओं के कुछ संयोजनों के लिए भ्रामक परिणाम पैदा कर सकता है, जैसे साल्मोनेला और सेफलोस्पोरिन9.
पूर्ववर्ती दृष्टिकोण सूक्ष्मजीवों को एक दूसरे के साथ बातचीत करने की अनुमति देने के बजाय, लक्ष्य जीव में एक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए अलग-अलग घटकों पर निर्भर करते हैं। यह नोट का है क्योंकि रोगाणुओं के बीच बातचीत "क्रिप्टिक" एंटीमाइक्रोबियल अणुओं कि मोनोकल्चर में उत्पादित नहीं कर रहे हैं के उत्पादन को प्रकाश में लाना हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया था कि एंटीमाइक्रोबियल कीकिन केवल माइक्रोमोनोस्पोरा एसपी द्वारा उत्पादित होता है जब एक रोडोकोकस एसपी के साथ सह-संस्कृत होता है जो एक ही स्पंज माइक्रोबायोम10से अलग होता है। अधिक जटिल बातचीत के तरीके इस संभावित मोनोकल्चर बाधा को दरकिनार. उदाहरण के लिए, iChip दुर्लभ और पर्यावरण के नमूनों से बैक्टीरिया खेती करने के लिए मुश्किल अलग करने के लिए उपयोगी है और situ11में वृद्धि के माध्यम से माइक्रोबियल बातचीत के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. विस्तार से बातचीत की जांच करने के लिए, मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर desorption/ionization समय की उड़ान इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF-IMS) इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण उच्च स्थानिक संकल्प के साथ माइक्रोबियल कालोनियों बातचीत द्वारा उत्पादित छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स की संरचना और वितरण पर विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। मालदी-टीओएफ-आईएमएस का प्रयोग जीवाणु पारस्परिक क्रियाओं के अनेक अध्ययनों में भी किया गया है ताकि प्रतियोगिता के तंत्र की विशेषता12,13,14,15की होती है . हालांकि, MALDI-TOF-IMS अक्सर परिश्रमी नमूना तैयारी की आवश्यकता है, विशेष विशेषज्ञता उपकरण संचालित करने के लिए, और महंगा और विशेष बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर. इन कारणों के लिए, यह एक कठिन तकनीक के लिए उच्च throughput अध्ययन के लिए उपयोग है. इस प्रकार, माइक्रोबियल बातचीत के लिए एक सरल, स्केलेबल, और उच्च थ्रूपुट सह-संस्कृति परख जो उपरोक्त दृष्टिकोणों की कई सीमाओं को पार कर जाती है, फायदेमंद होगी।
यहाँ, उच्च थ्रूपुट माइक्रोबियल सह संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इस परख सरल और आसानी से माइक्रोबियल बातचीत के preexisting अध्ययन में शामिल है. माइक्रोबियल बातचीत के अध्ययन के लिए कई आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के विपरीत, हमारी विधि सरल, सस्ती है, और बातचीत की बड़ी संख्या की जांच करने के लिए सक्षम है. ये परख न केवल प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन सामग्री व्यापक रूप से सबसे प्रयोगशाला आपूर्तिकर्ताओं या सार्वजनिक संसाधनों (जैसे, पुस्तकालयों और makerspaces) से उपलब्ध हैं. नतीजतन, यह परख सूक्ष्मजीवों के कई युग्मवार संयोजनों के बीच दिलचस्प पैटर्न की पहचान करने और पार्स करने के लिए जांच की पहली पंक्ति के रूप में फायदेमंद है, जो माइक्रोबियल पारिस्थितिकी की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है।
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Protocol
दाता के माता-पिता से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, और विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में मानव विषय समिति ने अध्ययन को मंजूरी दे दी (संस्थागत समीक्षा बोर्ड [IRB] अनुमोदन संख्या एच-2013-1044)।
1. नमूना संस्कृति
नोट: इस प्रक्रिया को यहाँ मानव नाक गुहा से अलग बैक्टीरिया के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. सिद्धांत रूप में, निम्न लिखित विधियों किसी भी संस्कृति की स्थिति के लिए लागू होते हैं। मस्तिष्क-हृदय-इंफ्यूजन शोरबा (बीएचआई) नाक बैक्टीरिया के सामान्य संचरण के लिए प्रयोग किया जाता है। सभी प्लेटों 1.5% agar का उपयोग कर जम रहे हैं. इस अध्ययन के लिए, नमूने नमकीन समाधान से लिया जाता है एक दाता की नाक में निकाल दिया (नासा lavage), microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित, और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए.
- मानक संस्कृति तकनीकों का उपयोग करने के लिए BHI प्लेटों पर thawed lavage नमूनों में से प्रत्येक के 100 $L प्लेट.
- प्लेटों को 1 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एयरोबेबाइट इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, प्रति प्लेट प्रत्येक अलग-अलग मॉर्फोटाइप की 2 कालोनियों का चयन करें और बीआईआई प्लेट पर एयरोबायली रूप से एक कॉलोनी को एक नई BHI प्लेट पर लकीरें और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करके अलग-अलग कर दें। दोहराएँ जब तक जीवाणु संस्कृतियों शुद्ध कर रहे हैं.
नोट: बैक्टीरियल आइसोलेट की पहचान कॉलोनी आकारिकी, ग्राम दाग, 16S आरएनए जीन अनुक्रमण, या किसी अन्य विधि के माध्यम से की जा सकती है। हालांकि, प्रोटोकॉल को जारी रखने के लिए अलग पहचान जानने के लिए आवश्यक नहीं है। - Cryopreserve सभी बैक्टीरियल आइसोलेट्स -80 डिग्री सेल्सियस पर 50% ग्लिसरॉल के 1 एमएल के संयोजन के बाद 1 एमएल बैकिंग के साथ 1 एमएल बैक्टीरियल रातभर संस्कृति (क्रायोट्यूब में अनुभाग 3 देखें)।
2. 3 डी मुद्रण टिकटों
नोट: पॉलीकार्बोनेट को अपने उच्च कांच संक्रमण तापमान (147 डिग्री सेल्सियस) के कारण मुद्रांकन सामग्री के रूप में चुना गया था जो मानक ऑटोक्लेव तापमान (121 डिग्री सेल्सियस) से अधिक है, जो बार-बार उपयोग के बाद विरूपण की क्षमता को कम करता है।
- पॉली कार्बोनेट फिलामेंट के साथ 3 डी प्रिंटर लोड करें।
- आसंजन में सहायता और प्रिंट के दौरान टीका टिकट के warping को कम करने के लिए प्रिंट बिस्तर पर सफेद स्कूल गोंद (polyvinyl एसीटेट) लागू करें।
- लोड करें. STL मॉडल फ़ाइल (अनुपूरक डेटा फ़ाइल) टीका टिकट के लिए ( चित्र1) 3 डी प्रिंटर सॉफ्टवेयर में.
- एक 290 डिग्री सेल्सियस नोजल तापमान, 60 डिग्री सेल्सियस बिस्तर तापमान, और 0.38 मिमी की परत ऊंचाई पर टीका टिकट प्रिंट।
- एल्यूमीनियम पन्नी में टिकट लपेटें और सुखाने के 15 मिनट के साथ एक गुरुत्वाकर्षण चक्र पर 1.5 एच के लिए autoclaving द्वारा बाँझ.
नोट: हालांकि पॉलीकार्बोनेट हाइग्रोस्कोपिक है, टिकटों में ऑटोक्लेविंग के बाद केवल लगभग 0.5% पानी का वजन बरकरार है।
3. रात भर की संस्कृति की तैयारी
- एक serological pipette का उपयोग करना, 14 एमएल संस्कृति ट्यूबों में बाँझ BHI शोरबा के 3 एमएल पिपेट.
- एक बाँझ 1 जेडएल टीका पाश का उपयोग करना, शोरबा में एक जीवाणु कॉलोनी टीका. झुरमुट शोरबा में फैलाने के लिए लूप को घुमाते हैं। ऊष्मायन से पहले संस्कृति ट्यूबों को संक्षेप में भंवर।
- 250 आरपीएम पर एक शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस रात ($16 ज) पर संस्कृति ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
- भंवर कोशिकाओं के clumps को तोड़ने के लिए एक बार जीवाणु संस्कृतियों पर्याप्त turbidity तक पहुँचने (ओडी600 $ 1).
4. Bioassay प्लेट्स की तैयारी
नोट: बंध्यता बनाए रखने के लिए एक स्तरीय प्रवाह हुड में बायोएसे प्लेटतैयार की जाती हैं।
- 1.5% agar के साथ BHI मीडिया तैयार करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार autoclaving द्वारा बाँझ।
- ऑटोक्लेविंग के बाद, तापमान नियंत्रित पानी के स्नान में BHI मीडिया को 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
- एक सीरम संबंधी पिपेट का उपयोग करना, एक 12 अच्छी तरह से थाली पर 12 कुओं में से प्रत्येक में पिघला हुआ BHI मीडिया के पिपेट 3 एमएल. सुनिश्चित करें कि कुओं के रूप में सटीक और यहां तक कि संभव के रूप में कर रहे हैं. मीडिया के एक लीटर $ 27 bioassay प्लेटें उपज जाएगा.
- आगर को रात भर सेट करने दें।
5. टेस्ट जीव के साथ Bioassay प्लेट्स टीका
नोट: एक परीक्षण जीव उस जीव को संदर्भित करता है जिसके लिए निरोधात्मक गतिविधि (जैसे, एंटीबायोटिक उत्पादन) का उत्पादन सह-संस्कृति बातचीत परख का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। इस प्रयोग के लिए, परीक्षण जीव Actinobacteria नाक lavages नमूने से अलग कर रहे हैं.
- रात भर की संस्कृति में एक बाँझ 10 डिग्री सेल्सियस पाश डालने और अच्छी तरह से एक थाली के बाएं तिहाई पर एक संस्कृति छोटी बूंद लकीर द्वारा एक bioassay प्लेट पर परीक्षण जीव टीका.
नोट: यह केवल अच्छी तरह से एक तिहाई लकीर की सिफारिश की है, के रूप में अच्छी तरह से अधिक वृद्धि लक्ष्य जीवों के बाद टीका निषेध करता है. - दोहराएँ जब तक थाली पर सभी 12 कुओं परीक्षण जीव के साथ टीका लगाया गया है.
- 7 दिनों के लिए उचित तापमान पर उल्टा इनक्यूबेट प्लेटें। उच्च तापमान ($37 डिग्री सेल्सियस) या शुष्क जलवायु में, प्लेटों को एक आर्द्र कंटेनर में स्टोर करें ताकि प्लेटों को सूखने से रोका जा सके।
6. लक्ष्य जीवों की तैयारी
नोट: एक लक्ष्य जीव उस जीव को संदर्भित करता है जिसकी संदमन स्थिति सह-संस्कृति अन्योन्यक्रिया परख का उपयोग करके निर्धारित की जाती है. इस प्रयोग के लिए, लक्ष्य जीव स्टेफिलोकोकस एसपी हैं। नाक के लावेज नमूनों से अलग।
- 6 दिनों के लिए bioassay प्लेटें incubating के बाद, निर्दिष्ट लक्ष्य जीवों की रात भर संस्कृतियों तैयार, जैसा कि ऊपर किया गया है (खंड 3 देखें).
7. लक्ष्य जीव टीका
नोट: रात भर ऊष्मायन के बाद, सुनिश्चित करें कि संस्कृतियों अशांत हैं (ओडी600 $ 1).। कुछ जीवाणु संस्कृतियों संस्कृति ट्यूब के तल पर flocculate हो सकता है. भंवर संस्कृति ट्यूबों clumps फैलाने और संस्कृति turbidity का आकलन करने के लिए।
- बी.आई.आई. के 1.8 एमएल और लक्ष्य रात भर संस्कृति के 200 डिग्री एल के साथ एक खाली 12 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरकर लक्ष्य प्लेट तैयार करें।
- खोलना और लक्ष्य प्लेट में एक बाँझ टीका टिकट जगह है. धीरे से कुओं में चारों ओर संस्कृतियों घूमता है, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि संस्कृतियों पड़ोसी कुओं दूषित पार नहीं है.
- टीका टिकट लिफ्ट और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक टिकट टिप पर पतला लक्ष्य संस्कृति की एक बूंद है.
-
एक uninoculated bioassay प्लेट पर टीका टिकट रखकर एक मोनोकल्चर नियंत्रण प्लेट तैयार करें और धीरे से टिकट रॉक इतना है कि एक संस्कृति ड्रॉप प्रत्येक अच्छी तरह से inoculates. एक बार टीका टिकट हटा दिया जाता है, संस्कृति की एक बूंद bioassay प्लेट के कुओं में दिखाई देना चाहिए.
- यदि किसी भी कुओं मीडिया के असमान स्तर के कारण टीका टिकट के साथ टीका नहीं कर रहे हैं, एक पिपेट का उपयोग कुओं के दाईं ओर पतला रात भर संस्कृति के 3 डिग्री एल हाजिर.
- ऊपर किया के रूप में bioassay प्लेटों टीका (चरण 7.4.1 देखें), लेकिन टिकट संरेखित इतना है कि युक्तियाँ 12 अच्छी तरह से थाली के दाईं ओर के साथ संरेखित करें. सुनिश्चित करें कि कुओं को टीका लगाते समय स्टाम्प मौजूदा जीवाणु कॉलोनी से संपर्क न करता है।
- ध्यान से टिकट निकालें और लक्ष्य प्लेट में वापस जगह है।
- प्रत्येक बायोसाय प्लेट के लिए टीका दोहराएँ जब तक सभी प्लेटें टीका कर रहे हैं.
- 7 दिनों के लिए उचित तापमान पर उल्टा इनक्यूबेट बायोएसे प्लेट्स।
8. स्कोरिंग
-
1 सप्ताह के लिए परीक्षण और लक्ष्य जीवों को सह-परिरंधते के बाद, निम्नलिखित दृश्य मूल्यांकन के आधार पर बातचीत स्कोर:
- लक्ष्य जीव विकास के साथ कुओं को स्कोर करें जो विकास को दर्शाती है जो मोनोकल्चर नियंत्रण से "0" (कोई अवरोध नहीं) के रूप में निर्विवाद है (चित्र 2ए,बी)।
- लक्ष्य जीव के साथ कुओं स्कोर है कि "1" (कमजोर निषेध) के रूप में नियंत्रण की तुलना में कम विकास दर्शाती है (चित्र 2ग).
- उन कुओं को स्कोर करें जहां लक्ष्य जीव "2" (मजबूत अवरोध)(चित्र 2छ)के रूप में विकसित नहीं हुआ था।
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Representative Results
सह संस्कृति बातचीत परख माइक्रोबियल बातचीत को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ब्याज के पैटर्न की पहचान, और पेचीदा गतिविधियों के साथ माइक्रोबियल अलग को उजागर. इन परखों में, एक परीक्षण जीव एक 12 अच्छी तरह से आगर प्लेट के एक तरफ monocultured और 7 दिनों के लिए incubated है. बाद में, एक लक्ष्य जीव परीक्षण जीव के बगल में देखा जाता है और दो रोगाणुओं को लक्ष्य जीव के विकास phenotype के लिए स्कोरिंग से पहले 7 दिनों के लिए सह-संस्कृत किया गया था। परख विकास या लक्ष्य जीव के निषेध के एक दृश्य विश्लेषण के आधार पर रन बनाए जाते हैं.
इन सह-संस्कृति परखों का उपयोग हाल ही में मानव नाक गुहा से अलग किए गए एक्टिनोबैक्टीरिया (परीक्षण जीवों) की निरोधात्मक गतिविधि का आकलन करने के लिए किया गया था .(लक्ष्य जीव) मानव नाक गुहा से अलग (चित्र 2)16. सह-संस्कृति परख ोंय का उपयोग एक्टिनोबैक्टीरिया (एन जेड 21) और स्टैफिलोकोकस आइसोलेट्स (एन जेड 39) के बीच विशिष्ट अवरोध पैटर्न की पहचान करने के लिए किया गया था और यह दिखाया गया कि एक्टिनोबैक्टीरिया आइसोबैक्टीरिया को अलग-अलग लोगों ने कोगागुलास-नकारात्मक को बाधित करने की उनकी क्षमता में भिन्नता दिखाई है। स्टैफिलोकोसी (कोएनएस)। कुल 812 युग्मवार संयोजनों का परीक्षण किया गया। विशेष रूप से, कोरिनेबैक्टीरियम प्रोपिनक्यूम दृढ़ता से कोन्स (चित्र 2डी) को विशेष रूप से अन्य कोरिनेबैक्टीरियम की तुलना में , जो कमजोर रूप से बाधित कोन्स (चित्र 2सी) या कोन्स पर कोई प्रभाव नहीं डालता है ( चित्र 2ठ, और एककृषि नियंत्रण की तुलना में ( चित्र2क)16.
तुलनात्मक जीनोमिक्स का उपयोग करते हुए, साइडरोफोर उत्पादन के लिए एक जैव संश्लेषी जीन क्लस्टर की पहचान सी प्रोपिनक्यूम जीनोम में की गई जो अन्य कोरिनेबैक्टीरियम के जीनोम में अनुपस्थित थे16. साइडोफोर्स सूक्ष्मजीवों द्वारा पर्यावरण से लोहे की सफाई करने के लिए उत्पादित chelrophors हैं17. सी प्रोपिनक्यूम द्वारा साइडरोफोर उत्पादन की पुष्टि की गई थी और साइडरोफोर की पहचान डीहाइड्रॉक्सीनोकार्डामाइन16के रूप में की गई थी। इस परिणाम के परिणामस्वरूप यह परिकल्पना हुई कि कोन्स का अवरोध साइडरोफोर-मध्यस्थ लोहे की कमी के कारण हुआ। बाद में, मानक और लौह-पूरक BHI माध्यम पर सी प्रोपिनक्यूम और कोन्स के बीच सह-संस्कृति संपर्क परख करके, यह निर्धारित किया गया था कि अवरोध फीनोटाइप लौह-निर्भर था (चित्र 2ई)। साथ में, इन परिणामों का सुझाव दिया है कि siderophore-मध्यस्थ लोहे की कमी C. propincuum16द्वारा CoNS के मजबूत निषेध के लिए जिम्मेदार था.
चित्र 1: bioassay टीका टिकट की तस्वीर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: सह-संस्कृति बातचीत परखों को उजागर siderophore-मध्यस्थ कोन्स के कोरिनेबैक्टीरियम प्रोपिनक्यूमद्वारा निषेध | (क)कोन्स (लक्ष्य जीव) की मोनोकल्चर एक भी बायोसाय प्लेट पर टीका लगाया गया है। (बी, सी, डी) Corynebacterium spp के विभिन्न उपभेदों के बीच सह-संस्कृति (परीक्षण जीव, बाएँ) और CoNS के एक ही तनाव (लक्ष्य जीव, दाएँ) BHI bioassay प्लेटों पर inoculated. प्रत्येक पैनल एक प्रतिनिधि छवि के साथ बातचीत दिखा रहा है (बी) कोई संकोच (स्कोर $ 0), (सी) कमजोर निषेध (स्कोर ] 1 ), या (डी) मजबूत निषेध (स्कोर ] 2). (ई) कोरिनेबैक्टीरियम स्यूडोडिफ्थेरिटिकम (साइडरोफोर गैर-निर्माता) या कोरिनेबैक्टीरियम प्रोपिनक्यूम (साइडरोफोर उत्पादक) के बीच बातचीत की तुलना भी मीडिया (बीएचआई) और भी मीडिया पर कोन्स के समान तनाव के साथ 200 डिग्री एम FeCl3 (BHI + लोहा) के साथ पूरक. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक डेटा फ़ाइल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एंटीबायोटिक्स और अन्य माध्यमिक चयापचयों कि मध्यस्थता माइक्रोबियल बातचीत दवा की खोज सहित अनुप्रयोगों की एक भीड़ के लिए उपयोगी होते हैं. इसमें, माइक्रोबियल बातचीत की बड़ी संख्या का आकलन करने के लिए सह-संस्कृति परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। ये सह-संस्कृति संपर्क परख एक सरल, सस्ती, स्केलेबल, और उच्च थ्रूपुट का अर्थ है सूक्ष्मजीवों के कई युग्मों के संयोजन ों की जांच करना। लक्ष्य जीवों को एक टीका मोहर का उपयोग करके 12 अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में जीवों का परीक्षण करने के बगल में देखा जाता है, और लक्ष्य जीवों का निषेध लक्ष्य जीव के फीनोटाइप के दृश्य निरीक्षण के आधार पर बनाया जाता है। इन परख में इस्तेमाल सामग्री के बहुमत सबसे प्रयोगशाला आपूर्तिकर्ताओं के माध्यम से या सार्वजनिक संसाधनों के माध्यम से आसानी से उपलब्ध हैं. इसलिए, परख आसानी से कई प्रयोगशाला वातावरण के अनुरूप किया जा सकता है. प्रयोगशाला में, ये सह-संस्कृति परख विभिन्न प्रकार के वातावरण से कई मेजबानों के साथ जुड़े सूक्ष्मजीवों की बातचीत की जांच करने में सफल रहे हैं।
जबकि इस तकनीक के लिए कई लाभ कर रहे हैं, वहाँ भी कुछ सीमाएं हैं. पहली उल्लेखनीय सीमा यह है कि सह संस्कृति परख से पैटर्न अन्य मेटाडाटा के बिना व्याख्या करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. हाल ही में दो पत्रों में है कि इन सह संस्कृति assays16,18कार्यरत हैं, ब्याज की निषेध पैटर्न केवल अन्य मेटाडाटा के साथ संयोजन के रूप में पहचान की गई, इस तरह के परीक्षण जीवों की वर्गीकरण पहचान के रूप में. फिर भी, मेटाडेटा के साथ बिना, इस पेपर में उल्लिखित तरीके विशिष्ट रोगजनकों या ब्याज के सूक्ष्म जीवों को लक्षित करने के लिए निरोधात्मक गतिविधि के साथ जीवाणु अलग की पहचान करने के लिए सक्षम हैं।
एक अतिरिक्त सीमा यह है कि इन परख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, और bioassay प्लेटें हाथ से तैयार किया जाना चाहिए, जो परख की दक्षता को सीमित कर सकते हैं. प्लेट तैयार करने के प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है, और ध्यान रखना चाहिए, जबकि प्लेटें तैयार. यदि कुएँ असमान हैं, तो टीका टिकट सभी कुओं को टीका नहीं लगा सकता है। हालांकि, चूक कुओं बस सीधे प्रत्येक uninoculated अच्छी तरह से के सही पक्ष पर लक्ष्य जीव संस्कृति pipeting द्वारा टीका किया जा सकता है. वास्तव में, भले ही प्रत्येक प्लेट पर कुछ कुओं टिकट से याद कर रहे हैं, प्रक्रिया अभी भी हर एक अच्छी तरह से में लक्ष्य जीव pipeting से अधिक कुशल है. वैकल्पिक रूप से, उपयोगकर्ताओं को टीका टिकट और प्रत्येक अच्छी तरह से लक्ष्य जीव pippette माफ कर सकते हैं, लेकिन इस प्रक्रिया को और अधिक समय लेने वाली है, विशेष रूप से एक साथ 12 कुओं मुद्रांकन की तुलना में.
अंत में, परीक्षण जीव लक्ष्य जीव टीका है इससे पहले कि मोनोकल्चर के दौरान अच्छी तरह से में उपलब्ध पोषक तत्वों का उपभोग कर सकते हैं। हालांकि पोषक तत्वों की कमी मनाया निषेध पैटर्न को प्रभावित कर सकते हैं, यह जोड़ीवार संयोजन है कि इस प्रकार अब तक परीक्षण किया गया है के बीच असामान्य प्रतीत होता है. विशेष रूप से, सी प्रोपिनक्यूम द्वारा कुओं में लोहे की कमी मानव नाक माइक्रोबायोटा16के सदस्यों से साइडरोफोर-मध्यस्थ प्रतियोगिता की खोज के लिए अनुमति दी।
ये सह-संस्कृति संपर्क परख ें मीडिया संरचना, समय, या यहां तक कि परीक्षण जीव के रूप में कई जीवों या माइक्रोबियल consortia सहित संशोधित करके अनुकूलन कर रहे हैं. इसके अलावा, विभिन्न स्कोरिंग प्रणालियों विस्तार के वांछित स्तर के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता बातचीत phenotype का वर्णन करने के लिए आवश्यक. उदाहरण स्कोरिंग तराजू में 0-2 से उन लोगों को शामिल किया गया है जो मानव नाक गुहा16 से अलग बैक्टीरिया के बीच प्रतिस्पर्धी बातचीत का वर्णन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं (चित्र 2) और 0-3 से स्ट्रेप्टोमाइसी जों की एंटीमाइक्रोबियल क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है कीट माइक्रोबायोम से अलग18| हालांकि, अधिक सूक्ष्म तराजू के साथ, स्कोरिंग तेजी से मुश्किल हो जाता है। इस प्रकार, निषेध सबसे आसानी से एक द्विआधारी स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर मान्यता प्राप्त है (जैसे, 0 कोई निषेध और निषेध के रूप में 1 के रूप में परिभाषित किया गया है), जो किसी भी भ्रम को खत्म करने और कई व्यक्तियों में स्कोरिंग मानकीकरण कर सकते हैं. इसके अलावा, निषेध phenotypes के लिए स्कोरिंग के अलावा, इन परख भी वर्णक उत्पादन, sporulation, या नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है कि किसी भी अन्य phenotype सहित अन्य phenotypes के लिए रन बनाए जा सकते हैं. के रूप में इन परख लक्ष्य जीव के दृश्य निरीक्षण के आधार पर विश्लेषण के साथ अत्यधिक स्केलेबल हैं, मशीन सीखने एल्गोरिदम के लिए प्रशिक्षण सेट phenotype स्कोरिंग की सुविधा के लिए उत्पन्न किया जा सकता है और आगे परख थ्रूपुट वृद्धि.
इन सह संस्कृति परख की एक प्रमुख ताकत उनकी क्षमता के लिए सस्ते में और तेजी से गतिविधियों या ब्याज की निषेध पैटर्न को उजागर करने के लिए युग्मवार बातचीत के कई संयोजनों स्क्रीनिंग की सुविधा है. बाद में, और अधिक जटिल और गहन तरीकों (यानी, जीनोमिक लक्षणीकरण, MALDI-TOF-IMS, या प्राकृतिक उत्पाद अलगाव और लक्षण) रोगाणुओं और ब्याज की बातचीत के गहरे लक्षणीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है द्वारा की पहचान की सह-संस्कृति परख. हाल ही में एक उदाहरण के रूप में, इन सह संस्कृति निषेध परख को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कीट व्युत्पन्न Streptomyces ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और कवक उनके मिट्टी व्युत्पन्न समकक्षों की तुलना में बेहतर बाधित कर सकते हैं. 2,003 Streptomyces अलग के बीच अवरोध पैटर्न के त्वरित और कुशल दृश्य के लिए अनुमति दी निषेध परख और एक नया साइफोमाइसिन नामक एंटीफंगल की खोज करने के लिए नेतृत्व किया, जो दवा प्रतिरोधी कवक रोगजनकों के खिलाफ सक्रिय है 18. इस प्रकार, ये सह-संस्कृति सहभागिता परख माइक्रोबायोम अनुसंधान, एंटीमाइक्रोबियल खोज और माइक्रोबियल इंटरैक्शन के पैटर्न में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डैनियल मई, मार्क Chevrette, और डॉन Hoang धन्यवाद. कैमरून आर क्यूरी के प्रयासों सहित इस काम, विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय, अनुसंधान और स्नातक शिक्षा के लिए कुलपति के कार्यालय द्वारा विस्कॉन्सिन पूर्व छात्र अनुसंधान फाउंडेशन से धन के साथ समर्थित किया गया था, धन भी द्वारा प्रदान की अनुवाद अनुसंधान के लिए उत्कृष्टता के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य केन्द्रों (U19-AI109673-01). रीड एम Stubbendieck जीव विज्ञान और चिकित्सा प्रशिक्षण कार्यक्रम (NLM 5T15LM007359) में गणना और सूचना विज्ञान के लिए चिकित्सा प्रशिक्षण अनुदान के एक राष्ट्रीय पुस्तकालय द्वारा समर्थित किया गया था. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने का निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
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