Artículo de método

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

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DOI:

10.3791/60299

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6 de noviembre de 2019

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2MOE Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Institute of Life Sciences, Southeast University

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Resumen

El procesamiento auditivo en la cócleara depende de la integridad de las células pilosas mecanosensoriales. A lo largo de toda la vida, la pérdida auditiva se puede obtener de numerosas etiologías, como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el proceso de envejecimiento. La pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de las variedades de pérdida auditiva adquirida. Además, la sinapsis de la célula del cabello interno puede ser dañada por leves insultos. Por lo tanto, las preparaciones superficiales de la epitelía coclear, en combinación con técnicas de inmunoetiquetado e imágenes confocales, son una herramienta muy útil para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas sensoriales, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas y células de apoyo, regeneración de células pilosas y determinación de la expresión génica del informe (es decir, GFP) para la verificación de la transducción exitosa y la identificación de tipos de células transducidas. La cócleara, una estructura ósea en forma de espiral en el oído interno, sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). Las células pilosas sensoriales y las células de soporte circundantes en la OC están contenidas en el conducto coclear y descansan sobre la membrana basilar, organizadas de manera tonotópica con detección de alta frecuencia que se produce en la base y baja frecuencia en el ápice. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la capacidad de manipular genes mediante técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la investigación biológica, incluso en la ciencia auditiva. Sin embargo, la cócleara de ratón adulta es minúscula, y el epitelio coclear está encapsulado en un laberinto óseo, lo que dificulta la microdisección. Aunque las técnicas de disección se han desarrollado y utilizado en muchos laboratorios, este método de microdisección modificada utilizando adhesivo celular y tisular es más fácil y más conveniente. Se puede utilizar en todo tipo de cocleares de ratón adultos después de la descalcificación.

Introducción

La cócleara se dedica a la detección de sonido y responsable de la audición. El conducto coclear se enrolla en forma de espiral en el laberinto óseo y sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). El OC descansa sobre la membrana basilar, que compone el epitelio coclear, con una longitud de unos 5,7 mm cuando se desenrolla en ratones ADULTOs CBA/CaJ1,2. Debido a que el OC está organizado tonotópicamente con altas frecuencias detectadas en la base y frecuencias bajas en el ápice, el epitelio coclear a menudo se divide en tres partes para comparaciones analíticas: los giros apicales, medios y basales correspondientes a bajos, detección de frecuencia media y alta, respectivamente. Además de una serie de células de apoyo, la OC se compone de una fila de células pilosas internas (IHC) ubicadas medialmente y tres filas de células del cabello exteriores (OHC) ubicadas lateralmente con respecto a la espiral coclear.

El procesamiento auditivo correcto depende de la integridad de las células pilosas sensoriales en la cócleara. El daño o la pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de la pérdida auditiva adquirida, causada por numerosas etiologías como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el envejecimiento proceso3. Además, la integridad y la función de las sinapsis de la célula capilar interna/nervio auditivo pueden verse afectadas por leves insultos4. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la manipulación de genes por técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la ciencia auditiva. Aunque la cócleara de ratón adulta es minúscula y el epitelio coclear está rodeado por una cápsula ósea que resulta en microdisecciones técnicamente difíciles, preparaciones superficiales del epitelio en combinación con inmunoetiquetado o inmunohistoquímica y las imágenes confocales se han utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas sensoriales y células de apoyo, y la regeneración de células pilosas. También se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de los genes reporteros (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas. Estas técnicas se han utilizado previamente para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la pérdida auditiva inducida por ruido utilizando ratones CBA/J adultos5,6,7,8,9.

A diferencia de la inmunohistoquímica usando secciones de parafina o criosecciones para obtener pequeñas porciones transversales de la cócleara que contienen tres células del cabello exteriores (OHC) y una célula del cabello interno (IHC) en cada sección, las preparaciones de la superficie coclear permiten visualización de toda la longitud del OC para el recuento de células pilosas sensoriales y sinapsis de cinta e inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales correspondientes a frecuencias funcionales específicas. La Tabla 1 muestra el mapeo de frecuencias auditivas en función de la distancia a lo largo de la longitud de la espiral coclear en el ratón adulto CBA/J según estudios de Muller1 y Viberg y Canlon1,2. Preparaciones de superficie coclear han sido ampliamente utilizados para la investigación de patologías cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. El método de disección coclear de montaje completo fue descrito originalmente en un libro editado por Hans Engstrom en 196616. Esta técnica fue posteriormente refinada y adaptada a una variedad de especies como se describe en la literatura por un número de científicos en ciencias auditivas10,11,12,13, 15,17 y por los Laboratorios Eaton-Peabody en Massachusetts Eye and Ear18. Recientemente, Montgomery et al.19informó otro método de disección coclear. La microdisección de la cócleara es un paso esencial y crítico para las preparaciones de superficie coclear. Sin embargo, la diseción de las cocleares de ratón es un desafío técnico y requiere una práctica considerable. Aquí, se presenta un método de preparación de superficie coclear modificado para su uso en cócleares de ratón adultos. Este método requiere la descalcificación y el uso de adhesivo celular y tisular (es decir, Cell-Tak) para adherir las piezas de epitelio coclear a 10 mm de cubres redondos para inmunoetiquetado. Adhesivo celular y tisular ha sido ampliamente utilizado para la inmunohistoquímica20. Este método de microdisección coclear modificado es relativamente simple en comparación con los reportados anteriormente18,19.

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Protocolo

Todos los protocolos de investigación que involucran ratones CBA/J adultos adultos a las edades de 10-12 semanas y ratones C57BL/6J a las edades de 6-8 semanas fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC). El cuidado de animales estaba bajo la supervisión de la División de Recursos Animales de Laboratorio del MUSC.

NOTA: Para los procedimientos que se presentan a continuación, los ratones se anestesian con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) mediante inyecciones intraperitoneales. Los ratones son decapitados después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como un pellizco en el dedo del dedo del sol.

1. Extracción de huesos temporales

  1. Decapitar el ratón inmediatamente postmortem con tijeras quirúrgicas (17 cm de largo) y cortar el hueso del cráneo con tijeras desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo después de exponer el hueso del cráneo tirando de la piel antes.
  2. Retire el tejido cerebral usando fórceps y retire manualmente los huesos temporales con el pulgar y el dedo índice para ratones de tres meses de edad o más. Use pequeñas tijeras quirúrgicas (11 cm de largo) para cortar el hueso temporal de ratones de menos de tres meses de edad.
  3. Coloque el hueso temporal en una placa Petri (30 mm de diámetro) que contenga una solución de paraformaldehído fresco de hielo 4% (PFA) disuelta en solución salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7.4.
    NOTA: Preparar la solución fresca de PFA 4% y ajustar el pH a 7.4 justo antes de fijar los huesos temporales, porque el equilibrio de pH incorrecto de la solución pfA disminuirá la calidad de la inmunoetiquetado.

2. Fijación y perfusión

  1. Retire las estapas de la ventana ovalada y perfore la membrana de la ventana redonda con el tamaño #5 fórceps. Bajo un microscopio de disección estéreo hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclear usando una aguja de 27 G conectada a una jeringa de 1 ml.
  2. Perfumar suavemente y lentamente la cócleara con una solución de PFA al 4% a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave del pequeño agujero en el ápice. Transfiera la cócleara (una o dos coclearas por vial) a viales de centelleo de volumen de 20 ml que contengan 10 ml de solución de PFA al 4%.
  3. Agitar suavemente los viales de centelleo a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas y dejar pasar la noche en un frigorífico (4oC) en un rotador.
    NOTA: El tiempo de fijación se puede ajustar dependiendo del anticuerpo utilizado. Por ejemplo, limitar la fijación a 1,5 h permitirá una inmunoetiquetado exitosa de terminales postsinápticos cuando se utilice el anticuerpo GluA 2.

3. Descalcificación del hueso temporal

  1. Retire la solución de PFA y lave las cocleares con PBS 3x fresco durante 5 min cada una.
  2. Añadir 20 ml de solución de sal disódica de ácido etilendiaminetetraacético al 4% (PH 7.4) a los viales de centelleo y mantener en nevera durante 48-72 h en un rotador con agitación suave. Cambie la solución de EDTA diariamente hasta que las cocleares estén descalcificadas. Compruebe si las cocleares se descalcifican tocando la porción vestibular ósea con fórceps para evaluar la elasticidad o simplemente cortar una pequeña pieza desde el borde de la porción vestibular. Si tal corte da como resultado una pieza triturada, la cócleara no se descalcifica.
    NOTA: La solución EDTA puede interferir con la inmunorreacción de los anticuerpos primarios dependiendo de la concentración de la solución. Preparar 4% EDTA en PBS y ajustar el pH a 7.4. Para una descalcificación constante de los huesos temporales, se utiliza una solución EDTA fresca.
  3. Cambie la solución a PBS para microdisección una vez completada la descalcificación.
    NOTA: Si las cocleares no están suficientemente descalcificadas, no se puede realizar la disección de las cocleares.

4. Microdisección del epitelio coclear

NOTA: Una vez completada la descalcificación, es necesario realizar la microdisección del epitelio coclear para el inmunoetiquetado lo antes posible. En una placa Petri limpia de 30 mm que contiene PBS, el oído interno está orientado de la siguiente manera: en referencia a la parte superior (tapa) y la parte inferior de la placa Petri, las ventanas redondas y ovaladas cocleares dan a la parte superior. En referencia al dessector, la porción coclear se orienta hacia el frente (lejos del dessector) y la parte vestibular hacia la parte posterior (cerca de dissector). A continuación se describen los pasos en detalle.

  1. Sostenga la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y corte el giro apical con el bisturí en un ángulo de 45o como se indica en la línea roja (Figura 1a).
  2. Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada, como se indica en la línea roja (Figura 1b) para separar la cócleara de la porción vestibular(Figura 1c).
    NOTA: Esta porción coclear contiene las porciones medias, basales y de gancho del epitelio.
  3. Coloque la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y el giro central hacia la parte superior de la placa Petri y corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo desde el que se eliminó la sección apical, como indica la línea roja (Figu re 1d,e).
  4. Continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho(Figura 1f,g).
    NOTA: La región de gancho de la cócleara es el final del epitelio coclear correspondiente a la sensibilidad a los tonos 48 kHz y superiores en ratones.
  5. Coloque la porción basal y de gancho con el sitio de la membrana basilar orientado hacia la parte inferior del plato y corte verticalmente el modiolus de la región del gancho para eliminar el modiolus como se indica en la línea roja vertical(Figura 1g).
    NOTA: El modiolus es el eje central de forma cónica de la cóclear que consiste en hueso esponjoso y nervio coclear, así como el ganglio espiral. Puede ser preferible realizar este corte con tijeras.
  6. Corte las regiones basales y de gancho como la otra línea roja indica en la Figura 1g para separar la porción del gancho(Figura 1h).
    NOTA: La cócleara ahora se ha separado en porciones apicales, medias, basales y de gancho. Los siguientes pasos serán la disección final de cada uno de los giros individuales, utilizando el giro medio como ejemplo.
  7. Corte las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de la pared lateral del giro medio como se indica en la línea roja (Figura 1i).
    NOTA: La pared lateral del conducto coclear está formada por el ligamento espiral y la estría vascular.
  8. Sostenga la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri y corte estos tejidos del lado de la membrana basilar. Luego aplanar la muestra para orientar el lado de la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba. Recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral(Figura 1j).
  9. Retire la membrana tectorial utilizando fórceps para separar completamente la región media(Figura 1k).
  10. Repita los pasos 4.7 a 4.9 para las secciones finales de los giros o regiones restantes, como se muestra en la Figura 1l.
  11. Preparar un cubreobjetos redondo de 10 mm para la adhesión del epitelio sensorial. Utilice una pipeta para esparcir a mano 0,5 ml de adhesivo celular y tisular en el centro de la cubierta redonda. Después del secado (3-5 min a RT), poner los labios de las cubiertas en PBS en platos Petri.
  12. Pegue las cuatro piezas del epitelio sensorial en el cubreobjetos redondo de 10 mm en el plato Petri. A continuación, sostenga un borde de la cubierta para transferirlo a un plato de cuatro pozos para inmunoetiquetado o inmunohistoquímica(Figura 1m).
    NOTA: La Figura 2 ilustra la ubicación de los principales cortes.

5. Inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares

NOTA: El protocolo de inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares seguido en este estudio ha sido descrito previamente13. Las cintas presinápticas fueron etiquetadas con un anticuerpo CtBP2 (proteína de unión anticarboxilo-terminal de ratón 2 IgG1, que etiqueta el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE). Los terminales postsinápticos fueron etiquetados con anticuerpos GluA2 (receptor antiglutamato de ratón 2 IgG2a, subunidades de etiquetado del receptor AMPA).

  1. Lavar el epitelio sensorial con PBS 3x durante 5 minutos cada lavado en un plato de cuatro pozos y luego añadir 2 ml de surfactante no iónico 2% (es decir, Tritón-X 100) en el plato durante 30 minutos a RT en un rotador.
  2. Retire la solución tensioactivo no iónica del plato utilizando una pipeta y agregue 100 ml de solución de bloqueo que contenga un 10% de suero de cabra normal a cada pocador durante 1 h en un rotador con agitación suave en RT.
  3. Retire la solución de bloqueo de cada pocal, lave con PBS 3x durante 5 min cada lavado bajo agitación suave en RT.
  4. Añadir 100 l de los anticuerpos primarios diluidos con PBS a cada pocal: ratón anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), ratón anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 24 h.
    NOTA: Como opción, se puede añadir antimiosina VIIa de conejo (1:400) para el inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales.
  5. Lavar 3x con PBS durante 5 min cada lavado con agitación suave a RT.
  6. Añadir 100 l de los anticuerpos secundarios Alexa 594 cabra anti-ratón IgG1a (1:1,000), Alexa 488 cabra anti-ratón IgG2a (1:1,000) diluido con PBS a cada pocto. Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 2 h.
    NOTA: Si se utiliza miosina VIIa, añadir Alexa 350 cabra anticonejo (1:200).
  7. Lavar 3x con PBS durante 5 min. A continuación, transfiera el cubreobjetos redondo de 10 mm a una diapositiva con las muestras en la parte superior.
  8. Agregue con cuidado 8 ml de Fluoro-Gel con tampón Tris en el centro de la cubierta. A continuación, sostenga el borde de otro cubreobjetos redondo de 10 mm con fórceps para montar en la parte superior, emparejiendo los dos cubreobjetos juntos.
  9. Use esmalte de uñas para sellar las diapositivas, colóquelas en una carpeta de diapositivas de cartón y guárdelas en el refrigerador.
    NOTA: Si se filtra un poco de Fluoro-Gel entre los labios de las cubiertas durante el montaje, limpie los bordes de los labios de las cubiertas antes de sellar el portaobjetos con esmalte de uñas. Las imágenes confocales deben tomarse en un plazo de 7 días.

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Resultados

Las preparaciones superficiales del epitelio coclear, en combinación con el inmunoetiquetado y la imagen confocal, se han utilizado ampliamente en la audición para la investigación de patologías cocleares, como la cuantificación de sinapsis de cinta, células pilosas sensoriales, y expresión proteica en células pilosas sensoriales5,6,7,8. Aunque la disección de cócleares de ratón adultos para pr...

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Discusión

La microdisección coclear de preparaciones de superficie de montaje completo en combinación con el inmunoetiquetado proporciona una herramienta básica para la investigación de patologías del oído interno y mecanismos moleculares. Este método de disección coclear de ratón adulto modificado utilizando el adhesivo celular y tisular simplifica este difícil procedimiento.

Aunque este método de preparación de superficie coclear modificado es relativamente fácil y accesible, todavía requiere práctica...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El proyecto de investigación descrito fue apoyado por la subvención R01 DC009222 del Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo se llevó a cabo en el edificio WR de MUSC en un espacio renovado apoyado por la subvención C06 RR014516. Los animales fueron alojados en instalaciones animales MUSC CRI apoyados por la subvención C06 RR015455 del Programa de Instalaciones de Investigación Extramuros del Centro Nacional de Recursos de Investigación. Los autores agradecen al Dr. Jochen Schacht por sus valiosos comentarios y a Andra Talaska por la corrección del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 mm Rund CoverslipsProductos de microscopía para la ciencia y la industria260367
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-ratón IgG2Thermo Fisher ScientificA-21131
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 Cabra Anti-ratón IgG1Thermo Fisher ScientificA-21125
Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA11012
Carboard Micro Slide BandejasFisher Scientific12-587-10
Cell-TakBD Biosciences354240
Corning Placas de PetriFisher Scientific353004
DAPIThermo Fisher Scientific62247
Dumont #5 PinzasHerramientas de ciencia fina FST11251-20
EDTA Sal disódicaSigma-AldrichE5134
Gel fluorado con tampón TrisCiencias de la Microscopía Electrónica17985-10
Placas de cultivo celular de cuatro pocillosGreiner Bio-One627170
Anticuerpo anti-miosina VIIa de cabraProteus Biosciences25-6790
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-544-7
Anticuerpo anti-CtBP2de ratón BD Biosciences#612044
Anticuerpo anti-Glu2R de ratónMilliporeMAB397
Suero de cabra normalThermo Fisher Scientific31872
ParaformaldehídoSigma-Aldrich441244
solución salina tamponada con fosfatoFisher ScientificBP665-1
BisturíVWR100491-038
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Vannas Tijeras de resorte Herramientas deciencia fina15001-08

Referencias

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