Artículo de método

Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado

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DOI:

10.3791/60303

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14 de octubre de 2019

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1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

En este artículo

Resumen

Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.

Resumen

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) son cánceres raros que se originan a partir de células enterocromafina del intestino. La investigación en este campo ha sido limitada porque se han generado muy pocas líneas celulares SBNET derivadas de pacientes. Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y son difíciles de propagar. Las pocas líneas de celda que se han establecido no están fácilmente disponibles, y después del tiempo en el cultivo puede no seguir expresando características de las celdas NET. La generación de nuevas líneas celulares podría tardar muchos años ya que las células SBNET tienen un tiempo de duplicación largo y se necesitan muchos pasos de enriquecimiento para eliminar los fibroblastos asociados al cáncer que se dividen rápidamente. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo para cultivar células SBNET de tumores extirpados quirúrgicamente como esferoides en la matriz extracelular (ECM). El ECM forma una matriz tridimensional que encapsula las células SBNET e imita el microambiente tumoral para permitir que las células SBNET crezcan. Aquí, caracterizamos la tasa de crecimiento de los esferoides de SBNET y describimos métodos para identificar marcadores SBNET utilizando microscopía de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para confirmar que los esferoides son células tumorales neuroendocrinas. Además, utilizamos esferoides SBNET para probar la citotoxicidad de la rapamicina.

Introducción

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) se originan en las células enterocromafina del intestino delgado. Aunque los SBNET son generalmente conocidos por crecer lentamente, comúnmente hacen metástasis en el hígado1. Si bien la extirpación quirúrgica o la ablación tumoral se pueden considerar en muchos casos, la recurrencia es casi universal y, por lo tanto, la terapia médica desempeña un papel importante en el manejo. Se han invertido enormes esfuerzos para generar nuevas líneas celulares SBNET para pruebas de drogas. Sin embargo, ha habido muy poco éxito. Sólo se han notificado 6 líneas de celda SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5; y desafortunadamente una línea celular ya no expresa los marcadores NET6 y otras tres líneas celulares SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) se determinó que se derivan de linfoblastos transformados en lugar de NETs7. Con el fin de acelerar la identificación de medicamentos para la focalización de los SBNET, se necesitan métodos alternativos para las pruebas de drogas in vitro.

Aquí, aprovechamos la disponibilidad de SBNET resecados y hemos establecido una manera de cultivar estos SBNET derivados del paciente como esferoides que crecen en ECM. El objetivo general de este manuscrito es describir un método para cultivar SBNET como una cultura tridimensional (3D) y esbozar procedimientos para caracterizar estos esferoides para la retención de marcadores SBNET por tinción de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.

Además, demostramos cómo estos esferoides SBNET se pueden utilizar para probar el efecto de la rapamicina, un fármaco contra el cáncer para neTs8. La razón detrás de este protocolo es desarrollar un nuevo método para cultivar células SBNET in vitro y usarlas para pruebas de drogas. La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que los cultivos 3D de SBNET se pueden obtener rápidamente y las pruebas de drogas se pueden hacer dentro de 3 semanas. Los esferoides de SBNET podrían utilizarse potencialmente como modelo para realizar pantallas de medicamentos in vitro para identificar nuevos fármacos para pacientes con SBNET. Dado que las líneas celulares SBNET no están ampliamente disponibles, los cultivos 3D de esferoides SBNET pueden servir como un nuevo modelo in vitro para el estudio de los SBNET y pueden compartirse entre los científicos en el campo.

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Protocolo

Todos los experimentos con muestras de tumores neuroendocrinos humanos han sido aprobados por el comité IRB de hospitales y clínicas de la Universidad de Iowa (número de protocolo 199911057). En la Tabla de materialesse describe una lista de todos los materiales y equipos. En la Tabla 1se encuentra una lista de medios de crecimiento y soluciones clave.

1. Recogida de tumor neuroendocrino del intestino delgado (SBNET) y disociación celular

  1. Obtener muestras de SBNET del paciente resecadas después de la confirmación de los tejidos tumorales del Núcleo de Patología Quirúrgica.
  2. Cortar sBNET en cubos de 5 mm y almacenar en 25 ml de medio DMEM/F12 en un tubo cónico para el transporte al laboratorio.
  3. Transferir los tumores en DMEM que contienen 1% FBS, 1% penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 1% de glutamina (medio de lavado) e incubar en este medio de lavado durante 15 min.
  4. Transfiere los tumores a un nuevo plato y los tumores de picado a trozos de menos de 1 mm utilizando tijeras curvas estériles.
  5. Transfiera los tejidos picados a un nuevo tubo de 50 ml que contenga 25 ml de medio de lavado.
  6. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 15 min a 4oC.
  7. Deseche el sobrenadante y resuspenda los pellets en 10 ml de medio de lavado que contenga colagenasa (100 U/ml) y DNase (0,1 mg/ml).
  8. Permitir que la digestión de los tumores picados se produzca en una incubadora de 37oC con agitación lenta (50 rpm) durante 1,5 h.

2. Cultura de los SBNET como esferoides tumorales en ECM

  1. Una vez finalizada la digestión (paso 1.8), centrífuga a 500 x g durante 15 min a 4oC, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 15 ml de Wash Medium.
  2. Coloque un colador de celda de 70 m encima de un nuevo tubo de 50 ml y transfiera 10 ml del medio de lavado sobre el colador de la célula. Gire el medio de lavado para cubrir el lado del tubo de plástico para evitar que las células NET se peguen al lado del tubo de plástico.
  3. Filtrar la suspensión celular a través del colador celular.
  4. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 oC, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 oL de medio de lavado (el volumen total es de 250 ml) y colocarlo sobre hielo.
  5. Transfiera 5 ml de células a 500 ml de medio de lavado (factor de dilución 1/100). Utilice las células diluidas para el recuento celular utilizando un hemocitómetro para obtener el número de células por mililitro. Multiplique por 100 para corregir el factor de dilución.
  6. Multiplique el número de células por ml obtenidas en el paso 2.5 por el volumen total de células en suspensión obtenido en el paso 2.4 (a 250 ol).
  7. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4oC, desechar el sobrenadante y resuspender las células en ECM líquido (1 x 106 células/ml) y mantenerlas en hielo.
  8. Transfiera 5-20 l de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pocillos y permita que el ECM líquido se solidifique colocando la placa en una incubadora de 37 oC durante 5 min.
  9. Añadir 200 l de medio de cultivo SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 g/ml de insulina) a cada pocto de la placa de 96 pocillos que contiene los esferoides SBNET en ECM.
  10. Alternativamente, cultivo sexistas SBNET en medios de células madre similares a lo que se ha descrito anteriormente para el cultivo de hígado humano o organoides pancreáticos9 y enumerados en la Tabla de Materiales.
  11. Cambie los medios cada 5-7 días.

3. Cuantificación del tamaño del esferoide SBNET utilizando ImageJ

  1. Tome 5-10 imágenes de esferoides de SBNET en los días 1, 4, 7, 14, 23 y 97 de la cultura utilizando un objetivo 10x.
  2. Abra las imágenes guardadas en ImageJ. Vaya a la pestaña Analizar, seleccione la opción Establecer medidas y active la opción Area.
  3. Utilice la herramienta de selección ovalada de la barra de herramientas para generar un elipsoide o un círculo alrededor de un esferoide bien enfocado.
  4. Vaya a la pestaña Analizar y seleccione la opción Medir. Repita los pasos 3.4 y 3.5 para obtener la medición de área de 25-50 esferoides SBNET. Los valores se proporcionan en el cuadrado de píxel.
  5. Convierta el área de píxeles a2 dividiendo el tamaño de cada píxel con la longitud de cada píxel al factor de conversión de las imágenes de microscopía.
    NOTA: Las células SBNET crecen principalmente como esferoides y en algún momento como elipsoides.

4. Caracterización de los esferoides SBNETS por inmunofluorescencia

  1. Transfiera los organoides cultivados en ECM a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta P1000.
  2. Centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
  3. Lavar el cultivo organoide añadiendo 1 ml de PBS, mezclar, centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
  4. Fije los organoides añadiendo 500 éL de 4% de paraformaldehído e incubar durante 15 min.
  5. Lave el cultivo dos veces con 1 ml de PBS.
  6. Permeabilizar el cultivo mediante la adición de 500 éL de PBS + 3% BSA + 0.1% Triton X 100 durante 5 min.
  7. Luego lavar tres veces con 1 mL de PBS + 3% De BSA.
  8. Incubar durante 1 h con anticuerpos primarios contra la sinaptofisina (SYP)10 a 1/600 de dilución o cromogranina A (CgA)11 y el receptor 2 de somatostatina (SSTR2)12 a 1/400 de dilución en tampón de anticuerpos (2,5% albúmina sérica bovina, 0,1% de sodio azida, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio).
    NOTA: Utilice 300 ml o más de solución de anticuerpos por tubo.
  9. Lavar tres veces con 1 mL de PBS + 3% de BSA.
  10. Incubar con anticuerpos secundarios acoplados a FITC a 1/500 de dilución en tampón de anticuerpos durante 1 h. Utilice 300 ml o más de solución de anticuerpos por tubo.
  11. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS + 3% de BSA. Asegúrese de aspirar y desechar todo el sobrenadante.
  12. Añadir 5 l de medio de montaje que contenga la mancha nuclear DAPI.
  13. Utilice una pipeta P20 para transferir 5 l de los esferoides SBNET del paso 4.12 a un portaobjetos de vidrio y sellar con un resbalón de la cubierta.
  14. Tome imágenes utilizando un microscopio fluorescente utilizando los objetivos 10x, 20x o 40x.

5. Caracterización de esferoides SBNET por inmunohistoquímica (IHC)

  1. Transfiera los esferoides SBNET de la placa de cultivo a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta P1000.
  2. Centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
  3. Arreglar los esferoides de SBNET añadiendo 500 l de formalina del 10% al tubo desde el paso 5.2 e incubar a temperatura ambiente durante 2-5 días antes de la incrustación de parafina y cortar secciones de esferoides de espesor de 4 m.
  4. Deparafina, rehidrata y usa la recuperación de epítopos inducidapor por calor en la Solución de Recuperación de Antígenos a pH 9 calentando a 97oC durante 20 min utilizando la estación de procesamiento de diapositivas automatizada 3 en 1 para preparar diapositivas para la incubación de anticuerpos.
  5. Bloquee los portaobjetos e incubar con anticuerpos primarios contra SYP10 a una dilución de 1/100 durante 15 min, CgA11 a una dilución de 1/800 durante 15 minutos y SSTR212 a una dilución de 1/5.000 durante 30 min.
  6. Incubar con el sistema secundario de detección de anticuerpos durante 15 min para la tinción anti-SYP y CgA y 30 min para la tinción anti-SSTR2. Tome fotografías utilizando un objetivo de 400x.

6. Tratamiento de organoides SBNET con rapamicina

  1. Disolver la rapamicina en DMSO para obtener una solución de stock de 10 mM.
  2. Preparar el medio de cultivo SBNET con DMSO (p. ej., 1 ml de medio de cultivo SBNET + 1 l de DMSO) y medio de cultivo SBNET con 10 m de rapamicina (por ejemplo, 1 ml de medio de cultivo SBNET + 1 l de solución de stock de rapamicina de 10 mM).
  3. Transfiera medios de 200 l con medio de cultivo SBNET con DMSO o rapamicina de 10 m a cultivos de esferoides De SBNET.
  4. Incubar esferoides SBNET durante 5 días en una incubadora de 37oC.
  5. Añadir 1 m de homodímero e incubar durante 30 min. Retire el medio que contenga homodímero de etidio, lave con 200 ml de PBS y transfiera 200 ml de PBS a cada poca.
  6. Tome imágenes de microscopía de esferoides SBNET con y sin tratamiento farmacológico utilizando el cubo de filtro rojo con los objetivos 10x, 20x o 40x de un microscopio fluorescente.
    NOTA: Las células muertas teñidas con Ethidium homodimer aparecen como rojas utilizando el cubo de filtro rojo G de un microscopio disponible comercialmente(Tabla de materiales). Alternativamente, la señal se puede capturar utilizando un espectrofotómetro a 535 nm de excitación y 624 nm de emisión.

7. Dividir los esferoides sBNET

NOTA: Esto se hace para la expansión y para compartir con otros investigadores.

  1. Utilice una pipeta P1000 para romper mecánicamente el ECM y aspirar el ECM con esferoides SBNET a un tubo estéril de 1,5 ml.
  2. Centrifugar a 1.000 x g a 4oC, retirar todo el sobrenadante y colocar el tubo sobre hielo.
  3. Añadir 2-4x el volumen del nuevo ECM al pellet. Mezcle el nuevo ECM con los antiguos esferoides ECM y SBNET pipeteando 10veceros. Evitar introducir burbujas de aire.
  4. Transfiera 5-20 l de la mezcla de esferoides ECM y SBNET a una placa nueva y permita que ECM se solidifique.
  5. Cubrir con nuevo medio SBNET y transferir a la incubadora. La tasa de recuperación es de aproximadamente 95 a 100%.
  6. Para enviar esferoides SBNET a otro laboratorio, transfiera los esferoides SBNET con el nuevo ECM a un matraz T25 y permita que ECM se solidifique.
  7. Llene el matraz T25 con medio esferoide SBNET, atornille la tapa firmemente y prepare el paquete de envío.
  8. Al recibir una referencia cultural esferoide SBNET, quite el medio de referencia cultural y realice los pasos 7.1 a 7.5 para volver a colocar los esferoides de SBNET en la referencia cultural.

8. Crioalmacenamiento y recuperación de esferoides SBNET

  1. Transfiera los esferoides SBNET de 5-10 pozos pequeños a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 oC, eliminar el sobrenadante, resuspender en medio de congelación (90% FBS + 10% DMSO), almacenar en un recipiente de congelación celular, y colocarlo en -80 oC.
  2. Transfiera al nitrógeno líquido para un almacenamiento más largo.
  3. Para recuperar los esferoides de SBNET, coloque el vial congelado sobre hielo y espere hasta que el contenido esté completamente descongelado. Invierta el tubo y vuelva a colocarlo en hielo para acelerar el proceso de descongelación.
  4. Una vez descondezcada la muestra, se coloca dentro de una centrífuga preenfriada y gira a 1.000 x g durante 10 min.
  5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los esferoides en ECM. Mantenga el tubo en hielo, transfiera 20 l a una placa nueva y espere a que el ECM se solidifique.
  6. Transferir 200 l de medio de cultivo SBNET con 10 m de inhibidor de ROCK (Y-27632)13 y transferirlo a la incubadora.
  7. Permita que los esferoides de SBNET se recuperen y crezcan durante 1 semana. Retire el medio de cultivo antiguo, reponga con 200 ml de medio de cultivo SBNET y vuelva a la incubadora.
  8. Permita que los esferoides de SBNET sigan creciendo.
    NOTA: Los esferoides de rápido crecimiento tardan al menos 1 semana en empezar a recuperarse después de la criopreservación13. Los esferoides de SBNET tardan un mínimo de 2-4 semanas en empezar a crecer. Muchas células SBNET morirán dentro de las primeras 2 semanas y la tasa de supervivencia es inferior al 10%. Dado que se trata de un proceso muy lento y de bajo rendimiento, es mejor compartir con otros investigadores esferoides SBNET en matraces de cultivo (como se describe en el paso 7). El crioalmacenamiento y la recuperación solo deben utilizarse como un plan de respaldo en caso de que se produzca una contaminación bacteriana.

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Resultados

Actualmente sólo hay 2 líneas celulares SBNET establecidas y publicadas2,3,4,5 y no están fácilmente disponibles para muchos investigadores. Aquí, proponemos cultivar SBNET como esferoides en ECM y utilizar esto como un modelo alternativo para estudiar la sensibilidad a los medicamentos SBNET. Se recogió un tumor derivado del paciente de un SBNET que hizo metástasis en el hígado, se digiere par...

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Discusión

Los cultivos 3D tumorales se han convertido en un recurso valioso para las pruebas de fármacos preclínicos15. Recientemente se han establecido varios biobancos organoides tumorales a partir de tumores de cáncer de mama y de cáncer de próstata16,17. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el cultivo de SBNET como esferoides y un método simple y rápido para validar los cultivos de esferoides para marcadores NET por inmuno...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH P50 CA174521 (a J.R. Howe y A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha recibido el premio P50 CA174521 Career Enhancement Program.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-conejo FITCJackson ImmunoResearch11-095-152Acoplamiento de anticuerpos secundarios a un fluoróforo verde
Solución de recuperación de antígenosAgilent DakoS2367a pH 9 para la preparación de portaobjetos para IHC
Autostainer Link 48Agilent DakoNo disponibleSistema automatizado para la tinción de anticuerpos
Contenedor de congelación celularThermo Scientific5100-0001Contenedor para congelar células
CellSenceOlympusVersión 1.18Software informático para el uso de microscopio fluorescente
Anticuerpo Chromogranin AAbcam-45179RB-9003-POAnticuerpos para el FI
Anticuerpo Chromogranin A (clon LK2H10)Thermo ScientificMA5-13096Anticuerpos para IHC
ColagenasaSigmaC0130Enzima para la digestión de tejido tumoral
DMEMGibco11965-092Medio para la preparación de tejidos
DMEM/F12Gibco11320-033Medio para cultivos de organoides
DMSOSigmaD8418Disolvente para disolver fármaco
ADNasaSigmaDN25Enzima para la digestión de tejido tumoral
Ethidium HomodimerChemodexCDX-E0012-T1E Colorante deunión a ADN y ARN
FBSGibco16000044Reactivo para medios de cultivo
Microscopio fluorescenteOlympusCKX35Microscopio para tomar imágenes de esferoides SBENT
GlutaminaGibcoA2916801Reactivo para medios de cultivo
ImageJInstitutos Nacionales de SaludVersión 1.51Software informático para imágenes análisis
InsulinaSigmaI0516Reactivo para medios de cultivo
MatrigelCorning356235 Matriz para incrustar y anclar organoides
Medio de montaje (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1200Fijador para células marcadas con una tinción nuclear
NicotinamidaSigma72340Reactivo para medios
de cultivoParaformaldehídoMicroscopía Electrónica Ciencias15710Reactivo para fijar células
PEN/STREPGibco15140-122Reactivo para medios de cultivo
PT LinkAgilent DakoNo disponibleSistema automatizado para preparar portaobjetos para la tinción IHQ
RapamicinaAlfa AesarJ62473Fármaco que puede inhibir el crecimiento de NET
Anticuerpos secundarios para IHQAgilent DakoK8000Anticuerpos secundarios contra IHQ mediante el sistema EnVision FLEX basado en polímeros
Anticuerpo SSTR2GeneScritpA01591Anticuerpos contra IF
Anticuerpo SSTR2 (clon UMB1)Abcamab134152Anticuerpos contra IHQ
Anticuerpo sinaptofisinaAbcam32127Anticuerpos contra IF
Anticuerpo sinaptofisina (clon DAK-SYNAP)Agilent DakoM7315Anticuerpos para IHC
TritonXMallinckrodt3555 KBGEReactivo para permeabilizar células
Y-2763 Inhibidor de ROCKAdipogenAG-CR1-3564-M005Para mejorar la viabilidad de los esferoides SBNET después de la congelación y descongelación

Referencias

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