Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.
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Artículo de método
Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado
En este artículo
Resumen
Resumen
Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) son cánceres raros que se originan a partir de células enterocromafina del intestino. La investigación en este campo ha sido limitada porque se han generado muy pocas líneas celulares SBNET derivadas de pacientes. Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y son difíciles de propagar. Las pocas líneas de celda que se han establecido no están fácilmente disponibles, y después del tiempo en el cultivo puede no seguir expresando características de las celdas NET. La generación de nuevas líneas celulares podría tardar muchos años ya que las células SBNET tienen un tiempo de duplicación largo y se necesitan muchos pasos de enriquecimiento para eliminar los fibroblastos asociados al cáncer que se dividen rápidamente. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo para cultivar células SBNET de tumores extirpados quirúrgicamente como esferoides en la matriz extracelular (ECM). El ECM forma una matriz tridimensional que encapsula las células SBNET e imita el microambiente tumoral para permitir que las células SBNET crezcan. Aquí, caracterizamos la tasa de crecimiento de los esferoides de SBNET y describimos métodos para identificar marcadores SBNET utilizando microscopía de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para confirmar que los esferoides son células tumorales neuroendocrinas. Además, utilizamos esferoides SBNET para probar la citotoxicidad de la rapamicina.
Introducción
Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) se originan en las células enterocromafina del intestino delgado. Aunque los SBNET son generalmente conocidos por crecer lentamente, comúnmente hacen metástasis en el hígado1. Si bien la extirpación quirúrgica o la ablación tumoral se pueden considerar en muchos casos, la recurrencia es casi universal y, por lo tanto, la terapia médica desempeña un papel importante en el manejo. Se han invertido enormes esfuerzos para generar nuevas líneas celulares SBNET para pruebas de drogas. Sin embargo, ha habido muy poco éxito. Sólo se han notificado 6 líneas de celda SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-ST....
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Protocolo
Todos los experimentos con muestras de tumores neuroendocrinos humanos han sido aprobados por el comité IRB de hospitales y clínicas de la Universidad de Iowa (número de protocolo 199911057). En la Tabla de materialesse describe una lista de todos los materiales y equipos. En la Tabla 1se encuentra una lista de medios de crecimiento y soluciones clave.
1. Recogida de tumor neuroendocrino del intestino delgado (SBNET) y disociación celular
- Obtener muestras de SBNET del paciente resecadas después de la confirmación de los tejidos tumorales del Núcleo de Patología Quirúrgica.
- Cortar sBNET e....
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Resultados
Actualmente sólo hay 2 líneas celulares SBNET establecidas y publicadas2,3,4,5 y no están fácilmente disponibles para muchos investigadores. Aquí, proponemos cultivar SBNET como esferoides en ECM y utilizar esto como un modelo alternativo para estudiar la sensibilidad a los medicamentos SBNET. Se recogió un tumor derivado del paciente de un SBNET que hizo metástasis en el hígado, se digiere par.......
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Discusión
Los cultivos 3D tumorales se han convertido en un recurso valioso para las pruebas de fármacos preclínicos15. Recientemente se han establecido varios biobancos organoides tumorales a partir de tumores de cáncer de mama y de cáncer de próstata16,17. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el cultivo de SBNET como esferoides y un método simple y rápido para validar los cultivos de esferoides para marcadores NET por inmuno.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH P50 CA174521 (a J.R. Howe y A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha recibido el premio P50 CA174521 Career Enhancement Program.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-conejo FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Acoplamiento de anticuerpos secundarios a un fluoróforo verde |
| Solución de recuperación de antígenos | Agilent Dako | S2367 | a pH 9 para la preparación de portaobjetos para IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | No disponible | Sistema automatizado para la tinción de anticuerpos |
| Contenedor de congelación celular | Thermo Scientific | 5100-0001 | Contenedor para congelar células |
| CellSence | Olympus | Versión 1.18 | Software informático para el uso de microscopio fluorescente |
| Anticuerpo Chromogranin A | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Anticuerpos para el FI |
| Anticuerpo Chromogranin A (clon LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Anticuerpos para IHC |
| Colagenasa | Sigma | C0130 | Enzima para la digestión de tejido tumoral |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medio para la preparación de tejidos |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medio para cultivos de organoides |
| DMSO | Sigma | D8418 | Disolvente para disolver fármaco |
| ADNasa | Sigma | DN25 | Enzima para la digestión de tejido tumoral |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E Colorante de | unión a ADN y ARN |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reactivo para medios de cultivo |
| Microscopio fluorescente | Olympus | CKX35 | Microscopio para tomar imágenes de esferoides SBENT |
| Glutamina | Gibco | A2916801 | Reactivo para medios de cultivo |
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud | Versión 1.51 | Software informático para imágenes análisis |
| Insulina | Sigma | I0516 | Reactivo para medios de cultivo |
| Matrigel | Corning | 356235 Matriz para incrustar y anclar organoides | |
| Medio de montaje (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fijador para células marcadas con una tinción nuclear |
| Nicotinamida | Sigma | 72340 | Reactivo para medios |
| de cultivoParaformaldehído | Microscopía Electrónica Ciencias | 15710 | Reactivo para fijar células |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reactivo para medios de cultivo |
| PT Link | Agilent Dako | No disponible | Sistema automatizado para preparar portaobjetos para la tinción IHQ |
| Rapamicina | Alfa Aesar | J62473 | Fármaco que puede inhibir el crecimiento de NET |
| Anticuerpos secundarios para IHQ | Agilent Dako | K8000 | Anticuerpos secundarios contra IHQ mediante el sistema EnVision FLEX basado en polímeros |
| Anticuerpo SSTR2 | GeneScritp | A01591 | Anticuerpos contra IF |
| Anticuerpo SSTR2 (clon UMB1) | Abcam | ab134152 | Anticuerpos contra IHQ |
| Anticuerpo sinaptofisina | Abcam | 32127 | Anticuerpos contra IF |
| Anticuerpo sinaptofisina (clon DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Anticuerpos para IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reactivo para permeabilizar células |
| Y-2763 Inhibidor de ROCK | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | Para mejorar la viabilidad de los esferoides SBNET después de la congelación y descongelación |
Referencias
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establi....
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Reimpresiones y permisos
