Un sistema para el seguimiento de la dinámica del comportamiento de las preferencias sociales en pequeños roedores

Summary

Aquí se describe un novedoso sistema experimental automatizado que ofrece una alternativa a la prueba de tres cámaras y también resuelve varias advertencias. Este sistema proporciona múltiples parámetros de comportamiento que permiten un análisis riguroso de la dinámica conductual de pequeños roedores durante las pruebas de preferencia social y preferencia de novedad social.

Abstract

Explorar los mecanismos neurobiológicos del comportamiento social requiere pruebas de comportamiento que se pueden aplicar a los modelos animales de una manera imparcial e independiente del observador. Desde principios del milenio, la prueba de tres cámaras ha sido ampliamente utilizada como paradigma estándar para evaluar la sociabilidad (preferencia social) y la preferencia de novedad social en pequeños roedores. Sin embargo, esta prueba sufre de múltiples limitaciones, incluyendo su dependencia de la navegación espacial y la negligencia de la dinámica conductual. Presentado y validado aquí es un novedoso sistema experimental que ofrece una alternativa a la prueba de tres cámaras, mientras que también resuelve algunas de sus advertencias. El sistema requiere un aparato experimental simple y asequible y un sistema de análisis de código abierto disponible públicamente, que mide y analiza automáticamente múltiples parámetros de comportamiento a nivel individual y de población. Permite un análisis detallado de la dinámica conductual de los pequeños roedores durante cualquier prueba de discriminación social. Demostramos la eficiencia del sistema en el análisis de la dinámica del comportamiento social durante las pruebas de preferencia social y novedad social realizadas por ratones machoadultos adultos y ratas. Además, validamos la capacidad del sistema para revelar la dinámica modificada del comportamiento social en roedores después de manipulaciones como el recorte de bigotes. Por lo tanto, el sistema permite una investigación rigurosa del comportamiento social y la dinámica en pequeños modelos de roedores y apoya comparaciones más precisas entre cepas, condiciones y tratamientos.

Introduction

Revelar los mecanismos biológicos subyacentes a los trastornos del neurodesarrollo (NDD) es uno de los principales desafíos en el campo de la neurociencia¹. Abordar este desafío requiere paradigmas de comportamiento y sistemas experimentales que tipifiquen el comportamiento de los roedores de una manera estándar e imparcial. Un influyente estudio publicado hace más de una década por Moy y sus colegas² presentó la prueba de tres cámaras. Desde entonces, esta prueba se ha utilizado ampliamente para investigar el comportamiento social en modelos de roedores de NDDs. Esta prueba evalúa dos tendencias innatas de los roedores: 1) permanecer en la proximidad de un estímulo social sobre un objeto (sociabilidad, también denominada preferencia social [SP]), y 2) para preferir la proximidad de un nuevo estímulo social a uno familiar (preferencia de novedad social [SNP])^3,4. Varios estudios posteriores sugirieron métodos de análisis automatizado de la prueba de tres cámaras utilizando métodos computarizados^5,6.

Esta prueba todavía sufre de varias advertencias. En primer lugar, examina principalmente la preferencia por el lugar social en lugar de la motivación del sujeto para interactuar directamente con un estímulo social, aunque algunos grupos también miden el tiempo de investigación olfativa (olfatear), ya sea manualmente⁷ o utilizando sistemas computarizados comerciales^8,9,10. En segundo lugar, la prueba de tres cámaras se utiliza principalmente para medir el tiempo total empleado por el sujeto en cada cámara, y descuida la dinámica conductual. Por último, se basa en un solo aspecto del comportamiento social, que es el tiempo que pasa el sujeto en cada cámara (o el tiempo de olfateo, si se mide).

Aquí presentamos un sistema experimental novedoso y asequible que es una alternativa al aparato de tres cámaras. También permite la realización de las mismas pruebas de comportamiento mientras se resuelven las advertencias antes mencionadas. El sistema conductual presentado mide de forma automática y directa el comportamiento de investigación de un roedor hacia dos estímulos. Además, analiza la dinámica de comportamiento de una manera independiente del observador. Además, este sistema mide múltiples parámetros de comportamiento y los analiza tanto a nivel individual como poblacional; por lo tanto, apoya un análisis riguroso del comportamiento social y su dinámica durante cada prueba. Además, el reposicionamiento aleatorio de las cámaras en esquinas opuestas de la arena durante las diversas etapas de prueba neutraliza cualquier efecto de la memoria espacial o preferencia. Este sistema también se puede utilizar para otras pruebas de discriminación, como la discriminación sexual. El aparato personalizado es fácil de producir, y el sistema de análisis es accesible públicamente como un código de código abierto, lo que permite su uso en cualquier laboratorio. Demostramos la capacidad de este sistema para medir múltiples parámetros de comportamiento social en cepas de roedores con colores de piel distintos durante las pruebas de preferencia social y preferencia de novedad social. También validamos la capacidad del sistema para revelar la dinámica modificada del comportamiento social en roedores después de manipulaciones, como el recorte de bigotes.

Software TrackRodent: tres algoritmos fueron escritos en MATLAB (2014a-2019a) para rastrear el sujeto experimental y sus interacciones con los estímulos. Todos los algoritmos se depositaron en GitHub, que se encuentran en . El objetivo principal de los cuatro algoritmos es rastrear los contornos del cuerpo del sujeto para detectar cualquier contacto directo con las áreas de estímulos.

Algoritmo basado en cuerpo: este algoritmo tiene tres versiones que rastrean los contornos de un ratón oscuro sin cable sobre un fondo blanco (BlackMouseBodyBased), un ratón blanco sobre un fondo oscuro (WhiteMouseBodyBased) o una rata blanca sobre un fondo oscuro (WhiteRatBodyBased ). La interfaz gráfica de usuario (GUI) del software requiere que el experimentador elija un experimento utilizando ratones o ratas y, a continuación, seleccione el código correcto. Para cada versión del algoritmo, hay dos códigos opcionales: uno que presenta el proceso de seguimiento en la pantalla mientras realiza el análisis, y otro que no (por lo tanto, se ejecuta más rápido y se denomina "rápido"). Por ejemplo, los nombres de los códigos relevantes para el algoritmo BlackMouseBodyBased son: "BlackMouseBodyBased23_7_14" y "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Todos los algoritmos que terminan con "rápido" no muestran el seguimiento en línea, y los usuarios deben guardar directamente los datos en el archivo de resultados (archivo .mat). Todos los algoritmos basados en el cuerpo requieren establecer un único umbral ("umbral bajo" en la GUI del software) para detectar el cuerpo del sujeto.

Algoritmo basado en la direccionalidad de la cabeza: el segundo algoritmo, que está disponible sólo para ratones negros, se basa en el algoritmo basado en el cuerpo, además de determinar la direccionalidad de la cabeza. Este algoritmo detecta las interacciones de la cabeza del sujeto con las áreas de "estímulos", evitando así falsos positivos que pueden surgir de contactos aleatorios del sujeto' con estas áreas. Para este algoritmo, se definen dos umbrales de detección de contornos corporales del ratón: umbral alto, que incluye la cola más brillante de ratones negros, y umbral bajo, que incluye el cuerpo sin cola. A partir de entonces, el algoritmo ajusta un elipsoide a los límites detectados utilizando el umbral inferior y define la ubicación de la cabeza y la cola del ratón (sin distinción entre los dos). La discriminación final entre la cola y la cabeza se basa en los límites definidos por el umbral superior.

Algoritmo animal cableado: el tercer algoritmo tiene como objetivo minimizar los artefactos resultantes de cables (es decir, alambre eléctrico o fibra óptica) conectados al animal, permitiendo el análisis del comportamiento del animal mientras está conectado a un cable. Este algoritmo tiene códigos sólo para ratones negros y ratas blancas. El código para ratas requiere que el experimentador defina umbrales bajos y altos, mientras que el código del mouse solo requiere un umbral bajo.

Protocol

Todos los métodos descritos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Haifa.

1. Configuración experimental

1. Arena
   1. Construir la arena experimental para ratones(Figura 1A,D) colocando una caja de plexiglás blanco o negro (dependiendo del color del animal) (37 cm x 22 cm x 35 cm) en medio de una cámara acústica (60 cm x 65 cm x 80 cm, hecha de madera de 2 cm de espesor recubierta en el interior con espuma de 2 cm de espesor). Para la luz, retire una tira (2 cm de ancho, 10 cm por debajo del techo de la cámara) de la espuma alrededor de la cámara acústica (además de la puerta), y conecte una tira LED con bombillas rojas o blancas. Asegúrese de que la luz sea lo más uniforme posible alrededor de la arena para evitar reflejos.
   2. Construir la arena para ratas de forma similar a la descrita anteriormente para ratones, con diferentes dimensiones que se ajustan adecuadamente al tamaño de las ratas Sprague-Dawley (SD)(Figura 1G). Coloque una caja de plexiglás negro (50 cm x 50 cm x 40 cm) en medio de una cámara acústica (90 cm x 60 cm x 85 cm, hecha de madera de 2 cm de espesor recubierta en el interior con espuma de 2 cm de espesor).
2. Cámaras
   1. Para ratones, cree dos cámaras triangulares blancas o negras (dependiendo del color del pelaje) (12 cm isósceles, 35 cm de altura, con los suelos cerrados) a partir de plexiglás de 6 mm de espesor. Localícelos en dos esquinas opuestas seleccionadas aleatoriamente de la arena(Figura 1B,E). Pegue una malla metálica (18 mm x 6 cm; agujeros de 1 cm x 1 cm) en la parte inferior de cada cámara utilizando pegamento epoxi para permitir interacciones directas con el estímulo a través de la malla(Figura 1C,F). Marque cada cámara de una manera que permita la discriminación de los demás en un video sin dar pistas a los sujetos (véase la Figura 1B,E para ver ejemplos).
      NOTA: Cada cámara eventualmente contendrá un estímulo social (ratón) u objeto (juguete plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma y color distintivos; Figura 1C, I inserciones). Deje que el olor a pegamento epoxi se evapore durante al menos una semana antes de su uso.
   2. Para las ratas, cree dos cámaras triangulares negras (20,5 cm isósceles, 40 cm de altura, hechas de plexiglás de 6 mm de espesor, con los pisos cerrados) y colóquelas en dos esquinas opuestas seleccionadas aleatoriamente de la arena(Figura 1H),cada una con una malla metálica (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm agujeros) cubriendo su parte inferior(Figura 1I).
3. Coloque una cámara monocromática de alta calidad, equipada con una lente gran angular, en la parte superior de la cámara acústica y conéctela a un ordenador para permitir una visualización y grabación claras del comportamiento del sujeto utilizando software comercial (consulte la Tabla de Materiales para sugerencias).

2. Paradigma conductual

NOTA: Los pasos 2.1-2.7 describen el paradigma de comportamiento para los ratones. Consulte la sección 2.8 para obtener instrucciones específicas sobre ratas.

1. Asegúrese de que las jaulas de todos los animales (sujetos: ratones macho de 2-4 meses de edad; estímulos: 21-30 ratones juveniles de un día de edad) permanezcan en la sala experimental durante al menos 1 h antes de comenzar el experimento conductual.
2. Después del período de aclimatación, inserte dos cámaras vacías en la arena aleatoriamente en dos esquinas opuestas. Coloque el sujeto en el centro de la arena durante 15 minutos de habituación. Durante ese tiempo, coloque los dos estímulos sociales, cada uno en una cámara diferente situada fuera de la arena para la habituación. Coloque un objeto (un juguete de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma y color distintos) en otra cámara.
3. Para realizar la prueba de preferencias sociales (SP), inicie la grabación de vídeo y siga grabando hasta el final de la prueba.
4. Retire las dos cámaras vacías e inserte inmediatamente el objeto y uno de los estímulos sociales, cada uno en una cámara distinta. Localiza estas cámaras al azar en las esquinas opuestas de la arena que estaban vacías durante la habituación. Permita que el sujeto interactúe con los estímulos durante los 5 minutos de la prueba SP. Al final de la prueba, detenga la grabación.
5. Después de la prueba de SP, retire las cámaras que contienen estímulos de la arena y deje al sujeto en la arena vacía durante 15 minutos. Limpie las cámaras desde el exterior con toallitas de etanol al 10%.
6. Para realizar la prueba de preferencia de novedad social (SNP), iniciar la grabación de vídeo e insertar dos cámaras en la arena: una que contiene el mismo estímulo social utilizado para la prueba SP (estímulo familiar), y la otra que contiene el nuevo estímulo social. Coloque estas cámaras aleatoriamente en dos esquinas opuestas de la arena, asegurándose de que estas ubicaciones no se utilizaron para la prueba SP. Permita que el sujeto interactúe con los estímulos durante los 5 minutos de la prueba SNP.
7. Al final de la prueba SNP, detenga la grabación de vídeo, retire el sujeto y las cámaras de la arena, y coloque el sujeto de nuevo en su jaula de inicio. Deje los estímulos en las cámaras para el siguiente experimento (con otro sujeto) o devuélvalos a sus jaulas domésticas. Limpie la arena y las cámaras con agua corriente seguida de un 10% de etanol y deje secar.
8. Paradigma conductual para ratas
   1. Para las ratas, repita el paradigma conductual descrito en los pasos 2.1-2.7, con dos modificaciones: 1) manejar los sujetos de rata y habituatar los estímulos sociales a las cámaras durante 2 días (10 min cada día) antes del experimento; y 2) extender la prueba DE SP durante 15 minutos para dar a las ratas un período más largo de exposición a estímulos sociales. Más tarde, restrinja el análisis de la prueba SP a los 5 min iniciales.
      NOTA: Se necesita al menos una arena y cinco cámaras para ejecutar una sola sesión.

3. Uso de la GUI trackRodent para el análisis del comportamiento

NOTA: Consulte el panel superior de la Figura 2A para la GUI trackRodent.

1. Abra MATLAB (probado con 2014a-2019a) y elija la carpeta TrackRodent.
2. Agregue todas las subcarpetas a la ruta de trabajo haciendo clic con el botón derecho en cada carpeta y seleccionando Agregar a la ruta de acceso . Carpetas y subcarpetas seleccionadas.
3. Escriba TrackRodent en la ventana de comandos y pulse Intro.
4. Cargue un solo archivo o varios archivos de vídeo (formato AVI o MP4) seleccionando Cargar archivo de sesión (AVI).
5. Un inspector de películas, que permite la inspección del clip de vídeo fotograma a fotograma, se abrirá inmediatamente para el primer archivo de la lista(Figura 2A). Utilícelo para examinar el clip de vídeo y definir el primer y el último fotograma del segmento que se va a analizar. Registre los números de estos fotogramas, que serán necesarios más adelante. Cierre la ventana cuando haya terminado.
6. Para inspeccionar archivos de vídeo adicionales, abra el inspector de vídeo en cualquier momento pulsando Inspeccionar película y seleccionando un archivo de vídeo específico.
7. Seleccione las especies probadas (ratón o rata; ratón es el valor predeterminado).
8. Excluir todas las áreas que puedan interrumpir el seguimiento, de acuerdo con los colores del sujeto y la arena (blanco o negro).
   1. Para excluir un área determinada, pulse Excluir áreay, después de que el cursor cambie a una forma transversal, marque todas las esquinas del área para la exclusión. Cuando haya terminado, haga clic con el botón derecho en el ratón y, a continuación, haga doble clic con el botón izquierdo en el centro del área marcada. El área excluida se convertirá en un tono de rojo en la pantalla. Repita este procedimiento para excluir tantas áreas como sea necesario.
9. Para eliminar un área de la exclusión, pulse Eliminar área excluiday, a continuación, (con el cursor cruzado) haga clic en el área que desea eliminar de la exclusión.
10. Para definir cada cámara como un área de "estímulo", para la detección automática de su investigación por el sujeto, elija la forma del área de "estímulo" para que sea poligonal o elíptica marcando la casilla apropiada, luego presionando Estímulo X (donde "X" representa 1, 2 o 3). Marque las áreas de "estímulo" de forma similar a las áreas excluidas, que luego se convertirán en de color amarillo. Para cambiar la ubicación de un área de "estímulo" específica, pulse Estímulo X de nuevo y marque la nueva ubicación del área (esto actualizará automáticamente la ubicación).
    NOTA: Elija el número de estímulos diferente de una manera coherente para todos los archivos (es decir, objeto como estímulo 1 para todos los archivos de prueba SP).
11. Para realizar un seguimiento de la presencia del sujeto en un compartimento virtual específico dentro de la arena, elija la forma del área 'compartimento' (polígono o elíptica) y, a continuación, pulse Compartimiento X (donde "X" representa 1, 2, 3, 4 o 5). Marque las áreas 'compartimento' de forma similar a las áreas excluidas o de estímulos, que luego se convertirán en de color azul. Para cambiar la ubicación de un área específica de "compartimento", pulse el Compartimiento X de nuevo y marque la nueva ubicación del área (esto actualizará automáticamente la ubicación).
12. Elija el algoritmo deseado (BlackMouseBodyBased se utilizó para el vídeo) de la lista (consulte los algoritmos disponibles en la Figura 2B).
13. Escriba los números de fotogramas iniciales y finales para el análisis en los cuadros de edición correspondientes de la GUI.
14. Elija un umbral para detectar el cuerpo del sujeto.
    NOTA: La mayoría de los algoritmos utilizan el umbral "Bajo" solamente, mientras que los algoritmos basados en direccionalidad de la cabeza utilizan el umbral "Alto", también. Para el umbral "Bajo", elija un nivel que incluya el cuerpo del ratón/rata sin la cola (en la medida de lo posible), mientras que el umbral "Alto" también debe incluir la cola. En el caso de utilizar algoritmos basados en direccionalidad de la cabeza, el software determinará la ubicación de la cabeza como opuesta a la ubicación de la cola.
    NOTA: El software más adelante ignorará los objetos pequeños detectados utilizando el umbral elegido.
15. Para evaluar la detección automática de los bordes del sujeto para un umbral determinado, inserte un valor en el campo de umbral correspondiente y pulse Intro en el teclado.
16. Al elegir varios archivos, desplácese al siguiente archivo (mediante el botón Siguiente en la parte superior) y seleccione las definiciones adecuadas para cada archivo. Cuando haya terminado, verifique los parámetros y las ubicaciones de área para todos los archivos moviéndose entre cada uno, usando los botones Anterior y Siguiente en la parte superior de la GUI.
    NOTA: Las definiciones de todas las áreas y parámetros son específicas de un archivo determinado.
17. Para iniciar el análisis de comportamiento de todos los archivos seleccionados, desplácese al primer archivo y pulse Iniciar.
18. Al final del análisis, se guarda un archivo de resultados (archivo .mat) para cada película en el mismo directorio de los archivos de película.
    NOTA: Si se utiliza la versión lenta (no rápida) del algoritmo, también guardará una versión de la película con una cruz blanca del centro de la masa corporal, que cambia su color cada fotograma que se detecta como investigador, a menos que el botón Guardar película analizada de la GUI esté desmarcado. Esta versión de la película (guardada en el mismo directorio, con el mismo nombre que la película original, con el sufijo 'película analizada') se puede utilizar sin conexión para evaluar la calidad de la detección automática realizada por el sistema.

4. Uso de la GUI TrackRodent para la presentación de resultados

NOTA: Consulte el panel inferior de la Figura 2A para ver la presentación de los resultados.

1. Para inspeccionar los resultados de cada archivo de película, presione Cargar archivo de resultados y elija los archivos .mat generados por el análisis de comportamiento.
2. Mover entre los botones de alternancia para examinar en pantalla cualquiera de los siguientes análisis: Rastreo de ubicación del ratón(Figura 2A); Ocupación de compartimentos a lo largo de la sesión (si se definieron, no se han mostrado los "compartimentos"); Exploración de estímulos a lo largo de la sesión(Figura 2C); Tiempo total en compartimentos (si se han definido "compartimentos"); y el tiempo total de exploración de estímulos(Figura 2D).
   NOTA: Las áreas de "estímulo" son áreas en las que el software evalúa la interacción del sujeto, mientras que las áreas "Compartimiento" son áreas en las que el software rastrea la presencia del sujeto. Detener el análisis mediante el botón Detener análisis guardará automáticamente los resultados generados hasta el último fotograma analizado. Para la mayoría de los equipos, debe ser posible cargar y analizar hasta 20 películas a la vez (dependiendo del rendimiento del equipo).

5. Uso de la GUI TrackRodentPopulationSummary para el análisis de población (Figura 2E)

1. Abra MATLAB (probado con 2014a-2019a) y elija la carpeta TrackRodent.
2. Escriba TrackRodentPopulationSummary en la ventana de comandos y pulse Intro.
3. Cargue varios archivos de resultados TrackRodent (formato .mat) pulsando Elegir archivosde resultados .
4. Rellene los números de Apellido para análisis, Nombre de prueba, Nombre de estímulo 1y Nombre de estímulo 2.
5. Elija los análisis deseados de la lista de análisis opcionales marcando todas las casillas apropiadas.
6. Elija Exportar resultados a una hoja de cálculo marcando la casilla correspondiente para extraer todos los resultados de los análisis marcados como un único archivo de hoja de cálculo.
7. Pulse Iniciar y espere hasta que se complete el análisis.
   NOTA: Esto concluye el análisis. El software se puede utilizar para analizar los resultados de tantos archivos de película como desee, dado que todos fueron analizados de comportamiento utilizando el software TrackRodent. El análisis realizado por el software supone la grabación de vídeo a una velocidad de fotogramas de 30 Hz. En el caso de que se utilizara una velocidad de fotogramas diferente, multiplique el tiempo por 30 y divida por la velocidad de fotogramas utilizada para grabar para convertirla en el valor correcto (s).

Results

Uso del sistema para la prueba de preferencias sociales en ratones C57BL/6J
La Figura 1 muestra tres versiones de la configuración experimental. La primera versión(Figura 1A-C) está diseñada para ratones con colores de piel oscura, como ratones C57BL/6J. La segunda(Figura 1D-F) está prevista para ratones con colores de piel brillante, como los rat...

Discussion

El sistema experimental descrito aquí, que fue diseñado como una alternativa al aparato de tres cámaras^2,5, permite la realización de las mismas pruebas mientras se resuelven algunas de sus limitaciones. El uso de cámaras triangulares, que se encuentran en dos esquinas opuestas de la arena rectangular, limita el área de interacción sujeto-estímulo a un plano bien definido, lo que permite un análisis automatizado preciso del comportamiento de la investigación. Una...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (antes PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Cámara monocromática
FlyCap 2.0	FLIR (antes PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Software de grabación de vídeo
Home 5 minutos Pegamento epoxi	Devocon	20845	Para pegar la malla metálica a las cámaras de estímulos de plexiglás
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Entorno de programación
Tableros de plexiglás (6 mm de grosorBlanco o negro)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	Para la construcción de arenas y cámaras de estímulos
Tiras de led rojas (60 leds por metro) conectadas a una fuente de alimentación de 12 V	2012topdeal proveedor de eBay	NaN	Para la iluminación de la cámara acústica