Se describe un método nativo de mancha occidental para analizar la dmerización del factor regulador de interferón endógeno 5 en la línea de células dendríticas plasmáticas CAL-1. Este protocolo también se puede aplicar a otras líneas de celda.
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Artículo de método
Native Polyacrylamidde Gel Electrophesis Análisis de la dimerización endógena IRF5
En este artículo
Resumen
Resumen
El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es un factor de transcripción clave para regular la respuesta inmunitaria. Se activa aguas abajo de la vía de señalización de la respuesta primaria de diferenciación mieloide similar al de peaje 88 (TLR-MyD88). La activación de IRF5 implica fosforilación, dimerización y posterior translocación del citoplasma al núcleo, lo que a su vez induce la expresión génica de varias citoquinas proinflamatorias. Un ensayo de detección para la activación de IRF5 es esencial para estudiar las funciones IRF5 y sus vías relevantes. Este artículo describe un ensayo robusto para detectar la activación endógena de IRF5 en la línea de células dendríticas (pDC) plascitoide humanas CAL-1. El protocolo consiste en un ensayo de electroforesis no desnaturalizador modificado que puede distinguir IRF5 en sus formas monómero y dimer, proporcionando así un enfoque asequible y sensible para analizar la activación IRF5.
Introducción
El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es un importante regulador de la transcripción que desempeña un papel destacado en la regulación de la respuesta inmunitaria, particularmente en la liberación de citoquinas proinflamatorias e interferones de tipo I (IFN)1,2 ,3. La desregulación de IRF5 es un factor que contribuye a numerosas enfermedades autoinmunes, como lo demuestran varios polimorfismos en el locus IRF5 que están asociados con lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide,etc. 4, 5
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Protocolo
NOTA: El protocolo descrito aquí utiliza la línea celular pDC CAL-1 tratada con resiquimod (R848), un agonista para TLR7/8. Este protocolo se ha aplicado a otros tipos de células humanas y murinas, incluyendo RAW 264.7 (línea de macrófagos murinos), THP-1 (línea celular monocítica humana), BJAB (línea celular B humana), Ramos (línea celular B humana) y MUTZ-3 (línea de células dendríticas humanas)23.
1. Estimulación de células CAL-1
- Mantener el cultivo celular CAL-1 en un matraz T75 a 37oC y 5% deCO2 en condiciones estériles con 20 a 25 ml de medio RPMI 1640 que contiene un 5% de....
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Resultados
El inmunoblot (IB) con un anticuerpo anti-IRF5 se realizó en células CAL-1 no estimuladas o estimuladas con 1 g/ml R848 durante 2 h(Figura 1). Se prepararon los lysates celulares y se realizó el PAGE nativo. En las células CAL-1 no estimuladas, IRF5 se detectó como una sola banda en la PÁGINA nativa, correspondiente a su forma monomérica. Tras el tratamiento de las células CAL-1 con R848 durante 2 h, el nivel de monómero IRF5 disminuyó con un aumento simultáneo en la acumulación de una banda.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí es un PAGE nativo modificado que distingue las formas monoméricas y dimericas de IRF5 endógeno. Ha habido pocos estudios que informan de la detección de activación endógena IRF5 utilizando la técnica especializada de citometría de flujo de imágenes23,27,28,30. Este protocolo utiliza una técnica común y reactivos y herramientas comunes para evaluar el estado de activac.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por la financiación de la Fundación Croucher y los fondos de inicio de la Universidad de la Ciudad. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Chow por su ayuda con el experimento y la lectura crítica del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Life Technologies, fuente de alimentación HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anticuerpo anti-IRF5 | Bethyl Laboratories, EE. UU. | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (seguro para cámara frigorífica) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| Tampón EDTA, pH 8, 0,5 M 4x 100 | mL Life Technologies | ||
| Glicerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Cabra anti-ratón IgG DyLight 800 Anticuerpo conjugado | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Cabra anti-Conejo IgG DyLight 800 Anticuerpo conjugado | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa Halt (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Combo de módulo de transferencia de mini tanque; Módulo de transferencia, accesorios | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% geles, kit de 10 pocillos | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonilfenil Polietilenglicol | Tin Hang/ Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) | Bio-gen/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Kit de ensayo de proteínas II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | ||
| Cloruro de sodio | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Desoxicolato de sodio ≥ 97% (valoración) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris Life Technologies, HK | 15504020 | ||
| TWEEN 20 Tin | Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
Referencias
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that....
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Reimpresiones y permisos
