Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.
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Artículo de método
Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes
En este artículo
Resumen
Resumen
En los organismos vivos, la hiperpermeabilidad intestinal es un síntoma grave que conduce a muchas enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Caenorhabditis elegans es un modelo animal no mamífero que es ampliamente utilizado como un sistema de ensayo debido a su corta vida útil, transparencia, rentabilidad y falta de problemas de ética animal. En este estudio, se desarrolló un método para investigar los efectos de diferentes bacterias y 3,3'-diindolylmethane (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans con un sistema de análisis de imagen de alto rendimiento. Los gusanos fueron infectados con diferentes bacterias intestinales o cotratados con DIM durante 48 h y alimentados con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran durante la noche. Luego, se examinó la permeabilidad intestinal comparando las imágenes de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia dentro de los cuerpos de gusanos. Este método también puede tener el potencial de identificar bacterias intestinales probióticas y patógenas que afectan la permeabilidad intestinal en el modelo animal y es eficaz para examinar los efectos de los productos químicos nocivos o que promueven la salud en la permeabilidad intestinal y la salud intestinal. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones considerables a nivel genético, especialmente para determinar qué genes se alteran para controlar la enfermedad, ya que este método se utiliza principalmente para la determinación fenotípica. Además, este método se limita a determinar exactamente qué sustratos patógenos causan inflamación o aumentan la permeabilidad de los intestinos de los gusanos durante la infección. Por lo tanto, se requieren más estudios en profundidad, incluida la investigación del mecanismo genético molecular utilizando bacterias y nematodos mutantes, así como el análisis de componentes químicos de bacterias, para evaluar completamente la función de las bacterias y los productos químicos para determinar la permeabilidad intestinal.
Introducción
La permeabilidad intestinal se considera como una de las principales barreras relacionadas con la microbiota intestinal y la inmunidad a la mucosa y es probable que se vea afectada por varios factores, como modificaciones de la microbiota intestinal, deterioro epitelial o alteraciones de la capa de moco1. Documentos recientes han reportado protocolos eficaces para medir la permeabilidad intestinal de las células intestinales humanas cultivadas mediante el análisis de las tasas de flujo de fluorescencia a través de la capa de células intestinales2, pero menos documentos de investigación presentan un procedimiento adecuado....
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Protocolo
1. Preparación de P. aeruginosa PAO1 y Escherichia coli OP50 Cultura
- Preparar 500 ml de medio esterilizado Luria-Bertani (LB)(Tabla 1) e inocular una sola colonia de P. aeruginosa en el medio. Incubar el cultivo durante 14 a 15 h a 37oC con una velocidad de agitación de 150 rpm.
- Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.
- Retire el sobrenadante hasta que el volumen sea de 50 ml (una décima parte del volumen inicial) y vuelva a suspender el pellet bacteriano.
- Conservar el cultivo bacte....
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Resultados
Después de la incubación con P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostró un aumento significativo en la fluorescencia FITC-dextran en el cuerpo del gusano en comparación con la fluorescencia mostrada después de la incubación con las otras dos cepas bacterianas(Figura 1). Las intensidades de fluorescencia de los gusanos alimentados con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 y E. faecalis KCTC3206 fueron de 100,0 a 6,6, 369,7 a 38,9 y 105,6 a 10,6%, respectivam.......
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Discusión
Mediante la utilización de este nuevo método para determinar la permeabilidad intestinal en C. elegans, que combina la microscopía de fluorescencia automatizada y el análisis cuantitativo de imágenes, las diferencias causadas por microorganismos intestinales o productos químicos se pueden determinar in vivo, específicamente en el intestino de C. elegans. Este protocolo es útil para las investigaciones de permeabilidad intestinal y aplicable a muchas tareas, como la determinación reactiva de especies de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una beca de investigación intramuros del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea (2E29563).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3,3'-diindolilmetano | Sigma | D9568 | |
| 90&veces; Placas de Petri de 15 mm | SPL Life Sciences, Corea del Sur | 10090 | |
| 60× Placas de Petri de 15 mm | SPL Life Sciences, Corea del Sur | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Solución de formaldehído | Sigma | F1635 | |
| Infusión Cerebro-Corazón (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Tipo salvaje | |
| Colesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Placa de ensayo, 96 pocillos negros con fondo plano transparente sin tratar, sin tapa Poliestireno | Corning incorporado | REF. 3631 | |
| Dimetilsulfóxido Sigma | D2650 | ||
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Colección coreana para cultivo tipo | KCTC NO. 3206 | anaeróbica falcutiva |
| OP50 | Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) | ||
| Isotiocianato de fluoresceína - dextrano | Sigma | FD10S | |
| Software Harmony | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medio | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Medio de montaje acuoso de montaje fluorado | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS Sistema de análisis de alto contenido | PerkinElmer | ||
| Peptona | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Colección Coreana para Cultivo Tipo | KCTC NO. 1637 | |
| Cloruro de Sodio | Fisher Biorreactivos | BP358-1 | |
| Microscopio estereoscópico | Nikon, Japón | SMZ800N | |
| Extracto de levadura | Becton Dickinson | REF. 212750 |
Referencias
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J.
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Reimpresiones y permisos
