Las complejidades tisulares de los sistemas multicelulares confunden la identificación de la relación causal entre las señales extracelulares y los comportamientos celulares individuales. Aquí, presentamos un método para estudiar el vínculo directo entre las señales dependientes del contacto y los ejes de división utilizando los blastómeros embrionarios de C. elegans y las perlas adhesivas de poliestireno.
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Artículo de método
Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo
En este artículo
Resumen
Resumen
En los sistemas multicelulares, las células individuales están rodeadas por las diversas señales físicas y químicas procedentes de las células vecinas y el medio ambiente. Esta complejidad tisular confunde la identificación de la relación causal entre las señales extrínsicas y la dinámica celular. Un sistema multicelular reconstituido sintéticamente supera este problema al permitir a los investigadores probar una señal específica mientras elimina a otros. Aquí, presentamos un método para reconstituir patrones de contacto celular con caenorhabditis elegans blastomere aislado y perlas adhesivas de poliestireno. Los procedimientos implican la eliminación de cáscara de huevo, el aislamiento de blastomero al interrumpir la adhesión celular, la preparación de perlas adhesivas de poliestireno y la reconstitución del contacto de células celulares o de cuentas celulares. Por último, presentamos la aplicación de este método para investigar la orientación de los ejes de división celular que contribuye a la regulación del patrón celular espacial y la especificación del destino celular en el desarrollo de embriones. Este método in vitro robusto, reproducible y versátil permite el estudio de las relaciones directas entre los patrones de contacto de células espaciales y las respuestas celulares.
Introducción
Durante el desarrollo multicelular, los comportamientos celulares (por ejemplo, el eje de división) de las células individuales se especifican mediante varias señales químicas y físicas. Entender cómo la célula individual interpreta esta información, y cómo regulan el ensamblaje multicelular como una propiedad emergente es uno de los objetivos finales de los estudios de morfogénesis. El organismo modelo C. elegans ha contribuido significativamente a la comprensión de la regulación a nivel celular de la morfogénesis como la polaridad celular1,el patrón de división celular1,la decisión del destino celular
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Protocolo
1. Preparación de perlas adhesivas de poliestireno
NOTA: Este protocolo no requiere técnica aséptica.
- Pesar 10 mg de perlas de poliestireno modificadas de carboxilato en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Para lavar las perlas, agregue 1 ml de tampón de ácido etanosulfónico (MES) de 2-(N-morpholino) en el tubo. Dado que el tampón MES no contiene fosfato ni acetato, lo que puede reducir la reactividad de carbodiimida, es adecuado para su uso en la reacción de acoplamiento de proteínas. Vortex el tubo para mezclar las perlas.
- Gire el tubo durante 60 s a 2.000 x g a través de una centrífuga de sobremes....
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Resultados
Para la preparación de perlas, determinamos la cantidad óptima de éster de succinimidil Rhodamine Red-X para la cepa transgénica que expresa GFP-miosina II y mCherry-histone(Figura 1A-D). Usamos mCherry etiquetó la histona como un marcador de progresión del ciclo celular. Debido a que tanto Rhodamine Red-X y mCherry serán iluminados por un láser de 561 nm, la intensidad óptima de la señal De Rhodamine Red-X es comparable a la de la histona para permitir la toma simultánea de.......
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Discusión
La reconstitución de patrones de contacto celular simplificados permitirá a los investigadores probar las funciones de patrones de contacto celular específicos en diferentes aspectos de la morfogénesis. Hemos utilizado esta técnica para demostrar que el eje de división celular está controlado por el contacto físico con cuentas adhesivas10. Como especificación del eje de división es crucial para el desarrollo multicelular al contribuir a la morfogénesis14,división de células.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a James Priess y Bruce Bowerman por su asesoramiento y suministro de cepas de C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto y Life Sciences Institute Imaging Core Facility por compartir equipos y reactivos, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim para el mantenimiento de C. elegans y la lectura crítica de nuestro manuscrito. Nuestro trabajo cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida | Alfa Aesar | AAA1080703 | Para la preparación del cordón |
| Conjunto de tubo de aspiración | Drummond | 21-180-13 | Para el aislamiento de blastómeros. |
| Cepa de Caenorhabditis elegans: N2, cepa N2 de | Caenorhabditis Genetics Center | utilizada | en este estudio |
| Cepa de Caenorhabditis elegans: KSG5, genotipo: zuIs45; itIs37 | en casa | Cepa KSG5 | utilizada en este estudio |
| Mircopipets calibrados, 10 y micro; L | Drummond | 21-180-13 | Para el aislamiento de blastómeros |
| Perlas de poliestireno modificado con carboxilato (30 µ m de diámetro) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | Para la preparación de perlas |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos. |
| Clorox | Clorox | N. A. | Para el aislamiento de blastómeros. Abra un frasco nuevo cuando el tratamiento con hipoclorito no funcione bien. |
| Portacubreobjetos | En casa | N.A. | Para el aislamiento de blastómeros. |
| Microscopio de disección: Zeiss Stemi 508 con soporte M. La fuente de luz es LED incorporada. El aumento del ocular es de 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | Para el aislamiento de blastómeros. |
| Suero fetal bovino, Qualified One Shot, origen canadiense | Gibco | A3160701 | Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos. |
| Uso general y precisión Glide Agujas hipodérmicas, calibre 25 | BD | 14-826AA | Para el aislamiento de blastómeros |
| Inulina Alfa Aesar | AAA1842509 | Para el aislamiento de blastómeros | |
| MEM Solución vitamínica (100x) | Gibco | 11120052 | Para el aislamiento de blastómeros. |
| MES (Cristales Blancos Finos) | Fisher BioReagents | BP300-100 | Para la preparación de cuentas |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | Para el aislamiento de blastómeros |
| PBS, solución salina tamponada con fosfato, 10 x Polvo | Fisher BioReagents | BP665-1 | Para la preparación de perlas |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140148 | Para el Aislamiento de blastómeros. |
| Polivinilpirrolidona | Fisher BioReagents | BP431-100 | Para el aislamiento de blastómeros |
| Cloruro de potasio | Bioshop | POC888 | Para el aislamiento de blastómeros |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5 isómeros | Sondas moleculares | R6160 | Para la preparación de perlas |
| Schneider' s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | Para el aislamiento de blastómeros. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos. |
| Cloruro de sodio | Bioshop | SOD001 | Para el aislamiento de blastómeros |
| Solución de hidróxido de sodio, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | Para el aislamiento de blastómeros |
| Microscopio confocal de disco giratorio: Yokogawa CSU-X1, visor invertido Zeiss Axiovert, cámara Quant EM 512, lente de objetivo apocromático 63X NA 1.4 Plan. El sistema estaba controlado por Slidebook 6.0. | Innovación en Imágenes Inteligentes | N.A. | Para imágenes en vivo |
| Filtros de jeringa, PTFE, Basix no estéril | 13100115 | para el aislamiento de blastómeros. | |
| Tygon S3 Tubo de laboratorio, Formulación E-3603, Diámetro interior 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | Para el aislamiento de blastómeros. |
| Tygon S3 Tubo de laboratorio, Formulación E-3603, Diámetro interior 6,35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | Para el aislamiento de blastómeros. |
Referencias
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner....
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Reimpresiones y permisos
