Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

Resumen

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Resumen

La señalización paracrina derivada de tumores es un componente pasado por alto de la inmunosupresión local y puede conducir a un entorno permisivo para el crecimiento continuo del cáncer y la metástasis. Las señales paracrinas pueden implicar el contacto de células celulares entre diferentes tipos de células, como PD-L1 expresada en la superficie de los tumores que interactúan directamente con PD-1 en la superficie de las células T, o la secreción de ligandos por una célula tumoral para afectar a una célula inmune. Aquí describimos un método de cocultivo para interrogar los efectos de los ligandos secretados por tumores en la activación de células inmunitarias (macrofago). Este sencillo procedimiento utiliza soportes permeables a membrana de policarbonato de 0,4 m disponibles comercialmente y placas de cultivo de tejido estándar. En el proceso descrito, los macrófagos se cultivan en la cámara superior y las células tumorales de la cámara inferior. La presencia de la barrera de 0,4 m permite el estudio de la señalización intercelular sin la variable de contacto físico de confundente, ya que los dos tipos de células comparten el mismo medio y la exposición a ligandos paracrinos. Este enfoque puede combinarse con otros, como alteraciones genéticas del macrófago (por ejemplo, el aislamiento de ratones noqueadores genéticos) o tumores (por ejemplo, alteraciones mediadas por CRISPR) para estudiar el papel de factores y receptores secretos específicos. El enfoque también se presta a análisis biológicos moleculares estándar, como la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa (qRT-PCR) o el análisis de manchas occidentales, sin necesidad de clasificar el flujo para separar las dos poblaciones celulares. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) se pueden utilizar de manera similar para medir los ligandos secretados para comprender mejor la interacción dinámica de la señalización celular en el contexto de tipo de célula múltiple. La duración de la cocultura también puede variar para el estudio de eventos regulados temporalmente. Este método de cocultivo es una herramienta robusta que facilita el estudio de las señales secretadas por tumores en el contexto inmune.

Introducción

Estudios recientes se han centrado en la capacidad de las células cancerosas para evitar la detección por células inmunitarias, suprimir la activación inmune local o producir un ambiente tolerogénico tumor-permisivo en el microambiente tumoral. Se han descrito dos amplias clases de interacciones tumorales y de células inmunitarias que facilitan estos efectos: interacciones mediadas por contacto o ligandos secretados por tumores. Uno de los mecanismos más bien estudiados y clínicamente tractables de la inhibición inmune mediada por contacto utilizado por los tumores es la expresión de PD-L1, que interactúa con PD-1 en las células T para inhibir su activación y función<....

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la cosecha y el uso de macrófagos peritoneales murinos se llevaron a cabo en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (UNC) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UNC (IACUC).

1. Cultura de los macrófagos

NOTA: Este procedimiento puede utilizar macrófagos peritoneales primarios (descritos en detalle a continuación), macrófagos derivados de la médula ósea o líneas celulares de macrófagos como J774 (ATCC) o RAW264 (ATCC).

1. Cosecha de macrófagos peritoneales como se describió anteriormente¹⁶

Resultados

Para determinar el efecto de los ligandos secretos por tumores en la polarización de los macrófagos, se utilizó el procedimiento descrito. Los macrófagos peritoneales cultivados en ausencia de células tumorales se utilizaron como controles negativos (sin tratar ) y positivos (IFN y LPS estimulados a 2^o desde la izquierda)(Figura 2A). Alternativamente, los macrófagos peritoneales fueron co-cultivados con células tumorales de melanoma B16F10 (ATCC)(Figura 1A).

Discusión

El ensayo de cocultivo presentado aquí es una modificación de los ensayos previamente establecidos que permite el estudio de factores secretos por tumores en la activación de células inmunitarias. Mientras que el contacto con células celulares es conocido por inducir cambios en la actividad inmune, la capacidad de los ligandos secretados por tumores para modular la activación inmune es menos bien entendida. Describimos un método que, a diferencia del cocultivo directo, se puede utilizar para interrogar cómo los factores .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B16-F10	ATCC	ATCC CRL-6475
kit de síntesis de ADNc	Promega	A3500
DMEM/F12 medios	ThermoFisher Scientific- Gibco	11320033
Suero fetal bovino	Millipore	TMS-013-B
J774A.1	ATCC	ATCC TIB-67
Lipopolisacáridos de Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich	L5293-2ML
Murine M-CSF	Prospec	CYT-439
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific- Gibco	15140122
Pros1 ELISA	MyBioSource	MBS2886720
RAW264.7	ATCC	ATCC TIB-71
Ratón recombinante IFNγ	Kit BioLegend	575302
Sensimix SYBR Low-ROX	Bioline	QT625-05
Transwell soportes permeables	Fisher Scientific	07-200-170
Tripsina-EDTA	ThermoFisher Scientific- Gibco	25200056