Determinación de la identidad y pureza de las células inmunitarias mediante PCR cuantitativo basado en epigenética

Summary

Aquí describimos un método robusto para determinar la identidad y pureza de las células inmunitarias a través de firmas epigenéticas detectadas mediante PCR cuantitativo (qPCR). La desmetilación del ADN en un locus específico sirve como un identificador único para un tipo de célula en particular y permite la identificación de células CD8+, reguladoras o T Th17.

Abstract

Las frecuencias de población de subtipos de células inmunes pueden tener un gran efecto en la eficacia de las terapias de células T. Los métodos actuales, como la citometría de flujo, tienen requisitos específicos de la muestra, alta entrada de muestra, son de bajo rendimiento y son difíciles de estandarizar, todos los cuales son perjudiciales para la caracterización de los productos de terapia celular durante su desarrollo y Fabricación.

Los ensayos descritos en este documento identifican y cuantifican con precisión los tipos de células inmunitarias en una mezcla heterogénea de células utilizando ADN genómico aislado (ADN g). Los patrones de metilación del ADN se revelan a través de la conversión de bisulfito, un proceso en el que las citosinas no metiladas se convierten en uracilos. Las regiones de ADN no metiladas se detectan a través de la amplificación qPCR utilizando imprimaciones dirigidas a áreas convertidas. Se mide un locus único por ensayo y sirve como un identificador preciso para un tipo de celda específico. Los ensayos son robustos e identifican las células CD8+, reguladora y T Th17 de una manera de alto rendimiento. Estos ensayos optimizados se pueden utilizar potencialmente para pruebas en proceso y de liberación de productos para el proceso de terapia celular.

Introduction

El uso de linfocitos T en la inmunoterapia celular ha aumentado significativamente en la última década, especialmente con la llegada de la tecnología de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR)¹. Si bien las terapias basadas en células T se han encontrado con gran éxito clínico, son heterogéneas y las características e identidades celulares pueden variar significativamente entre los donantes². La heterogeneidad de las poblaciones de células T puede tener importantes impactos en la eficacia terapéutica y complicar las conclusiones de los ensayos clínicos. Por esta razón, es crucial entender la heterogeneidad de los células T durante la fabricación y formulación del producto para determinar las formulaciones óptimas de las inmunoterapias de células T.

En un sentido amplio, los linfocitos T se pueden dividir en dos grupos: los linfocitos T auxiliares CD4+, que secretan citoquinas inmunomoduladoras, y las células T citotóxicas CD8+, que lisa directamente las células que presentan el antígeno cognado en las moléculas principales del complejo de histocompatibilidad (MHC) I. Las células T auxiliares CD4+ pueden diferenciarse en una gran variedad de subconjuntos específicos que producen un conjunto único de citoquinas. Algunos sugieren que una proporción definida de células T CD4+ a CD8+ en el producto de células finales maximizan la eficacia y persistencia in vivo, pero podrían complicar la fabricación celular³. Las células T reguladoras (Tregs), un subconjunto de células T CD4+, son inmunosupresoras y disminuyen la activación de las células inmunitarias. Las células T reguladoras se han implicado en la mediación de la tolerancia tumoral y, si están presentes durante la fabricación de células T CAR, pueden inhibir la respuesta inmune antitumoral de las células T CAR^4,5,6. Otros subconjuntos de CD4+ como las células T t helper 17 (Th17) promueven el aclaramiento tumoral y se pueden aprovechar para aumentar la eficacia de las terapias con células T. Por lo tanto, el aumento de las células T Th17 CD4+ es de especial interés en entornos de tumores sólidos donde el aumento de la producción de interleucina 17 (IL-17) promueve la respuesta inmune antitumoral^5,7,8,9. Comprender la importancia de las células Th17 en las respuestas tumorales ha llevado a realizar más investigaciones sobre estrategias para generar estas células in vitro^7,9. Por lo tanto, los métodos para detectar estos subconjuntos de células T son cruciales para optimizar las terapias de células T y deben ser robustos, fáciles, escalables y reproducibles.

La citometría de flujo es el método más común para determinar la identidad de una célula inmune. Sin embargo, la citometría de flujo requiere células vivas e intactas que deben analizarse el mismo día en que se cosechan. Para la tinción intracelular de citoquinas (ICS), se requiere inhibición de la secreción de proteínas para retener las citoquinas dentro de las células T. Sin embargo, diferentes compuestos inhibidores tienen efectos diferenciales en la secreción de citoquinas específicas, obligando a los usuarios a crear cócteles especializados para la detección de la citoquina de interés^10,11. Además, la fidelidad de la citometría de flujo se basa en clones de anticuerpos que se unen específicamente y con fuerza a su objetivo. El uso de diferentes clones de anticuerpos puede causar resultados variables y conducir a conclusiones imprecisas, lo que dificulta el estandarizamiento del método¹². Además, el análisis de los datos recopilados a través de la citometría de flujo, y por lo tanto las conclusiones extraídas de los datos, puede variar mucho entre los usuarios en función de cómo se establecen las puertas^13,14. Por estas razones, la citometría de flujo no es ideal para un control preciso de la calidad durante el desarrollo de la terapia celular.

La evaluación de la metilación genómica en loci genéticos específicos es un método alternativo para determinar la identidad celular. La razón de utilizar la metilación del ADN para identificar tipos de células específicas se ha descrito en varios artículos y se basa en patrones de metilación específicos presentes en una población celular determinada^15,16,17. En las células diana, ciertos sitios contienen nucleótidos no metilados, mientras que en las células no objetivo estos sitios se metilan. Este patrón se puede detectar mediante la conversión de bisulfito, un proceso que convierte exclusivamente nucleótidos de citosina no metilados (C) a uracilo (U). Los imprimadores y sondas se pueden diseñar contra los sitios convertidos, luego amplificados y detectados a través de qPCR^16.

El ensayo descrito en el presente documento mide la frecuencia de los subtipos de células inmunitarias dentro de poblaciones heterogéneas cuantificando el número de loci específicos no metilados en comparación con un gen de limpieza. Las copias de los elementos reguladores no metilados para el gen CD8 B se miden en el ensayo CD8, FoxP3 en Treg y IL-17 en Th17 en este ensayo. Estos loci se identificaron aislando la población celular específica de interés (por ejemplo, células T CD8+) y realizando la secuenciación de bisulfito para identificar los loci que no se metilan solo en ese tipo de célula^15. Las imprimaciones y sondas se desarrollan contra los loci únicos no metilados y las muestras se analizan a través de qPCR. Una curva estándar de números de copia conocidos se crea a partir de diluciones de un plásmido estándar de número de copia alto, lo que permite la conversión de un valor Ct a un número de copia de transcripción.

Para evaluar el rendimiento del ensayo, se requieren muestras de control, incluyendo un gDNA de referencia y un plásmido calibrador. El material genómico de referencia es una muestra de sangre agrupada de múltiples donantes con frecuencias de células inmunitarias conocidas y se utiliza para una comprobación del rendimiento del ensayo de control de calidad (QC). La muestra del calibrador es un plásmido sintetizado que contiene las secuencias genéticas CD8, FoxP3 y GAPDH en una proporción equimolar. Se utiliza como medida de la eficiencia de conversión de bisulfito, porque las conversiones de bisulfito dentro de diferentes regiones genómicas variarán en eficiencia. La relación entre el objetivo y el GAPDH dentro del calibrador es 1, pero debido a las diferencias de la eficiencia de conversión del bisulfito, la relación puede variar. Este factor de calibración se aplica a los ensayos CD8 y Treg. FoxP3, el gen utilizado en el ensayo Treg, se encuentra en el cromosoma X. Debido a que este ensayo mide sólo copias no metiladas de FoxP3, y sólo una copia de FoxP3 no se metila en Tregs, este ensayo es agnóstico sexual y se puede utilizar con muestras masculinas y femeninas¹⁸. El ensayo Th17 no utiliza una muestra de calibrador o GAPDH como gen de limpieza. En su lugar, se incluye otro conjunto de imprimación dirigido a los loci metilados presentes en las células no Th17 y el número total de células se refleja en la suma de las copias metiladas y no metiladas de IL-17. Los datos obtenidos del qPCR se introducen en una plantilla de análisis predefinida que realiza comprobaciones de control de calidad de los datos y calcula el porcentaje de la celda de destino dentro de la población inicial. Esto proporciona un análisis de datos automatizado e imparcial, eliminando así la subjetividad del usuario y mejorando las capacidades de estandarización.

Este ensayo utiliza ADNes gDNA, que puede ser aislado por un procedimiento de leucoféresis utilizando células cultivadas o fijas, o pellets de células congeladas. El bajo requisito de muestra, la flexibilidad en el material de partida de la muestra, la alta precisión y el análisis estandarizado abordan las limitaciones asociadas con la citometría de flujo y son ideales para fines de control de calidad durante el desarrollo del proceso de terapia celular.

Protocol

Todas las muestras humanas se obtuvieron de una fuente comercial siguiendo sus directrices para la ética de la investigación humana.

1. Aislamiento del ADN genómico

NOTA: El aislamiento del ADN genómico se realiza utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)de cualquier célula hematopoyética, como células mononucleares de sangre periférica (PPB), células T purificadas o cualquier otro tipo de célula hematopoyética. En este experimento, se utilizaron células mononucleares de sangre periférica (PPBCM) y células T de tres donantes humanos diferentes.

1. Coloque 1-2 x 10⁶ células hematopoyéticas en un tubo cónico y centrífuga a 400 x g durante 10 min.
2. Aspira rinde al sobrenadante por completo.
3. Añadir 350 s l de lisis/tampón de unión a la muestra e incubar durante 10 min a 55 oC.
4. Añadir 50 ml de proteinasa K (20 mg/ml) a 350 ml de suspensión celular y vórtice durante 30 s.
5. Añadir 50 l de perlas paramagnéticas de unión al ADN y 400 l de isopropanol 100% e incubar durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
6. Coloque el tubo en un bastidor magnético durante 2 minutos y retire el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar a las perlas. El ADN está unido a las cuentas magnéticas en este paso.
7. Añadir 950 l de tampón de lavado 1. Vórtice para 30 s y repita el paso 1.6.
8. Repita el paso 1.7.
9. Añadir 950 l de tampón de lavado 2. Vórtice para 30 s y repita el paso 1.6.
10. Añadir 100 l de tampón de elución y vórtice durante 2 min. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 1 min y transfiera el sobrenadante que contiene el ADN GDNA a un tubo nuevo.
11. Utilice 1 l del ADNado aislado de las células hematopoyéticas para medir la pureza del ADNr mediante espectrofotometría utilizando un fluorímetro obteniendo el DO a 260 nm, 280 nm y 230 nm. Asegúrese de que la relación de densidad óptica (relación OD) a 260 y 280 nm esté entre 1,7-2,0 y la relación OD a 260 y 230 nm esté entre 1,5-2,4.

2. Preparación de la muestra

1. Precalentar un termomezclador a 56oC.
2. Etiqueta tubos de 2 ml para todas las muestras, calibrador y material de referencia.
3. Diluir las muestras y el calibrador con el búfer de elución (disponible con el kit utilizado para el paso 1) en RT.
   1. Para todas las muestras experimentales, diluir el ADNr a un volumen total de 142 l. Por ejemplo, diluir 4 sL de gDNA a 100 ng/L en 138 ml de tampón de elución.
      NOTA: 400-1,200 ng de gDNA se pueden utilizar para el ensayo.
   2. Diluir 75 l del calibrador a un volumen total de 142 s.
   3. Compruebe la concentración de ADNr de referencia con un espectrofotómetro, utilizando TE (pH a 8,0) como blanco.
   4. Diluir 1.000-1.200 ng del GDNA de referencia a un volumen total de 142 l. Por ejemplo, diluir 10 l de gDNA de referencia a 100 ng/L en 132 ml de tampón de elución.
4. Incubar los tubos a 56oC durante 5 min a 900 rpm en un termomezclador. Gire brevemente por los tubos para recoger las muestras.

3. Conversión de bisulfito

NOTA: Asegúrese de que los tiempos de incubación durante la conversión del bisulfito siguen los tiempos recomendados. La sobreincubación o la subincubación afectarán los resultados del ensayo.

1. Establezca un termomezclador a 80 oC.
2. Añadir 270 l de bisulfito de amonio y 90 l de alcohol tetrahidrofurfuryl (THFA) a todos los tubos. Vórtice para mezclar completamente y brevemente las muestras para recoger el líquido en la parte inferior.
3. Incubar los tubos en un termomezclador a 80oC durante 45 min a 900 rpm. Si utiliza un bloque de calor, vórtice los tubos durante 1-2 s cada 4,5 min durante la incubación.
4. Gire brevemente las muestras y deje enfriar a RT durante 3-5 minutos antes de continuar con el paso 4 o 5. El volumen final debe ser de 500 l.

4. Ensayos CD8 y Treg

1. Purificación del ADN tras la conversión del bisulfito
   NOTA: Este paso se realiza utilizando un kit de purificación de ADN disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)sobre ADN convertido en bisulfito. Asegúrese de que los reactivos estén calentados a RT antes de su uso.
   1. Antes de iniciar la purificación, cree una mezcla homogénea de las perlas paramagnéticas de aislamiento de ADN mediante el vórtice durante 30 s. Añadir etanol e isopropanol a los tampones de lavado, siguiendo los volúmenes enumerados en las botellas, y establecer un bloque de calor a 65 oC.
   2. En RT, agregue 870 s l de tampón de lisis/unión y 105 l de cuentas paramagnéticas de unión al ADN a cada tubo del paso 3.4. Vórtice para mezclar completamente y brevemente girar por los tubos.
   3. Añadir 570 s de 2-propanol y vórtice para mezclar completamente.
   4. Incubar los tubos a RT durante 7 minutos a 50 rpm en un termomezclador o un mezclador giratorio estándar.
   5. Gire brevemente por los tubos. Coloque los tubos en el bastidor magnético e incubar durante 5 min.
   6. Con las muestras todavía en el bastidor magnético, retire el sobrenadante sin perturbar las perlas.
      NOTA: El ADN está unido a las cuentas.
   7. Retire los tubos del bastidor magnético y añada 900 ml de tampón de lavado 1. Vortex los tubos para resuspender completamente las cuentas y luego girar brevemente por los tubos.
   8. Vuelva a colocar los tubos en el bastidor magnético e incubar durante 3 min.
   9. Con las muestras todavía en el bastidor magnético, retire el sobrenadante sin perturbar las perlas.
   10. Repita los lavados (4.1.7-4.1.9), una vez con tampón de lavado 1, luego dos veces con tampón de lavado 2.
   11. Después de retirar el sobrenadante, gire brevemente por los tubos y vuelva al bastidor magnético durante 3 minutos.
   12. Retire todo el tampón de lavado residual 2 y retire los tubos del bastidor magnético.
   13. Seque las perlas con las tapas del tubo abiertas a 65 oC durante 15 minutos.
   14. Añadir 60 ml de tampón de elución a cada tubo e incubar a RT durante 7 min a 1.400 rpm. Alternativamente, el vórtice a una velocidad moderada usando un adaptador de espuma.
   15. Gire brevemente por los tubos y colóquelos en el bastidor magnético durante 2 minutos.
   16. Transfiera 55 ml de eluido a un tubo nuevo sin alterar las perlas. El eluido contiene el ADN convertido en bisulfito. No es necesario medir la concentración de ADN.
2. Configurar y ejecutar qPCR
   1. Encienda la máquina qPCR y el ordenador que opera su software.
   2. En la interfaz de usuario de software, cree un nuevo experimento y seleccione qué bloque se está utilizando para ejecutar el experimento.
   3. Seleccione Curva estándar como tipo de experimento.
   4. Si procede, seleccione la química de detección que desea utilizar. Este ensayo utiliza los reactivos TaqMan. De lo contrario, seleccione ROX como referencia pasiva.
   5. Si procede, seleccione las propiedades del instrumento que se ejecuten como Estándar.
   6. Defina su diseño experimental asignando objetivos (por ejemplo, GAPDH o CD8 con FAM como reportero) y un quencher no fluorescente.
   7. Asigne nombres de ejemplo para los estándares, ejemplos y controles.
   8. A continuación, asigne cada posición del pozo de acuerdo con la placa qPCR. Cada pozo requiere un destino, como CD8 o GAPDH, y un nombre de muestra. Cada muestra se ejecuta en triplicado y debe reflejarse en el diseño de la placa para el instrumento.
   9. Asigne a cada estándar la tarea Estándar y especifique los números de copia final de acuerdo con el Cuadro 1.
   10. Asigne muestras, calibrador y haga referencia a la tarea Desconocido.
   11. Designe pozos para ningún control de plantilla como NTC o N.
   12. Preparar las diluciones en serie del ADN lambda (10 ng/L) que se utilizarán como norma (véase el Cuadro 1).
   13. Prepare cócteles de mezcla maestro qPCR, uno para el tipo de celda de destino y otro para GAPDH (ver Tabla 2). Ejecute todas las muestras, estándares y el control NTC en triplicado.
       NOTA: GAPDH se utiliza para cuantificar el número total de celdas y se ejecuta en paralelo con la amplificación de destino. Las copias de los elementos reguladores no metilados para el gen CD8 B se miden en el ensayo CD8, FoxP3 en Treg y IL-17 en Th17.
   14. Utilice una placa de 96 pocillos para qPCR. Cargue primero el ADN de la plantilla de 3 l de ADN de la plantilla. A continuación, cargue 7 l de la mezcla maestra.
   15. Selle la placa con una película qPCR y gire brevemente hacia abajo la placa antes de colocarla en el instrumento qPCR.
   16. Funcione con el qPCR tal y como se muestra en del Cuadro 3.
   17. Después de la finalización de la ejecución, exporte los datos qPCR como un archivo .txt o .xlsx.
   18. Analice los datos utilizando las plantillas de análisis para el ensayo CD8 y el ensayo Treg (consulte Tabla de materiales)para calcular el promedio Ct, la desviación estándar Ct y el número de copia.

Número de copia inicial del plásmido/3 l	Volumen	ADN diluyente [1]	Número de copia final por 3 sL	Etiqueta
31250	1000 l	-	31250	STD-1
31250	200 l	800 l	6250	STD-2
6250	200 l	800 l	1250	STD-3
1250	200 l	800 l	250	STD-4
250	200 l	800 l	50	STD-5
1250	30 l	1200 l	30	STD 6 [2]
[1] ADN lambda de 10 ng/L en TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
[2] Utilice STD-3 para preparar el STD-6

Tabla 1: Preparación de diluciones estándar. Se prepararon estándares de dilución de 4 registros que abarcan 31250-30 copias de acuerdo con la tabla utilizando ADN TE/lambda como diluyente. Se utilizaron las mismas diluciones estándar tanto para CD8 como para GAPDH. Las normas se almacenaban a -20 oC.

Reactivos	Cantidad
ADN lambda (50 ng/L en TE, pH8.0)	1 L
Ensayo de TaqMan	0,5 l
Sin agua, sin nucleasas	0,5 l
Master Mix	5 l
Total	7 L

Tabla 2: Preparación del cóctel qPCR. Prepare la mezcla maestra qPCR en dos tubos separados, uno para CD8 y GAPDH, excluyendo el ADN de la plantilla según la tabla.

Paso	hora	Temp	Ciclos
Pre-incubación	35 min	95oC	1X
Amplificación	15 seg	95oC	50X
	1 min	61oC
Enfriamiento	5 seg	42oC	1X

Tabla 3: qPCR ejecutar parámetros para el ensayo CD8 y Treg. El qPCR se ejecutó según los parámetros especificados en la tabla.

5. Ensayo Th17

1. Purificación del ADN tras la conversión del bisulfito
   1. Realice los pasos de purificación descritos en la sección 4.1.
   2. Para eluir las muestras, añadir 25 l de tampón de elución a cada tubo e incubar a RT durante 7 minutos a 1.400 rpm. Alternativamente, el vórtice a una velocidad moderada usando un adaptador de espuma.
   3. Gire brevemente por los tubos y colóquelos en un bastidor magnético durante 2 minutos.
   4. Transfiera 20 ml de eluido a un tubo nuevo sin alterar las perlas. El eluido contiene el ADN convertido en bisulfito.
2. Preamplificación de ADN
   NOTA: Se recomienda la preamplificación de ADN para objetivos de baja abundancia para una cuantificación precisa a través de qPCR¹⁹. El ensayo de metilación Th17 fue diseñado para requerir preamplificación por esta razón.
   1. Transfiera 2 ml de ADN convertido en bisulfito a los tubos de tiras de PCR. Cree un tubo NTC con 2 ml de agua.
   2. Cree la mezcla maestra de preamplificación para todas las muestras (consulte la Tabla 4).
   3. Añadir 23 l de la mezcla maestra a cada tubo. Tapar los tubos, vórtice, y girar brevemente por los tubos.
   4. Ejecute el protocolo de preamplificación en un termociclador con una tapa calentada. (Tabla 5). Una vez finalizada la carrera, gire brevemente por los tubos.
   5. Transferir 2 l del ADN amplificado a tubos nuevos y añadir 78 ml de agua, diluyendo las muestras 1:40.
3. qPCR configurar y ejecutar
   1. Siga la sección 4.2 para configurar y ejecutar el qPCR.
4. Analice los datos utilizando la plantilla de análisis para el ensayo Th17 (consulte Tabla de materiales)para calcular el promedio ct, la desviación estándar Ct y el número de copia.

Reactivo	Cantidad
Sin agua, sin nucleasas	9,5 l
Hot Start PCR Master Mix	12,5 l
Th17 PCR Primer	1 L
Total	23 l

Tabla 4: Pre-amplificar el ADN para el ensayo Th17. La mezcla maestra de reacción de preamplificación se preparó de acuerdo con la tabla.

Paso	hora	Temp	Ciclos
Pre-incubación	35 min	95oC	1X
Desnaturalización	1 min	95oC	12X
Recocido	45 seg	55oC
Alargamiento	30 seg	72oC
Alargamiento final	10 min	72oC	1X
Mantener	Indefinida	4oC

Tabla 5: ADN De amplifido Th17. El ADN Th17 fue preamplificado durante 12 ciclos antes del qPCR real.

Results

Los tres ensayos de metilación comienzan con una entrada de ADN)g y dan como resultado un porcentaje de células T CD8+, Células Treg o Th17 dentro de toda la población celular. Los datos generados a partir de la qPCR después de la conversión de bisulfito se analizaron utilizando la plantilla de análisis proporcionada. Esta plantilla utilizaba las curvas estándar obtenidas de las muestras estándar para estimar el número de copia de los objetivos y el recuento total de celdas en las muestras de prueba. A continuación, el tipo de celda de porcentaje se calculó utilizando las fórmulas integradas en las plantillas de análisis. La Figura 1 muestra datos representativos del ensayo CD8+, obtenidos a partir del análisis de células mononucleares de sangre periférica (PPBPC) y células T de tres donantes diferentes utilizando tanto la citometría de flujo como el ensayo de metilación descrito. Las tendencias entre los dos métodos entre todos los donantes en ambos tipos de células fueron similares. La Figura 2 muestra los datos representativos del ensayo Treg. Se analizaron tres donantes de Treg purificados utilizando qPCR basado en metilación y citometría de flujo y los resultados se trazaron en el gráfico mostrado. Los resultados de ambos métodos fueron relativamente similares. Sin embargo, en todos los casos la citometría de flujo produjo valores más altos. La Figura 3 muestra la comparación de las células Th17 detectadas a través de la citometría de flujo y la metilación. En este gráfico, hay condiciones estimuladas y no estimuladas para los métodos experimentales. Las células requieren estimulación con PMA y ionomicina y tratamiento con un inhibidor de transporte proteico para aumentar la cantidad de IL-17A presente dentro de cada célula para que pueda ser detectada a través de la citometría de flujo²⁰. El estado de metilación se puede detectar independientemente del estado de estimulación. La citometría de flujo produjo niveles más bajos de células Th17 en comparación con la metilación. La sensibilidad y especificidad del ensayo se demostró por el límite de valores en blanco (LOB), límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) que se muestran en el Cuadro 6.

Figura 1: Comparación de flujo y metilación de porcentajes CD8+ para PBMCys y células T para tres donantes diferentes. Se ensayaron pbMC y células T de tres donantes diferentes para el porcentaje de células T CD8+ en toda la población utilizando citometría de flujo o metilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de flujo y metilación de porcentajes de Treg para Treg purificado para tres donantes diferentes. Las células Treg purificadas se ensayon para el porcentaje de células Treg en toda la población utilizando citometría de flujo o metilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de flujo y metilación de los porcentajes de Th17 para grupos experimentales estimulados y no estimulados. Las células T estimuladas y no estimuladas se analizaron utilizando tanto la citometría de flujo como la metilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayo	Lob	Lod	Loq
CD8	0	19	52
Gapdh	0	7	21
FoxP3	0	3	12
Th17 TpG	0	35	73
Th17 CpG	0	38	73

Tabla 6: LoB, LoD, LoQ de números de copia para ensayos basados en metilación. La sensibilidad y especificidad del ensayo se detalla en los valores de LoB, LoD y LoQ obtenidos por las directrices^21,22de MIQE. En general, estos ensayos pueden detectar con precisión tan solo 40 copias.

Discussion

Con la llegada de nuevas inmunoterapias, es necesario estandarizar métodos para detectar la identidad y pureza de las células inmunitarias. Los métodos de evaluación para las pruebas en proceso y de liberación que son sólidas, validadas y escalables siguen siendo establecidas y plantean un gran desafío para la comercialización de terapias basadas en células. Mientras que la citometría de flujo es actualmente el método más común para el fenotipado de células inmunitarias, la alta calidad de la muestra y los requisitos de cantidad hacen que sea difícil para el uso regular. Además, la implementación de la citometría de flujo en un entorno de buenas prácticas de fabricación (GMP) está limitada por las estrategias de medición dependientes del operador y el requisito de normas de referencia para cada marcador utilizado^13,14. Aunque se ha demostrado que el gating automatizado mejora la robustez del ensayo, todavía no es una estrategia de control de calidad bien establecida. Mientras que el perfil de expresión génica también se puede utilizar para caracterizar la identidad y pureza del producto de terapia celular, los datos son semicuantitativos e intensivos en mano de obra. Además, el ARN y el microARN son relativamente menos estables que el ADN y pueden contribuir a la falta de resultados robustos y reproducibles. Por lo tanto, la utilización del estado epigenético de metilación del ADN de un locus específico proporciona un método estable, fácil de realizar, robusto y escalable para identificar y cuantificar un tipo de interés celular.

La detección de patrones de metilación a células fenotipo se basa en tres pasos críticos: En primer lugar, el ensayo requiere el uso de gDNA, que se aísla según los métodos descritos. Se requiere ADN de alta calidad y si no se utiliza, la conversión de bisulfito puede verse afectada^23,24. Si se obtiene ADN de baja calidad, se recomienda una purificación adicional para garantizar la fiabilidad del ensayo. En segundo lugar, se requiere una conversión exitosa de bisulfito de la citosina no metilada a uracilo. El paso más crítico en la conversión de bisulfito es la desnaturalización del ADN^23,25. La desnaturalización a alta temperatura mediante bisulfito de amonio, a diferencia del bisulfito sódico, aumenta la eficiencia y consistencia de conversión y es el proceso recomendado para estos ensayos^25,26. Los usuarios deben asegurarse de que la reacción se produce a 80 oC y de que la mezcla de muestras se realiza con frecuencia. Por estas razones, se recomienda un termomezclador digital (ver Tabla de Materiales). En tercer lugar, se debe seguir la técnica de pipeteo adecuada durante la preparación del qPCR. Se requieren tres réplicas técnicas durante la reacción qPCR para adherirse a la información mínima para la publicación de las directrices cuantitativas de experimentos de PCR en tiempo real (MIQE)^27. La inclusión de réplicas más técnicas es aceptable, pero no necesaria. Una técnica de pipeteo incorrecta y/o no incluir réplicas técnicas dará lugar a resultados qPCR poco fiables.

Si se siguen los pasos críticos y los resultados deseados aún no se obtienen, se pueden aprovechar varios controles dentro del ensayo para identificar el problema. La conversión adecuada de bisulfito es el paso más crucial en este ensayo. La conversión incorrecta de bisulfito se resaltaría por un factor de calibración fallido y/o valores de referencia calculados por la plantilla de análisis. Si la conversión del bisulfito se realizó incorrectamente (por ejemplo, si la reacción se llevó a cabo en RT), no habría amplificación durante qPCR. Además, no se vería ninguna amplificación si se cometió un error durante la preparación de la reacción qPCR (por ejemplo, si no se agregó la mezcla maestra qPCR). Estos dos problemas se pueden separar investigando las muestras estándar. La amplificación en las muestras estándar, pero no la referencia, el calibrador y las muestras experimentales, indicaría que la conversión del bisulfito no se realizó correctamente. Ninguna amplificación en ninguna de las muestras indicaría que el qPCR no se realizó correctamente.

Si bien este ensayo aborda el estricto requisito de muestra y la variabilidad de análisis asociados con otros métodos de fenotipado, específicamente la citometría de flujo, hay limitaciones que deben tenerse en cuenta. Este ensayo se dirige a un único locus que se utiliza como un identificador único para la celda de destino, lo que prohíbe el análisis multiplexado que se realiza comúnmente con la citometría de flujo. Esto dificulta la identificación de tipos de células complejas como el Th17. Sin embargo, el uso de patrones de metilación en un solo locus ha demostrado ser un marcador fenotípico preciso de múltiples células y se ha utilizado en múltiples ensayos clínicos^15,16. Esto es cierto especialmente en Tregs, donde la evaluación de las firmas de metilación FOXP3 es un método preciso e inequívoco para detectar Tregs verdaderos de células de expresión de FOXP3^{transitoriamente 28.} La pérdida de análisis multiplexado se compensa con la precisión de los loci interrogados. Las iteraciones futuras del ensayo podrían incluir varios colorantes qPCR y quenchers para permitir la detección de múltiples loci en una reacción qPCR.

Este ensayo se puede utilizar como un método alternativo para la citometría de flujo en la determinación del fenotipo de célula y la identidad. Cabe señalar que este ensayo no produce los valores exactos que hace la citometría de flujo(Figuras 1-3). Esto se debe en parte a la variabilidad del análisis de datos asociado con la citometría de flujo. Dependiendo de la estrategia de gating, los resultados de la citometría de flujo pueden variar significativamente. Este es especialmente el caso cuando se utilizan protocolos de tinción complejos para mirar objetivos intracelulares, como IL-17, donde el coeficiente de variación (CV) puede ser tan alto como 15%¹⁴. Entre varios usuarios, el ensayo presentado consistentemente tenía un CV de <15%, apoyando la robustez del ensayo y la mejora de las capacidades de estandarización. Las mayores diferencias entre el fenotipado epigenético y basado en citometría de flujo se ven cuando se requiere estimulación celular(Figura 3). La detección de células Th17 a través de citometría de flujo se logró utilizando un protocolo común para la estimulación de células T y la tinción de citoquinas intracelulares^29,30,31. Las diferencias que se ven en el fenotipado Th17 entre la medición epigenética y la citometría de flujo podrían deberse a la cinética de la producción de IL-17. Si bien las firmas de metilación son constantes, la producción de proteínas lleva tiempo y debe estar presente en cantidades suficientes para ser detectadas por anticuerpos fluorescentes^20,32. Es posible que sea necesario ampliar la incubación de 6 h con inhibidor de transporte de proteínas y cóctel de estimulación celular para ver el nivel de células Th17 detectadas a través de métodos de fenotipado basados en epigenética. Se necesitan más estudios para determinar la razón precisa por la que los valores no coinciden y determinar el método de fenotipado más preciso.

En este informe, detallamos cómo identificar y cuantificar los tipos de células inmunitarias en una mezcla heterogénea de células de una manera sencilla y robusta. Los ensayos están diseñados y optimizados para su uso potencial para pruebas en proceso y de liberación de terapias basadas en células. Los ensayos descritos cumplen con el requisito de que las materias primas altamente calificadas se utilicen en aplicaciones de terapia celular. Al abordar las deficiencias de la citometría de flujo y otros métodos moleculares como la estabilidad, los requisitos de la muestra, la estimulación previa, la permeabilización celular para la tinción intracelular y la subjetividad del análisis de datos, los ensayos descritos están en línea con los objetivos de comercialización de terapias basadas en células.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,0 ml Tubos Eppendorf Safe-Lock	Eppendorf
para el ensayo			Haga clic aquí
Plantilla de análisis para el ensayo			Th17Haga clic aquí
Plantilla de análisis para el ensayo			Haga clic aquí
Attune NxT Citómetro de enfoque acústico, azul/rojo/violeta6/amarillo	Thermo Fisher Scientific	A29004
CTS PureQuant CD8+ Ensayo de células T Thermo	Fisher Scientific	A43674
CTS Ensayo PureQuant Th17	Thermo Fisher Scientific	A43676
CTS Ensayo PureQuant Treg	Thermo Fisher Scientific	A43675
Dynabeads SILANE Kit de ADN genómico	Thermo Fisher Scientific	37012D	Se utiliza para el aislamiento y purificación genómico del ADN después de la conversión de bisulfito. Contiene tampón de elución para diluir muestras.
Imán DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	Se utiliza como bastidor magnético durante el aislamiento y la purificación del ADN
Kit de fenotipado de células T humanas esenciales de eBioscience	Thermo Fisher Scientific	A42923
Kit de fenotipado Th1/Th17 humano esencial de eBioscience	Thermo Fisher Scientific	A42927
Kit de fenotipado Treg humano esencial de eBioscience	Thermo Fisher Scientific	A42925
Eppendorf SmartBlock 2 mL	Eppendorf	5362000035
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
HulaMixer Mezclador de muestras	Thermo Fisher Scientific	15920D	Mezclador de muestras recomendado
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND 1000
Microfuge antiadherente sin RNasa Tubos, 1,5 mL	Applied Biosystems	AM12450
QuantStudio 12S Flex	Applied Biosystems	4470661
TE, pH 8,0, sin RNasa	Thermo Fisher Scientific	AM9849
Mezclador de vórtice	Thermo Fisher Scientific	H2KT17113