Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.

Resumen

La liberación de trampas extracelulares (ET) por neutrófilos se ha identificado como un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación crónica. Las ET de neutrófilos (NET) consisten en una malla de ADN, proteínas de histona y varias proteínas de gránulos (es decir, mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G). Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos, también pueden producir ETs; sin embargo, en qué medida esto ocurre in vivo y si las trampas extracelulares de macrófagos (MET) desempeñan un papel en los mecanismos patológicos no se han examinado en detalle. Para comprender mejor el papel de los MET en las patologías inflamatorias, se desarrolló un protocolo para visualizar la liberación de MET de los macrófagos humanos primarios in vitro, que también se puede explotar en experimentos de inmunofluorescencia. Esto permite una mayor caracterización de estas estructuras y su comparación con los ET liberados de neutrófilos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) producen MET al exponerse a diferentes estímulos inflamatorios después de la diferenciación al fenotipo proinflamatorio M1. La liberación de METs se puede visualizar mediante microscopía utilizando una mancha de ácido nucleico fluorescente verde que está impermeant a las células vivas (por ejemplo, SYTOX verde). El uso de macrófagos primarios recién aislados, como el MMDM, es ventajoso en el modelado de eventos inflamatorios in vivo que son relevantes para posibles aplicaciones clínicas. Este protocolo también se puede utilizar para estudiar la liberación de MET de las líneas celulares de monocitos humanos (por ejemplo, THP-1) después de la diferenciación en macrófagos con acetato de mirista phorbol u otras líneas celulares de macrófagos (por ejemplo, las células J774A.1 similares a los macrófagos murinos).

Introducción

La liberación de ETs de neutrófilos se identificó por primera vez como una respuesta inmune innata desencadenada por una infección bacteriana¹. Consisten en una columna vertebral del ADN a la que se unen varias proteínas de gránulos con propiedades antibacterianas, incluyendo la aslastasa de neutrófilos y mieloperoxidasa². El papel principal de las ET de neutrófilos (NET) es capturar patógenos y facilitar su eliminación³. Sin embargo, además del papel protector de las ET en la defensa inmunitaria, un número cada vez mayor de estudios también han descubierto un papel en la patogénesis de la enferme....

Protocolo

Los HMDM fueron aislados de los preparados de capa buffy humana suministradas por el banco de sangre con la aprobación ética del Distrito de Salud Local de Sídney.

1. Cultura HMDM

1. Aislar a los monocitos de las preparaciones de capa buffy preparadas a partir de la sangre periférica de donantes humanos sanos utilizando una preparación disponible comercialmente para aislar linfocitos, seguida de la elutriación centrífuga centrífuga contracorriente^{19, 20}.
2. Confirmar la presencia de monocitos mediante el cytospinning y la tinción con la mancha de Giemsa modificada par....

Resultados

Las imágenes de Brightfield que muestran los cambios morfológicos de la MMDM en respuesta a los estímulos para la diferenciación celular se muestran en la Figura 1. Los macrófagos polarizados M1 de experimentos con HMDM expuestos a IFN y LPS mostraron una forma celular alargada y similar al husillo, como lo indican las flechas negras de la Figura 1 (panel medio). A modo de comparación, la morfología de los macrófagos polarizados M2 después de la exposición de HM.......

Discusión

La generación y visualización de la formación met utilizando HMMam diferenciados M1 representa un nuevo modelo in vitro que puede ser útil para investigar el papel patológico potencial de estas estructuras de macrófagos, particularmente bajo inflamatoriocrónico Condiciones. Proporciona un protocolo robusto para la estimulación de macrófagos humanos primarios para liberar MET, que también se puede utilizar en estudios relacionados con monocitos humanos o líneas celulares de macrófagos murinos. La implementación exitosa de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fuente de luz fluorescente de amplio espectro 120Q	EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canadá		Serie x-CITE
Placa de pocillos múltiples Corning CellBIND (12 pocillos)	Sigma-Aldrich	CLS3336	para cultivo celular
Kit de tinción diferencial Quik (Giemsa modificada)	Polysciences Inc.	24606	Caracterización de monocitos
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Thermo-Fisher	14025050	Para las etapas de lavado y el tratamiento de HOCl
Ácido hipocloroso (HOCl)	Sigma-Aldrich	320331	Para la estimulación de MET
Interferón gamma	Thermo-Fisher PMC4031		Para el cebado M1
Interleucina 4	Ciencias Integradas	rhil-4	Para cebado M2
Interleucina 8	Miltenyl Biotec	130-093-943	Para estimulación MET
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	59202C	Añadido a los medios
de cultivo Lipopolisacárido	Ciencias Integradas	tlrl-eblps	Para cebado M1
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS	1114544	Para el aislamiento de monocitos
Olympus IX71 invertido microscopio	Olympus, Tokio, Japón
Forbol 12- miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	Para la estimulación de MET
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D5652	Para las etapas de lavado
RPMI-1640 medios	Sigma-Aldrich	R8758	Para cultivo celular
SYTOX green	Life Technologies	S7020	para MET visulacionación
TH4-200 fuente de luz de campo claro	Olympus, Tokio, Japón		Serie X-CITE
Factor de necrosis tumoral alfa	Lonza	300-01A-50	Para estimulación MET