Method Article

Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados

DOI:

10.3791/60541

⸱

November 1st, 2019

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La liberación de trampas extracelulares (ET) por neutrófilos se ha identificado como un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación crónica. Las ET de neutrófilos (NET) consisten en una malla de ADN, proteínas de histona y varias proteínas de gránulos (es decir, mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G). Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos, también pueden producir ETs; sin embargo, en qué medida esto ocurre in vivo y si las trampas extracelulares de macrófagos (MET) desempeñan un papel en los mecanismos patológicos no se han examinado en detalle. Para comprender mejor el papel de los MET en las patologías inflamatorias, se desarrolló un protocolo para visualizar la liberación de MET de los macrófagos humanos primarios in vitro, que también se puede explotar en experimentos de inmunofluorescencia. Esto permite una mayor caracterización de estas estructuras y su comparación con los ET liberados de neutrófilos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) producen MET al exponerse a diferentes estímulos inflamatorios después de la diferenciación al fenotipo proinflamatorio M1. La liberación de METs se puede visualizar mediante microscopía utilizando una mancha de ácido nucleico fluorescente verde que está impermeant a las células vivas (por ejemplo, SYTOX verde). El uso de macrófagos primarios recién aislados, como el MMDM, es ventajoso en el modelado de eventos inflamatorios in vivo que son relevantes para posibles aplicaciones clínicas. Este protocolo también se puede utilizar para estudiar la liberación de MET de las líneas celulares de monocitos humanos (por ejemplo, THP-1) después de la diferenciación en macrófagos con acetato de mirista phorbol u otras líneas celulares de macrófagos (por ejemplo, las células J774A.1 similares a los macrófagos murinos).

Introduction

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La liberación de ETs de neutrófilos se identificó por primera vez como una respuesta inmune innata desencadenada por una infección bacteriana1. Consisten en una columna vertebral del ADN a la que se unen varias proteínas de gránulos con propiedades antibacterianas, incluyendo la aslastasa de neutrófilos y mieloperoxidasa2. El papel principal de las ET de neutrófilos (NET) es capturar patógenos y facilitar su eliminación3. Sin embargo, además del papel protector de las ET en la defensa inmunitaria, un número cada vez mayor de estudios también han descubierto un papel en la patogénesis de la enfermedad, particularmente durante el desarrollo de enfermedades impulsadas por la inflamación (es decir, artritis reumatoide y aterosclerosis4). La liberación de ETs puede ser desencadenada por varias citoquinas proinflamatorias incluyendo interleucina 8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF)5,6, y la acumulación localizada de ETs puede aumentar el daño tisular y evocar una respuesta proinflamatoria7. Por ejemplo, las ET se han implicado como un papel causal en el desarrollo de la aterosclerosis8,promoviendo la trombosis9, y prediciendo el riesgo cardiovascular10.

Ahora se reconoce que, además de los neutrófilos, otras células inmunitarias (es decir, células de mástil, eosinófilos y macrófagos) también pueden liberar ET en la exposición a la estimulación microbiana o proinflamatoria11,12. Esto puede ser particularmente significativo en el caso de los macrófagos, teniendo en cuenta su papel clave en el desarrollo, la regulación y la resolución de enfermedades inflamatorias crónicas. Por lo tanto, es importante obtener una mayor comprensión de la relación potencial entre la liberación ET de los macrófagos y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación. Estudios recientes han demostrado la presencia de MET y NETs en placas ateroscleróticas humanas intactas y trombos organizados13. Del mismo modo, los MET se han implicado en la conducción de lesiones renales a través de la regulación de las respuestas inflamatorias14. Sin embargo, a diferencia de los neutrófilos, hay datos limitados sobre los mecanismos de formación de MET a partir de macrófagos. Estudios recientes que utilizan modelos in vitro humanos de formación MET muestran algunas diferencias en las vías involucradas en cada tipo de célula (es decir, con respecto a la ausencia de citrulinación histona con macrófagos)6. Sin embargo, algunos han demostrado que la versión NET también puede ocurrir en ausencia de histona citrullination15.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple y directo para evaluar la liberación de MET en un modelo de macrófagos clínicamente relevante. Hay una serie de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que se han utilizado para estudiar los MET (es decir, la línea celular de monocitos humanos THP-1 y varias líneas celulares de macrófagos murinos)16. Hay algunas limitaciones asociadas con estos modelos. Por ejemplo, la diferenciación de los monocitos THP-1 a los macrófagos generalmente requiere un paso de cebado, como la adición de acetato de mirista phorbol (PMA), que a su vez activa las vías dependientes de la proteína quinasa C (PKC). Este proceso es conocido por desencadenar la liberación de ET4 y da como resultado una liberación basal baja de MET de las células THP-1. Otros estudios han puesto de relieve algunas diferencias en la bioactividad y las respuestas inflamatorias montadas por los macrófagos in vivo en comparación con las células THP-1 tratadas con PMA17.

Del mismo modo, el comportamiento y las respuestas inflamatorias de diferentes líneas celulares similares a macrófagos murinos no representan completamente el espectro de respuesta de los macrófagos humanos primarios18. Por lo tanto, con el fin de investigar la formación de ET de macrófagos en el entorno clínico, se cree que los macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (HMM) son un modelo más relevante en lugar de líneas celulares monocíticas o similares a la murina.

La liberación de ET de los HMMAM polarizados M1 se ha demostrado después de la exposición de estas células a una serie de diferentes estímulos inflamatorios, incluyendo el ácido hipocloroso oxidante derivado de mieloperoxidasa (HOCl), PMA, TNF, e IL-86. Aquí se describe un protocolo para polarizar los HMMAM al fenotipo M1 y visualizar la posterior liberación de MET tras la exposición a estos estímulos inflamatorios. PMA se utiliza como un estímulo de la liberación de MET para facilitar las comparaciones con estudios anteriores que han utilizado neutrófilos. Es importante destacar que HOCl, IL-8 y TNF también se utilizan para estimular la liberación de MET, que se cree que son mejores modelos del ambiente inflamatorio in vivo. El método microscópico para la visualización de la liberación de ET consiste en tinchar el ADN extracelular en cultivos de células vivas utilizando SYTOX green, una mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeable que se ha aplicado con éxito en estudios anteriores de neutrófilos. Este método permite una evaluación rápida y cualitativa de la versión ET, pero no es apropiado como método independiente para la cuantificación de la extensión de liberación ET. Se debe utilizar una metodología alternativa si se requiere cuantificación para comparar el alcance de la liberación de ET resultante de diferentes condiciones o intervenciones de tratamiento.

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Protocol

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Los HMDM fueron aislados de los preparados de capa buffy humana suministradas por el banco de sangre con la aprobación ética del Distrito de Salud Local de Sídney.

1. Cultura HMDM

  1. Aislar a los monocitos de las preparaciones de capa buffy preparadas a partir de la sangre periférica de donantes humanos sanos utilizando una preparación disponible comercialmente para aislar linfocitos, seguida de la elutriación centrífuga centrífuga contracorriente19, 20.
  2. Confirmar la presencia de monocitos mediante el cytospinning y la tinción con la mancha de Giemsa modificada para la caracterización de monocitos19.
  3. En condiciones estériles, ajuste la densidad de los monocitos a 1 x 106 células/ml utilizando medios RPMI-1640 sin suero. Añadir 1 ml de esta suspensión celular a cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Cultivo en una incubadora celular a 37oC en presencia de 5%CO2 durante 2 h para promover la adherencia a la placa de cultivo tisular.
  4. En condiciones estériles, retire los medios celulares y sustitúyalos por medios de cultivo RPMI-1640 completos que contengan 10% (v/v) de suero humano agrupado y 20 mM de L-glutamina.
  5. Cultivo de las células a 37 oC en presencia de 5% co2 en una incubadora de células durante 8 días, cambiando el medio cada 2 días.

2. Polarización del MMDM

  1. En condiciones estériles, prepare los medios de cebado M1 añadiendo interferón (IFN; 20 ng/ml) y lipopolisacárido (LPS; 1 g/mL) a los medios de cultivo RPMI-1640 completos. Prepare los medios de cebado M2 añadiendo interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) a los medios de cultivo RPMI-1640 completos.
  2. En condiciones estériles, aspirar medios de los pozos de la placa de cultivo de tejido que contienen el MMDM, que han sido sembrados y cultivados como se describe en la sección 1.
  3. Lavar cuidadosamente los pozos que contienen las células 3x con PBS estéril (precalentado a 37 oC), utilizando 1 mL alícuotas de PBS.
  4. Agregue 1 ml de los medios de cebado M1 o M2 a cada pocil que contenga el MMDM (lo que sea apropiado para el experimento).
  5. Incubar las células durante 48 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.

3. Estimulación del MMDM para inducir la liberación de MET

  1. En condiciones estériles, prepare los medios de cultivo que contengan diferentes estimuladores de liberación MET (lo que sea apropiado para el experimento) a los medios RPMI-1640 completos: PMA (25 nM), TNF recombinante humano (25 ng/ml), o IL-8 recombinante humano (50 ng/ml) ).
  2. Para los experimentos con estimulación HOCl, prepare HOCl (200 m) en HBSS (precalentado a 37 oC), inmediatamente antes de la adición a las células. Asegúrese de que el HOCl no esté preparado en medios celulares completos.
    NOTA: La concentración de la solución en stock de HOCl se cuantifica midiendo la absorbancia UV de la solución a 292 nm y el pH 116 y utilizando un coeficiente de extinción de 350 M-1cm-121.
  3. Después del tratamiento de polarización descrito en la sección 2, aspirar los medios celulares de cada pocayés y lavar cuidadosamente las células 3 veces con alícuotas de 1 ml de: PBS estéril (para PMA, TNF e IL-8) o HBSS (para HOCl), que han sido precalentadas a 37 oC.
  4. Para experimentos con PMA, TNF o IL-8: agregue 1 ml del medio completo que contiene PMA, TNF o IL-8 después de quitar el PBS en el paso de lavado final.
  5. Para los experimentos con TNF, incubar las células durante 6 h a 37 oC en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células. Para experimentos con PMA e IL-8, incubar las células durante 24 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.
  6. Para experimentos con HOCl, agregue 1 ml de HOCl en HBSS después de retirar el HBSS en el paso final de lavado. Luego, incubar las células durante 15 min a 37 oC en presencia de 5% co2 en una incubadora de células.
    1. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante celular y lavar las células 3 veces con 1 ml de alícuotas de HBSS como se describe en el paso 3.3.
    2. Después de retirar el HBSS del paso de lavado final, agregue 1 ml de medios de cultivo RPMI-1640 completos. Luego, incubar las células durante 24 h a 37 oC en presencia de 5% deCO2 en una incubadora de células.

4. Visualización de MET en la cultura celular en vivo

  1. Preparar el tinte verde SYTOX en HBSS a una concentración de 40 m.
  2. Al final de los tratamientos descritos en la sección 3 para inducir la liberación del MET, agregue directamente 25 ml de 40 oM del tinte a cada pocal que contenga HMDM.
  3. Incubar células a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos en la oscuridad.
  4. Coloque el MMDM en pozos de cultivo de tejidos en la etapa del microscopio de un microscopio fluorescente invertido para la toma de imágenes.
  5. Procedimientos del microscopio
    1. Encienda una fuente de luz fluorescente de amplio espectro, una fuente de luz de campo brillante y un microscopio invertido instalados con una cámara digital a color de alta resolución (consulte Tabla de materiales).
    2. Gire la rueda del filtro a la posición del "número 2" para la fluorescencia verde (excitación de 504 nm, emisión a 523 nm) para la toma de imágenes de las muestras teñidas verdes contenidas en los pozos de cultivo de tejido.
    3. Usando el objetivo 5x, enfoque la imagen con el enfoque grueso, luego las perillas de enfoque fino en el microscopio, hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada cuando se ve a través del ocular del microscopio.
    4. Cambie el microscopio al modo de cámara.
    5. Inicie el software asociado.
    6. Seleccione la pestaña Capturar en el software.
    7. Haga clic en el botón Reproducir para obtener una vista previa de la imagen y ajustar la perilla de enfoque fino en el microscopio hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada en la ventana de vista previa del software.
    8. Haga clic en el botón Capturar.
      NOTA: La imagen capturada se mostrará automáticamente en el software que lo acompaña.
    9. Dentro del software, haga clic en Archivo . Guardar como el tipo de archivo de imagen necesario.
    10. En el microscopio, gire la rueda del filtro a la posición "número 5" para la imagen de campo brillante y repita los pasos 4.5.2–4.5.9 para obtener la imagen de campo brillante correspondiente.
    11. Repita los pasos 4.5.2–4.5.10 según sea necesario para la adquisición posterior de la imagen.

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Results

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Las imágenes de Brightfield que muestran los cambios morfológicos de la MMDM en respuesta a los estímulos para la diferenciación celular se muestran en la Figura 1. Los macrófagos polarizados M1 de experimentos con HMDM expuestos a IFN y LPS mostraron una forma celular alargada y similar al husillo, como lo indican las flechas negras de la Figura 1 (panel medio). A modo de comparación, la morfología de los macrófagos polarizados M2 después de la exposición de HM...

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Discussion

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La generación y visualización de la formación met utilizando HMMam diferenciados M1 representa un nuevo modelo in vitro que puede ser útil para investigar el papel patológico potencial de estas estructuras de macrófagos, particularmente bajo inflamatoriocrónico Condiciones. Proporciona un protocolo robusto para la estimulación de macrófagos humanos primarios para liberar MET, que también se puede utilizar en estudios relacionados con monocitos humanos o líneas celulares de macrófagos murinos. La implementación exitosa de...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por una Beca Perpetua IMPACT (IPAP201601422) y la Beca de Proyecto Biomédico de la Fundación Novo Nordisk (NNF17OC0028990). YZ también reconoce la recepción de un Premio de Posgrado Australiano de la Universidad de Sídney. Nos gustaría dar las gracias al Sr. Pat Pisansarakit y a la Sra. Morgan Jones por la asistencia en el aislamiento de monocitos y el cultivo de tejidos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fuente de luz fluorescente de amplio espectro 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, CanadáSerie x-CITE
Placa de pocillos múltiples Corning CellBIND (12 pocillos)Sigma-AldrichCLS3336para cultivo celular
Kit de tinción diferencial Quik (Giemsa modificada)Polysciences Inc.24606Caracterización de monocitos
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)Thermo-Fisher14025050Para las etapas de lavado y el tratamiento de HOCl
Ácido hipocloroso (HOCl)Sigma-Aldrich320331Para la estimulación de MET
Interferón gammaThermo-Fisher PMC4031Para el cebado M1
Interleucina 4Ciencias Integradasrhil-4Para cebado M2
Interleucina 8Miltenyl Biotec130-093-943Para estimulación MET
L-GlutaminaSigma-Aldrich59202CAñadido a los medios
de cultivo LipopolisacáridoCiencias Integradastlrl-eblpsPara cebado M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Para el aislamiento de monocitos
Olympus IX71 invertido microscopioOlympus, Tokio, Japón
Forbol 12- miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139Para la estimulación de MET
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD5652Para las etapas de lavado
RPMI-1640 mediosSigma-AldrichR8758Para cultivo celular
SYTOX greenLife TechnologiesS7020para MET visulacionación
TH4-200 fuente de luz de campo claroOlympus, Tokio, JapónSerie X-CITE
Factor de necrosis tumoral alfaLonza300-01A-50Para estimulación MET

References

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Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

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