Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

La motilidad mitocondrial y la distribución juegan un papel vital en el cumplimiento de las demandas energéticas variables y especializadas en las neuronas polarizadas. Las neuronas pueden extender axónes extremadamente largos para conectarse con objetivos a través de la formación de sinapsis, que exigen altos niveles de energía para Ca²⁺ amortiguación y corrientes ióndas. El transporte de mitocondrias de soma a axón es fundamental para apoyar la función axonal y sináptica de las neuronas. El movimiento mitocondrial dinámica espacial y temporal se lleva a cabo mediante un transporte axonal rápido a velocidades de varios micrómetros por segundo¹.

Específicamente, las proteínas motoras o adaptadoras, como la cinaína y la dinanina, participan en el transporte rápido de orgánulos a lo largo de los microtúbulos para controlar el movimiento de las mitocondrias^2,3. La actividad neuronal normal requiere el transporte adecuado de las mitocondrias recién ensambladas desde el soma neuronal al axón distal (transporte axonal anterogrado) y el transporte inverso de mitocondrias desde el axón distal de vuelta al cuerpo celular (transporte retrógrado). Estudios recientes han indicado que la asignación mitocondrial inadecuada está fuertemente asociada con defectos neuronales y enfermedades degenerativas de neuronas motoras^4,5. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración, es importante establecer métodos para examinar el movimiento mitocondrial a lo largo de los axons en cultivos vivos.

Hay dos desafíos principales en el examen y análisis del seguimiento de las mitocondrias: (1) identificar las mitocondrias desde el fondo en cada fotograma, y (2) analizar y generar las conexiones entre cada fotograma. Para resolver el primer desafío, se utiliza ampliamente un enfoque de etiquetado de fluorescencia para distinguir las mitocondrias del fondo, como el tinte MitoTracker o la transfección de la proteína de orientación mitocondrial fusionada con fluorescencia (por ejemplo, mito-GFP)^6,7,8. Para analizar la asociación entre fotogramas, en estudios anteriores⁹se han descrito varios algoritmos y herramientas de software. En un artículo reciente, los investigadores compararon cuatro herramientas automatizadas diferentes (por ejemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck y Difference Tracker) para cuantificar el transporte mitocondrial. Los resultados mostraron que, a pesar de las discrepancias en la longitud de la pista, el desplazamiento mitocondrial, la duración del movimiento y la velocidad, estas herramientas automatizadas son adecuadas para evaluar la diferencia de transporte después del tratamiento^10. Además de estas herramientas, un plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf y Seitz) ha sido ampliamente utilizado para analizar el transporte mitocondrial¹¹. Este método genera kymographs que se pueden utilizar para analizar el movimiento mitocondrial, incluyendo la velocidad en direcciones anterogradas y retrógradas.

Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que cambian constantemente en número y morfología en respuesta a condiciones fisiológicas y patológicas. La fiscalidad mitocondrial y la fusión regulan estrechamente la morfología mitocondrial y la homeostasis. El desequilibrio entre la fission mitocondrial y la fusión puede inducir redes mitocondriales extremadamente cortas o largas, lo que puede afectar la función mitocondrial y dar lugar a actividades neuronales anormales y neurodegeneración. El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están implicados en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la paraplejia espástica hereditaria (HSP)^12,13,14,15. El HSP es un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos hereditarios caracterizadopor la degeneración del tracto corticoespinal y la posterior falta de control de los músculos inferiores de las extremidades^16,17. En este estudio, las neuronas forebrain derivadas de iPSC se utilizan para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en HSP. Este método proporciona un paradigma único para examinar la dinámica mitocondrial de los axons neuronales en cultivos vivos.

1. Generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas a partir de ISCs

NOTA: El protocolo detallado para mantener los iPSC y su diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas son similares a los descritos anteriormente^18. Aquí, se introduce y resalta el proceso crítico durante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas.

1. IPSCs de cultivo en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en un medio de células madre embrionarias humanas (hESC) complementados con factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF, 4 ng/mL).
2. Después de la incubación con dosis (1 mg/ml) durante 3 min, disociar los IPSC en pequeños grumos. A continuación, cultivo de los agregados iPSC en suspensión en el medio hESC durante 4 días. Consulte este punto de tiempo, cuando los iPSC comienzan como el cultivo de suspensión, como el día 1 (D1). Cambie el medio diariamente durante 4 días.
3. En D5, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y el cultivo en medios de inducción neuronal (NIM) durante 3 días. Cultivo de los agregados de celda en suspensión durante 3 días cambiando la mitad de los medios cada 2 días. Agregue DMH-1 (2 m) y SB431542 (2 m) al medio NIM para aumentar la eficiencia de inducción neuronal.
4. En D8, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y déjelos adherirse a 6 placas de pozo (alrededor de 20-30 agregados por pozo de la placa) mediante el cultivo en NIM con 10% FBS (o con placas recubiertas de laminina) durante la noche. Al día siguiente, retire el medio antiguo y cambie a NIM cada 2 días hasta D17.
   NOTA: La generación de células neuroepiteliales, que se indica mediante la formación de células columnares con estructuras de roseta, se observa en este período.
5. En D17, aislar mecánicamente las células neuroepiteliales en el centro de las colonias (levantar directamente aplicando una pequeña presión al centro de las colonias) o enzimáticamente (tratada con dispensa). Transfiera las células neuroepiteliales aisladas al matraz T25 de cultivo t25 no tratado que contiene 8 ml de NIM con adición de B27 (1x), campo (1 m) e IGF (10 ng/ml).
   NOTA: El cultivo de suspensión permite a las células formar neuroesferas enriquecidas con progenitores neuronales de proyección cortical.
6. Después de D35, placa las neuroesferas en la poliornitina y lDEV libre de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano(Tabla de materiales)platos de fondo de vidrio recubiertos 35 mm para generar neuronas glutamatérgicas telencéfalas (neuronas de proyección cortical). Antes del revestimiento, disociar las neuroesferas a pequeños racimos incubando con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante 2 min a 37oC.
7. Retire la solución de desprendimiento celular por centrifugación y resuspenda en 1 ml de medio de diferenciación neuronal (NDM). Células de placa en el plato inferior de vidrio (alrededor de cinco racimos en 100 s de medio por plato) para dejarlas acoplar. A continuación, agregue NDM (1 mL por plato) y el cultivo de las células en NDM que contienen B27 (1x), cAMP (1 m), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) y GDNF (10 ng/mL).
   NOTA: Los pequeños racimos están chapados porque sobreviven bien y dan lugar a neuronas de proyección larga. Alternativamente, las células se pueden disociar y chapar a una densidad alrededor de 20.000 células por plato para una mejor separación.
8. Caracterizar las neuronas glutamatérgicas telencéfalas inmunomanchando los marcadores Tbr1 y III-tubulina.

2. Examen del transporte mitocondrial a lo largo de axones de neuronas glutamatérgicas telencéfalas

1. Caliente el NDM y encienda la incubadora para el microscopio de fluorescencia a 37oC y 5%_CO2.
2. Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas forebrain, incubar las neuronas con un tinte fluorescente rojo de 50 nM a las mitocondrias de manchas en células vivas (por ejemplo, MitoTracker CMXRos) en NDM durante 3 min a 37 oC. A continuación, lave las células 2veces con NDM caliente. Las neuronas se incuban en NDM.
3. Para grabar el transporte mitocondrial a lo largo de los axons, tome imágenes de lapso de tiempo del movimiento mitocondrial utilizando el objetivo 40x con un microscopio de fluorescencia.
   NOTA: Para estabilizar el cultivo, realice la imagen de células vivas cuando las células se incuban en la incubadora durante 20 minutos después de la tinción mitocondrial.
4. En el campo de fase, identificar los axons en función de las características morfológicas (directamente emergen del cuerpo de las células neuronales, neurites largos delgados constantes sin ramificación). Las mitocondrias se mueven en anterogrado (del cuerpo celular al axón distal) y direcciones retrógradas (desde el terminal axonal hasta el cuerpo celular). Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axons, identifique claramente los cuerpos celulares de las neuronas. En este paso, enfoque axons en el campo de fase para reducir el fotoblanqueo.
5. Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones. A continuación, capturar el transporte de las mitocondrias dentro de los axons cada 5 s para una duración total de 5 min, produciendo 60 fotogramas. Captura aleatoriamente al menos cinco ubicaciones para cada plato y repite 3 veces para cada grupo.

3. Análisis de datos del transporte mitocondrial y morfología en neuronas corticales

NOTA: Analizar los datos recogidos sobre el transporte mitocondrial utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ o MetaMorph¹⁹). Dado que ImageJ está fácilmente disponible, realice el análisis del transporte mitocondrial y la morfología utilizando ImageJ con los plugins MultiKymograph, Macrosy Analyze particles.

1. Análisis del transporte mitocondrial con ImageJ
   1. Después de capturar las imágenes de lapso de tiempo de la motilidad mitocondrial, analiza la velocidad y el movimiento de las mitocondrias usando el plugin MultiKymograph. Las imágenes se guardan como archivos de formato .tiff, que son analizados por el software de Fiji siguiendo un método reportado previamente²⁰.
   2. Descargue el software Fiji. Descarga plugins que serán necesarios para analizar la velocidad de movimiento mitocondrial de los kymographs. Descargue el paquete de formatos biológicos y kymograph Plugin junto con estos cuatro plugins .class, incluidos: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class y WalkingAverage.class (Tabla de materiales). Mueva estos archivos a la carpeta de plugins de Fiji. Descargue los plugins "tsp050706.txt" en la carpeta plugins. Reinicie el software Fiji cuando los archivos se muevan a la carpeta de plugins.
   3. Abra el software Fiji. Elija pluginsy, a continuación, importe imágenes de la serie .tiff a través de Bio-Formats Importer en Bioformatos. Asegúrese de elegir Standard ImageJ en Stack viewing, elija Open all series, marque Autoscaley, a continuación, haga clic en OK . Tome nota del número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles, que se muestran en la parte superior de la imagen.
      NOTA: Tome 60 fotogramas por imagen.
   4. Considere la posibilidad de hacer las imágenes más claras ajustando el brillo/contraste en el menú Imagen para los 60 fotogramas.
   5. Haga clic con el botón derecho del botón derecho en la herramienta de línea para elegir la línea segmentada y dibuje una línea segmentada a partir del cuerpo de la celda y terminando en el axón terminal. Genere el kymograph eligiendo MultipleKymograph en Plugins. La selección del ancho de línea se solicita después de elegir el MultipleKymograph. Asegúrese de que este es un número impar. Elija 1 para el ancho de línea. Después de este paso se genera un kymograph.
      NOTA: Se pueden leer varias piezas importantes de información del kymograph. El eje Y del kymograph es el tiempo de duración (5 min) para los 60 fotogramas. El eje x representa la posición de los axones seleccionados.
   6. Utilice una línea diagonal en el kymograph para determinar la dirección de movimiento de las mitocondrias (anterogradas, retrógradas o estables). Por ejemplo, una línea que baja a la derecha a lo largo del eje Y indica un movimiento anterogrado, y una línea que baja a la izquierda a lo largo del eje Y indica un movimiento retrógrado. Una línea vertical indica que no hubo movimiento en el mitocondrion.
   7. Mida la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias en movimiento utilizando el plugin Macros en el software Fiji. Ir a Plugins ? Macros de la página de macros de la Instalar ? tsp050607.txt. Dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cimagrafo, y siempre dibuje la línea de la región superior a inferior (eje y).
   8. Después de dibujar la línea, vaya a Plugins Macros de la página de macros de la leer las velocidades de tsp. Puesto que se dibuja una línea segmentada a lo largo del trazado, el plugin lee las velocidades segmentadas correspondientes a la línea.
      NOTA: La unidad para todos los datos es píxeles. dy sum es el tiempo consumido desde el punto de partida, y dx sum indica la distancia del mitocondrion moviéndose en el eje X. dy now y dx ahora muestra el período de tiempo y la distancia de movimiento para cada segmento, respectivamente. velocidad real muestra la velocidad para cada segmento (dx now/dy now). la velocidad media indica la velocidad media para el movimiento mitocondrial (suma dx/suma de dy).
   9. Cambie la unidad de dx ahora de píxel a m como la proporción de píxeles en m midiendo la barra de escala. Convierta la unidad para la distancia de píxel a m midiendo las barras de escala en las imágenes. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala y medir la longitud de la línea seleccionando Medir' en "Analizar. Cambia el tiempo de píxel a segundos, como 1 píxel a 5 segundos en este experimento.
   10. En el archivo de hoja de cálculo, calcule la velocidad media y etiqueta el movimiento retrógrado o anterogrado correspondientemente. Promedio de la velocidad de movimiento anterograda o retrógrada.
   11. Determinar el porcentaje de mitocondrias estacionarias y móviles a partir del kymograph. Las mitocondrias móviles anterogradas o retrógradas se definen como moviéndose 5 m hacia adelante o hacia atrás desde el origen durante todo el período^21. Las mitocondrias se consideran estacionarias si no se movieron más de 5 m durante los 5 minutos.
2. Análisis de la morfología mitocondrial utilizando ImageJ
   NOTA: Determine la morfología mitocondrial mitocondrial midiendo la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto utilizando ImageJ. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.
   1. Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axons, descargue el plugin Straighten_.jar desde el sitio web de ImageJ (consulte Tabla de materiales)y muévalo a la carpeta de plugins. Reinicie el software ImageJ.
   2. Abra la imagen a través de la función abrir en Archivo y convierta la imagen de 32 bits a 8 bits usando Tipo en Imagen.
   3. Dibuja una línea segmentada a lo largo de los axons. Elija Enderezar en Plugins y establezca 50 píxeles para Anchura de filamento/Línea ancha. Esto generará un axón enderezado.
   4. Ajustar el umbral en Imagen y establecer la medida en Analizar seleccionando "Area ? Perímetro de la página de perímetro de la Ajustar la elipse ? Descriptores de forma.
   5. Mida la barra de escala utilizando la función de línea y establezca la escala en Analizar rellenando la distancia en píxeles,conocer la distanciay la unidad de longitud. A continuación, elija Global para establecer esta configuración de escala.
   6. Utilice Analizar partículas en Analizar para determinar el área. Los parámetros de la solicitud son el tamaño (píxel 2) a 0,20–infinito, la circularidad de 0,00 a 1,00 y se muestran a las elipses. Seleccione Mostrar resultados.
      NOTA: La medición producirá los resultados de múltiples parámetros de morfología mitocondrial, incluidos el área, los perímetros, la longitud (mayor), la anchura (menor) y la relación de aspecto (AR). También se muestra el número mitocondrial correspondiente.
   7. Calcule el número mitocondrial por axón (m) utilizando el número mitocondrial dividido por la longitud axonal.

Aquí, los IPSC humanos se diferenciaron en neuronas glutamatérgicas telencéfalas, que se caracterizaban por inmunostaining con marcadores de tubulina Tbr1 y III(Figura 1A). Para examinar el transporte axonal de las mitocondrias, estas células se teñían con un tinte fluorescente rojo y se realizaban imágenes de lapso de tiempo. Dado que ImageJ está fácilmente disponible y es más fácil de obtener, el transporte mitocondrial se analizó más a fondo con los plugins "MultiKymograph" y "Macros" ImageJ, que se muestran en la Figura 1.

Hay tres estados respectivos de movimiento mitocondrial, incluyendo movimiento estático, anterogrado y retrógrado(Figura 1B,C). Un solo mitocondrion puede permanecer estático o moverse en dirección anterograda o retrógrada dentro de un axón, y aquí, se dibujó una línea segmentada a lo largo de la pista del movimiento mitocondrial para determinar la velocidad(Figura 1D). La velocidad del movimiento mitocondrial a lo largo del axón se muestra en la Figura 1E y corresponde a las líneas segmentadas en la Figura 1D después de leer por "Macros" en ImageJ. Al igual que el software MetaMorph, ImageJ se puede utilizar para determinar la velocidad mitocondrial y el porcentaje de mitocondrias motiles basados en el kymograph generado por ImageJ (Figura 1F). Utilizando software de análisis disponible comercialmente (por ejemplo, MetaMorph), datos anteriores mostraron que el porcentaje de mitocondrias móviles se redujo significativamente en las neuronas SPG3A en comparación con las neuronas normales, mientras que la velocidad no se alteró19. Para evaluar el software ImageJ, se examinó el porcentaje de mitocondrias móviles, y se observó una reducción similar en el porcentaje de mitocondrias móviles en las neuronas SPG3A en comparación con las neuronas de tipo silvestre (WT) de control (Figura 1G).

En cuanto al análisis de la morfología mitocondrial, el área mitocondrial, la longitud y la AR se analizaron utilizando la función "analizar partículas" en ImageJ. Los axons se enderezaron usando el plugin "straighten"(Figura 2A,B). Las mitocondrias se eligieron claramente ajustando el umbral(Figura 2C,D). Por último, el área mitocondrial, la longitud (mayor), la anchura (menor), la relación de aspecto y el perímetro se obtuvieron del axón enderezado utilizando el plugin "Analizar partículas"(Figura 2E,F). La morfología mitocondrial anormal se observó (y se ha observado previamente) en las neuronas glutamatérgicas telencéfalas derivadas de HSP iPSC, incluidas las células SPG15(Figura 2G,H,I)13,22. Tanto la longitud mitocondrial como la relación de aspecto se redujeron significativamente en los axónicos de las neuronas SPG15 en comparación con los axónicos de las neuronas WT de control(Figura 2G,H,I).

Figura 1: Análisis del transporte mitocondrial utilizando ImageJ. (A) Inmunostación que muestra la generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas. Tbr1 (rojo), tubulina III (verde) y Hoechst (azul). Barras de escala a 50 m. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior19. (B) Transporte mitocondrial dentro de axónes de neuronas. El movimiento mitocondrial anterogrado se define como las mitocondrias que se mueven desde el cuerpo celular al axón distal, y el movimiento mitocondrial retrógrado se origina en el axón distal y se extiende al cuerpo de la célula neuronal. La línea de segmento se dibuja a lo largo de los axones desde el cuerpo de las células neuronales hasta el terminal axonal distal para generar kymographs. (C) Kymograph se genera utilizando ImageJ; el eje x es la posición axonal y el eje Y es el tiempo. Una línea blanca continua es el mitocondrión que se mueve en dirección anterograda (cabeza de flecha rosa), dirección retrógrada (cabeza de flecha azul) o estado estático (cabeza de flecha amarilla amarilla). (D) La línea segmentada se dibuja para leer la velocidad utilizando el plugin Macros. Los números 1–8 describen el segmento de la línea. El movimiento anterogrado (1–4, 6, 8) y el estado estático (5, 7) se pueden distinguir de este kymograph magnificado. (E) Tiempo y distancia móvil para cada segmento, velocidad real y media (en píxeles). (F) Kymograph del transporte mitocondrial para P corticales WT y SPG3A utilizando ImageJ. Barra de escala a 10 m. (G) Relación mitocondrial móvil en PN corticales WT y SPG3A utilizando ImageJ (*p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de la morfología mitocondrial utilizando ImageJ. (A) Parámetros para enderezar el axón. (B) El representante enderezó el axón. (C,D) Ajuste del umbral para elegir las mitocondrias. (E,F) El área mitocondrial medida, el perímetro, la longitud (mayor), la anchura (menor) y la relación de aspecto (AR) correspondientes a las mitocondrias seleccionadas en (E). (G) Imágenes representativas de las mitocondrias en las neuronas glutamatérgicas telencéfalas WT y SPG15. Barras de escala a 20 m. (H) Longitud mitocondrial en las neuronas WT y SPG15. (I) Relación de aspecto de las mitocondrias en las neuronas WT y SPG15. **p < 0.01 vs. WT. (G), (H) y (I) se modifican de un estudio anterior13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ventajas y desventajas de algunas herramientas fluorescentes para el etiquetado mitocondrial.

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.