Obtención de datos de transcriptoma de alta calidad de Cereal Seeds mediante un método modificado para la generación de perfiles de expresión génica

Resumen

Se presenta un método para la elaboración de perfiles de transcriptoma de cereales. El perfilado de expresión génica basado en microarray comienza con el aislamiento del ARN total de alta calidad de los granos de cereales y continúa con la generación de ADNc. Después del etiquetado del ARNR y la hibridación de microarrays, se ofrecen recomendaciones para la detección de señales y el control de calidad.

Resumen

La caracterización de la expresión génica depende de la calidad del ARN. En la germinación, el desarrollo y las semillas de cereales maduras, la extracción de ARN de alta calidad a menudo se ve obstaculizada por el alto contenido de almidón y azúcar. Estos compuestos pueden reducir tanto el rendimiento como la calidad del ARN total extraído. El deterioro de la cantidad y la calidad del ARN total puede tener posteriormente un impacto significativo en los análisis transcriptomáticos descendentes, que pueden no reflejar con precisión la variación espacial y/o temporal en el perfil de expresión génica de las muestras que se están probando. En este protocolo, describimos un método optimizado para la extracción de ARN total con cantidad y calidad suficientes para ser utilizado para el análisis de transcriptoma completo de granos de cereales. El método descrito es adecuado para varias aplicaciones posteriores utilizadas para la elaboración de perfiles transcriptomicos de semillas de cereales maduras, de germino y de desarrollo. Se muestra el método de generación de perfiles de transcriptoma mediante una plataforma de microarray. Este método está diseñado específicamente para el perfilado de expresión génica de cereales con secuencias de genomas descritas. Se describe el procedimiento detallado desde el manejo de microarrays hasta el control de calidad final. Esto incluye la síntesis de ADNc, el etiquetado de cRNA, la hibridación de microarrays, el escaneo de diapositivas, la extracción de características y la validación de la calidad de los datos. Los datos generados por este método se pueden utilizar para caracterizar el transcriptoma de cereales durante la germinación, en diversas etapas de desarrollo del grano, o en diferentes condiciones de estrés biótico o abiótico. Los resultados presentados aquí ejemplifican los datos de transcriptoma de alta calidad susceptibles de análisis bioinformáticos posteriores, como la determinación de genes expresados diferencialmente (DEG), la caracterización de redes reguladoras de genes y la realización de estudios de asociación de todo el transcriptoma (TWAS).

Introducción

El transcriptoma representa el conjunto completo de transcripciones de ácido ribonucleico (ARN) expresadas por el genoma de un organismo en un momento dado y en particular condiciones ambientales y de crecimiento. Cada célula tiene su transcriptoma individual, que refleja su estado fisiológico y metabólico actual. Una colección de células derivadas de un tejido u órgano similar se utiliza en un estudio de transcriptoma típico, pero la transcriptomica de una sola célula y resuelta espacialmente se está populariendo¹. Los análisis transcriptomicos comienzan con la extracción del ARN total de un tejido seleccionado en un momento determinado y en condiciones de crecimiento definidas. Para ello, recomendamos el uso de un método recién desarrollado para la extracción de ARN total a partir de muestras ricas en contenido de almidón o azúcar, como las semillas de cereales². La comparación de transcriptomas entre diferentes muestras da como resultado la identificación de moléculas de ARN con abundancia diferente. Estas moléculas de ARN se consideran genes expresados diferencialmente (DEG). La abundancia de transcripciones derivadas de genes marcadores específicos se puede utilizar para estimar el estado del desarrollo o determinar la respuesta de un organismo a las fluctuaciones ambientales. Los genes sin cambios detectables en su abundancia de transcripción en los puntos de tiempo de desarrollo que se están estudiando se utilizan a menudo como genes de referencia o de limpieza.

El ARN se detecta y cuantifica típicamente mediante varios métodos, como la hincha del norte y la reacción cuantitativa en cadena de la transcriptasa polimerasa (qRT-PCR), pero los métodos actuales de transcriptomica de alto rendimiento dependen en gran medida de la hibridación de ácido nucleico utilizando tecnología de microarray, así como de la secuenciación de ARN (RNA-Seq). ARN-Seq es muy popular en la actualidad porque proporciona varias ventajas para aplicaciones transcriptomicas de alto rendimiento como se revisa en otros lugares^3,4. Aunque es una tecnología más antigua, el perfil a la expresión génica utilizando chips de microarray sigue siendo ampliamente utilizado porque es una tecnología más establecida, que requiere menos experiencia en bioinformática. En comparación con RNA-Seq, los conjuntos de datos generados a partir de experimentos de microarray son más pequeños y fáciles de analizar. Además, es más rentable, especialmente si se trata de grandes números de muestra. En nuestro laboratorio, utilizamos habitualmente análisis transcriptomicos utilizando la tecnología de microarray para determinar el papel de los centros reguladores centrales que rigen las redes moleculares y las vías implicadas en el crecimiento, desarrollo y metabolismo de los cereales^{5,,6,,7,,8,,9}. También lo utilizamos habitualmente para llevar a cabo estudios de perfilación de expresión génica en todo el genoma para obtener una comprensión mecanicista de la respuesta de los cereales a las tensiones abióticas¹⁰, así como en la realización de la asociación de transcriptoma de ancho (TWAS) y estudios de mapeo de vinculación para identificar genes responsables de la calidad del grano de cereales y la nutrición^11,12. Otros grupos también han utilizado la tecnología de microarray para proporcionar atlas de expresión génica específicos para el desarrollo en cebada^13,arroz^14,,15,,16,sorgo¹⁷y trigo^18.

El propósito de esta publicación es proporcionar un breve resumen textual y una descripción visual detallada del método que actualmente empleamos en nuestro laboratorio para el perfilado transcriptomico de granos de cereales utilizando una plataforma de microarray Agilent. Tenga en cuenta que otras plataformas de microarray están disponibles, pero no se cubrirán en este método. Comenzamos el protocolo presentando una descripción detallada de la extracción de ARN del desarrollo o germinación de semillas de cereales. Basándonos en nuestra experiencia, obtener un transcriptoma de alta calidad y alta cantidad susceptible de análisis transcriptómicos aguas abajo es a menudo el cuello de botella cuando se utilizan tejidos de semillas de cereales. Hemos probado varios kits de extracción de ARN disponibles comercialmente, pero ninguno ha proporcionado resultados satisfactorios. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo de extracción química para obtener un extracto de ARN crudo que luego se somete a purificación de columnas utilizando un kit disponible comercialmente. Usando este método, obtenemos de forma rutinaria y reproducible ARN de alta calidad² (Figura 1), que se puede utilizar para diferentes aplicaciones posteriores para generar un perfil de transcriptoma.

Protocolo

1. Extracción y purificación total de ARN

NOTA: Trabaje siempre bajo la campana de humos, ya que este método implica el uso de disolventes orgánicos volátiles dañinos. Precalentar previamente un tubo de microhumo de agua libre de nucleasas en un bloque de calor de 50 oC antes de comenzar el experimento. Esta agua libre de nucleasas se utilizará para eluir el ARN total de la columna de espín en el paso 1.8.

1. Moler por separado las muestras, cada una con al menos tres réplicas biológicas, en un polvo fino utilizando un mortero esterilizado y un pestillo que se enfrían previamente en nitrógeno líquido.
   1. Recoja las muestras en polvo utilizando una pequeña espátula metálica sumergida en nitrógeno líquido y coloque las muestras en polvo en tubos de microfusión libres de nucleasas de 2,0 ml, también presumergidas en nitrógeno líquido. Almacene inmediatamente las muestras en un congelador de temperatura ultrabaja (-80 oC) hasta el día asignado para la extracción de ARN por lotes (STOP POINT).
      NOTA: Las muestras de semillas se pueden moler en polvo fino con o sin deshusación. Para el arroz, rutinariamente trituramos las muestras sin desinsocrecar porque la cáscara contiene sílice que puede ayudar durante el proceso de molienda.
      ADVERTENCIA: Este paso debe realizarse rápido y en condiciones estrictamente criogénicas. Una opción para la automatización es moler las muestras utilizando un molino de bolas criogénico para minimizar la degradación del ARN y el deterioro de la calidad.
2. Obtener un extracto de ARN crudo utilizando aproximadamente 200 mg de la muestra original en polvo. Agregue individualmente cada muestra a un tubo de microfúgeo libre de nucleasas que contenga 750 ml de búfer de extracción de ARN (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM de LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoetanol) y 500 ol de fenol:cloroformo:isoamyl (25:24:1).
   1. Mezcle todas las muestras al mismo tiempo durante 5 minutos a temperatura ambiente utilizando un mezclador de vórtice multitubo a alta velocidad. Mantenga inmediatamente todos los tubos en hielo durante dos minutos.
      ADVERTENCIA: Trabaje siempre dentro de la campana de humos, especialmente para todos los pasos que involucran fenol, cloroformo y otros disolventes orgánicos. Idealmente, utilice una capucha de humo ancha que puede acomodar una centrífuga de sobremesa, mezclador de vórtice, mezclador de vórtice multitubo y mezclador rotativo multitubo.
3. Separe el extracto de ARN crudo de los escombros por centrifugación a 14.000 x g durante 10 min. Realice todos los pasos de centrifugación en la misma configuración de esta sección.
   1. Transfiera aproximadamente 800 ml de sobrenadante a un nuevo tubo de microfófugo de 2,0 ml que contenga 400 ml de NaCl de 1,2 M y 700 ml de isopropanol. Mezclar la solución suavemente por inversión 5x.
   2. Precipitar el ARN incubando en un congelador regular (-20 oC) o a temperatura ultrabaja (-80 oC), durante al menos 1 h (o durante la noche).
      Punto STOP o PAUSE: basta con mantener las muestras en el congelador regular de -20 oC para que se detengan durante unas horas. Para un punto de parada durante la noche o más largo, guarde las muestras en un congelador de temperatura ultrabaja (-80 oC).
4. Obtener un pellet de ARN crudo por centrifugación a 18.800 x g durante 15 min. Después de desechar el sobrenadante, purificar el pellet de ARN crudo mediante la purificación de columnas utilizando un Mini Kit(Tabla de Materiales).
   1. Disolver el gránulo en un tampón de 450 ml de RLT recién preparado (antes de su uso, añadir 100 ml de mercaptoetanol por 100 ml de tampón RLT, preparado fresco diariamente). Mejore la disolución de todos los pellets mezclando todos los tubos a temperatura ambiente en un mezclador de vórtice multitubo durante al menos 5 minutos.
5. Purificar el pellet de ARN disuelto pasando a través de la mini columna de giro púrpura con un tubo de recolección de 2 ml. Centrifugar a temperatura ambiente durante 1 min a 9.000 x g y desechar la mini columna de giro púrpura.
   1. Añadir 0,5 volúmenes de etanol absoluto (225 l) al lisado despejado en el tubo de recogida de 2 ml. Mezcle la solución con la misma punta de plástico pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces.
6. Recoja el ARN purificado transfiriendo inmediatamente la solución a una mini columna de giro rosa con un tubo de recogida de 2 ml. Centrífuga a 9.000 x g durante 15 s para recoger el ARN en la membrana de sílice de la columna de centrifugado min rosa. Deseche el flujo y lave el ARN con 350 ml de Tampón RW1 por centrifugación a 9.000 x g durante 15 s.
7. Elimine el ADN genómico contaminante añadiendo 80 ml de DNase 1 diluido (50 l de caldo dNase congelado + 350 ml de RDD utilizando el conjunto DNase) directamente sobre la membrana y digerir incubando a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos (PUNTO DE PAUSA).
   1. Lavar el DNase 1 añadiendo 350 s de RW1 y girando hacia abajo a 9.000 x g durante 15 s. Repita dos veces, pero esta vez lávese con 500 s de RPE de tampón. Pasar a un nuevo tubo de recogida de 2 ml y girar a 9.000 x g durante 2 min para secar.
8. Transfiera la columna de espín seco a un nuevo tubo de recogida sin nucleasas de 1,5 ml. Comenzar el proceso de elución para el extracto de ARN purificado añadiendo 50 l de agua libre de nucleasas (precalentado a 50 oC) e incubando durante 3 minutos a 50 oC de bloque de calor.
   1. Después de la incubación, eluya el extracto total de ARN centrifugando a 9.000 x g durante 1 min. Coloque inmediatamente todas las muestras en hielo.
9. Determinar la cantidad y calidad del extracto total de ARN ejecutando diluciones apropiadas (generalmente 1:10) en Nanodrop y BioAnalyzer utilizando sus respectivos protocolos del fabricante. Los extractos de ARN deben tener al menos un valor de RIN de 8,0 y una concentración de 50 ng/L. La Figura 1 muestra un resultado típico para los extractos de ARN obtenidos a partir de hojas de cebada y semillas.
   PUNTO DE PARADA: Almacene las muestras en -80 oC hasta su uso.

2. Síntesis de ADNc seguida de transcripción y etiquetado de cRNA

NOTA: Este paso es adecuado para procesar 24 muestras simultáneamente. Se sugiere que todo el paso se lleva a cabo continuamente en un día, pero se identifican los puntos de parada y pausa opcionales. Asegúrese de precalentar tres bloques de calor del tubo de microfusión a 80 oC, 65 oC y 37 oC antes de iniciar los pasos que se indican a continuación. Estos ajustes de temperatura se cambiarán como se indica en los pasos a continuación. Por ejemplo, el bloque de calor de 37 oC se ajustará a 40 oC después de preparar la mezcla de pinchos (o si ya se ha preparado previamente). Prepare la mezcla maestra de Spike Mix, T7 Promoter Mix y cDNA de un color utilizando el kit de etiquetado de expresión génica de amplificador rápido de entrada baja (consulte Tabla de materiales)según las instrucciones del fabricante. Esta preparación depende de la cantidad de extractos de ARN iniciales, que generalmente oscilan entre 10 y 200 ng para el ARN total o 5 ng para el ARN PolyA. Utilizamos rutinariamente ARN total de 50 ng como material de partida para la hibridación de^{microarrays 2} y para el método que se describirá a continuación. Al preparar una mezcla maestra para 24 muestras, agregue 2 reacciones adicionales para tener en cuenta las variaciones de pipeteo. Utilice siempre tubos de microfúcya sin nucleasas y agua sin nucleasas en este paso.

1. Debido al alto rendimiento, por lo general diluir el extracto de ARN 100 veces para caber dentro del rango de 50-100 ng. Sobre la base de los resultados de la cuantificación del ARN en el paso 1.9, haga una dilución de 1:100 añadiendo 1 l de extracto de ARN purificado a 99 l de agua libre de nucleasas en un tubo de microfusión de 1,5 ml. Determinar la concentración real de esta dilución utilizando una Nanodrop.
   1. Hacer una segunda dilución de cada muestra total de ARN en un tubo de microfúgeo de 1,5 ml para hacer 50 ng de ARN total en un volumen final de 1,5 l. Mantener todas las muestras en hielo.
2. Prepare el Spike Mix según las instrucciones del fabricante. Este paso también se resume en el artículo 2019². Utilice un bloque de calor de 37 oC para ello. Almacene la primera y la segunda dilución de los controles positivos de mezcla de púas de un solo color en un congelador de temperatura ultrabajo (-80 oC) y pase por ocho ciclos repetidos de congelación/descongelación.
   1. Preparar la tercera y cuarta dilución fresca diariamente. Descongelar y almacenar la tercera y cuarta dilución de la mezcla de púas en hielo antes de su uso.
      NOTA: Convierta la temperatura del bloque de calor de 37oC a 40 oC cuando se haya preparado la mezcla de pinchos (o si se preparó previamente).
3. Prepare el T7 Promoter Mix y guárdelo en hielo antes de usarlo. Lo siguiente es suficiente para 24 muestras:
   20,8 l de imprimación promotora T7
   + 26,0 l de agua libre de nucleasas
   46,8 l del volumen total T7 Promoter Mix
4. Añadir 1,8 l de T7 Promoter Primer Mix (Paso 2.3) a cada tubo de microfúctil que contenga 1,5 ml de muestra de ARN de 50 ng del paso 2.1. Mezcle los componentes correctamente pipeteando varias veces. Desnaturalice la mezcla de plantilla-imprimación de ARN incubando en bloque de calor de 65 oC durante 10 minutos. Coloque inmediatamente los tubos de microfusión en hielo en preparación para el siguiente paso.
5. Mientras desnaturalizó la mezcla de plantilla-imprimación (Paso 2.4), precaliente el búfer de la primera hebra 5x a 80 oC Table of Materialsdurante al menos 4 minutos. Lo siguiente es suficiente para 24 reacciones:
   52,0 l de búfer precalentado de 5x primera hebra (paso 2.5)
   + 26,0 l de TDT de 0,1 M
   + 13,0 l de mezcla dNTP de 10 mM
   + 31,2 l de rnase Block Mix
   • 122,2 l de síntesis de ADNc de volumen total Master Mix
   1. Descongela cada componente sobre hielo. Mezcle cada componente mediante un pipeteo suave. Mantenga la mezcla maestra a temperatura ambiente antes de su uso.
      ADVERTENCIA: La mezcla de bloques RNase debe volver a colocarse inmediatamente en el congelador de -20 oC después de su uso.
6. Retire la mezcla de plantilla-imprimación de ARN en hielo (Paso 2.4) y centrifugar brevemente a temperatura ambiente para girar todo el contenido hasta la parte inferior del tubo de microfusión. Dispensar 4,7 l de la mezcla maestra del ADNc (paso 2.5) en cada tubo, mezclando cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. El volumen total cuando se añaden todos los componentes debe ser de 8,0 l.
   1. Sintetizar el ADNc para 2 h en bloque de calor de 40oC. Durante la incubación de 2 h, cambie la temperatura del bloque de calor de 65oC a 70oC en preparación para la inactivación del calor (Paso 2.7).
      PUNTO DE PAUSA OPCIONAL: Almacene las muestras a -80 oC durante la noche. El experimento puede continuar al día siguiente después de la inactivación del calor (Paso 2.7).
7. Incubar cada tubo en un bloque de calor de 70oC durante 15 minutos para desactivar el calor de la mezcla de bloques RNase. Transfiera los tubos en hielo inmediatamente e incubar durante al menos 5 minutos.
8. Mientras las muestras están en hielo durante 5 min (Paso 2.7), prepare rápidamente la mezcla maestra de transcripción. Todos los componentes se pueden combinar a temperatura ambiente, pero descongelar los componentes sobre hielo. Lo siguiente es suficiente para 24 muestras:
   19,5 l de agua libre de nucleasas
   + 83,2 l de búfer de transcripción 5x
   + 15,6 l de TDT de 0,1 M
   + 26,0 l de mezcla NTP
   + 5,5 l de mezcla de polimerasa de ARN T7
   + 6,2 l de cianina 3-CTP (Cy3)
   • 156,0 l de volumen total Transcripción Master Mix
   ADVERTENCIA: La mezcla de polimerasa de ARN T7 debe mantenerse en el congelador de -20 oC y volver a colocarse inmediatamente después de su uso. Además, Cy3 es sensible a la luz. Por lo tanto, la mezcla (Paso 2.9) y la dosificación (Paso 2.10) deben realizarse en condiciones de poca luz. Para ello, normalmente apagamos cualquier luz directamente encima del banco de laboratorio.
9. A medida que los tubos fueron sometidos a un calentamiento y enfriamiento abrupto (Paso 2.7), gire brevemente el contenido de cada muestra utilizando una microcentrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior de cada tubo de microfusión. Añadir 6 l de mezcla maestra de transcripción (paso 2.8) pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. El volumen total de esta reacción debe ser de 16 ml en esta etapa. Incubar los tubos a 40oC durante 2 h para generar el CRNA con la etiqueta Cy3.
   PUNTO OPCIONAL DE PARADA: Los tubos se pueden almacenar a -80 oC después de la transcripción.
10. Mientras se genera el cRNA (Paso 2.9), ajuste la temperatura del bloque de calor a 55 oC. Agregue al menos un tubo de microfusión de agua libre de nucleasas en el bloque de calor. Esta agua libre de nucleasas se utilizará para la elución de cRNA purificado.
11. Después de la transcripción y etiquetado del ARNC, purifique el ARNm etiquetado usando un Mini Kit RNeasy como se detalla en el Paso 3.

3. Purificación del ARNC

1. Purificar el cRNA etiquetado usando un Mini Kit RNeasy (ver Tabla de Materiales). Prepare los búferes según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, Buffer RPE se suministra en el kit en forma concentrada. Antes de su uso, añadir 4 volúmenes de etanol absoluto grado de biología molecular (96-100%).
2. Añadir 84 l de agua libre de nucleasas a cada muestra para ajustar el volumen total a 100 sL. A continuación, añadir 350 s de Tampón RLT y 250 l de etanol absoluto a cada tubo. Mezcle bien pipeteando.
3. Transfiera 700 ml de cada mezcla a una mini columna de centrifugado con un tubo de recogida de 2 ml. Recoger el ARNm etiquetado sobre la membrana por centrifugación a 4oC durante 30 s a 7.534 x g. Deseche el líquido de flujo.
4. Lave cada muestra en 500 ml de RpE de búfer. Centrifugar y descartar el flujo como en el paso anterior. Repita este paso una vez y, a continuación, pase al paso siguiente.
5. Transfiera la mini columna de giro a un nuevo tubo de recogida. Seque las muestras por centrifugación como en el paso 3.3.
6. Transfiera la mini columna de centrifugado a un tubo de microfófugo de 1,5 ml sin nucleasa que se suministra con el kit. Eluda cada muestra de CRNA etiquetada añadiendo 30 l de agua libre de nucleasas (precalentada a 55 oC) directamente en el filtro de membrana. Mejore la elución incubando en un bloque de calor de 55 oC durante 60 s.
7. Recoger el CRNA etiquetado por centrifugación a temperatura ambiente durante 30 s a 7.535 x g. Deseche la columna de giro y cierre cada tubo de microfusión. Coloque inmediatamente cada tubo en hielo.
   PUNTO DE PARADA OPCIONAL: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC después de la elución.
8. Cuantifique el cRNA con Nanodrop utilizando la función de microarray. Establezca la muestra en RNA-40. Obtener los siguientes valores y registro en una hoja de cálculo: concentración de cianina 3 colorante (pmol/L), relación de absorncia de ARN (260 nm/280 nm) y concentración de cRNA (ng/L).
   PUNTO DE PARADA: Almacene inmediatamente las muestras de ARNm a -80 oC después de la lectura.
9. Calcular el rendimiento del ARC y la actividad específica tal y como se detalla en el p.ffeld et al. 2019².

4. Hibridación y escaneo de microarrays

NOTA: Este paso solo toma 3-4 h y por lo tanto la hibridación de 24 muestras se puede iniciar después del almuerzo. Un operador puede ejecutar cómodamente hasta 4 diapositivas (32 muestras). La mañana del día siguiente se asigna para el lavado y escaneo de diapositivas de microarray. Las carreras adicionales se pueden realizar en la tarde del segundo día. Este paso se repite hasta que todas las muestras se hibridan y se escanean. Es muy recomendable utilizar guantes de látex sin color y sin polvo para manipular y procesar las diapositivas para garantizar que las muestras no estén contaminadas con pigmentos de colores que puedan interferir con los análisis de microarrays. Aparte de los microarrays disponibles comercialmente, los siguientes arreglos personalizados son diseñados por nuestro grupo y disponibles para pedido de Agilent: Código de pedido 028827 para Cebada(Hordeumvulgare), 054269 para Arroz (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 para Arroz (Oryzasativa subs Indica ) y 048923 para Trigo (Triticumaestiv ).

1. Realice la hibridación de microarrays utilizando el Kit de hibridación de expresiones génicas (consulte Tabla de materiales). Prepare el agente de bloqueo 10x de acuerdo con la especificación²del fabricante. Alícuota el agente bloqueador de 10x en porciones de 200 l y guárdelo a -20 oC hasta su uso. Cada alícuota es suficiente para hasta 40 hibridaciones y es estable hasta 2 meses.
2. El día asignado para la hibridación de microarrays, descontece una alícuota de 200 l de 10x Agente bloqueador en hielo. Además, precalentar el horno de hibridación a 65oC y precalentar un bloque de calor a 60oC para su uso durante la fragmentación del ARC.
3. Prepare la mezcla de fragmentación para cada muestra según lo descrito por el fabricante². En nuestro laboratorio, utilizamos rutinariamente 600 ng de cRNA con etiqueta Cy3 linealmente amplificada para la hibridación en un microarray de 8 paquetes. En este caso, la lista siguiente resume los componentes de la mezcla de fragmentación por muestra:
   600 ng de ARNm amplificado linealmente, cianina 3-etiquetada
   + 5 l de 10x agente de bloqueo
   Ajustar el volumen a 24 s con agua libre de nucleasas
   + 1 l de búfer de fragmentación de 25x
   • 25 l de volumen total Delación de Fragmentación
   1. Mezcle las muestras suavemente con un mezclador de vórtice. Gire todas las muestras brevemente usando una microcentrífuga.
4. Incubar todas las muestras en el bloque de calor de 60 oC durante exactamente 30 minutos.
5. Para detener completamente la reacción de fragmentación, agregue 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM a cada tubo. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, teniendo mucho cuidado de no introducir ninguna burbuja durante la mezcla. Usamos rutinariamente 25 l de búfer de hibridación para detener la reacción de fragmentación para el formato de microarray de 8 paquetes.
6. Centrifugar todos los tubos durante 1 min a 15.750 x g a temperatura ambiente. Coloque rápidamente todos los tubos en hielo y cargue cada muestra lo más rápido posible.
7. Antes de salir del laboratorio para la incubación de 17 h durante la noche, prepare el conjunto de hibridación² como se detalla en el video.
   1. PASO CRITICO: Transfiera cada mezcla de hibridación y dispensar lentamente en el centro de cada junta bien, observando un gran cuidado de no introducir ninguna burbuja durante la dosificación. Usamos rutinariamente 44 s de mezcla de hibridación para el formato de microarray de 8 paquetes. Coloque también 44 s l de 1x búfer de hibridación en cualquier pozo no utilizado.
   2. Coloque inmediatamente la corredera de microarray con la orientación correcta en la parte superior de la corredera de la junta. Esto debe hacerse con mucho cuidado para no derramar ningún líquido. Cierre el conjunto de hibridación firmemente y gírelo para comprobar si no se han introducido burbujas de aire permanentes. Todas las burbujas deben moverse dentro de la corredera de la junta.
8. Coloque el conjunto de la cámara de hibridación en el rotador del horno de hibridación. Si utiliza el búfer de hibridación gEx 2x, ajuste la velocidad de rotación a 10 rpm e hilasítela a 65 oC durante exactamente 17 h.
9. Lave los microarrays hibridados con el kit de búfer de lavado de expresión génica (consulte Tabla de materiales). Prepare los búferes de lavado de expresión génica 1 y 2 según las instrucciones del fabricante². Añadir 2 ml de 10% De Tritón X-102 a ambos buffers (puramente opcional pero altamente recomendado para reducir la incidencia de artefactos de lavado de microarray)².
10. Prepare tres conjuntos de cámaras de lavado como se detalló en la publicación anterior². Los detalles de cada cámara de lavado se tabulan a continuación (Tabla 1).
11. Aliquot 500 ml de Wash Buffer 1 en una botella de reactivo de 1 L y dejar a temperatura ambiente. Prepare una botella de reactivo adicional de 1 L y etiquete con "Wash Buffer 1 Reuse" para guardar el tampón de lavado de la primera cámara. Además, la alícuota 500 ml de Wash Buffer 2 en una botella de reactivo e incubar en un baño de agua de 37oC durante la noche.
    NOTA: No abandone el laboratorio sin preparar los pasos 4.9 a 4.11. Son necesarios para los pasos de lavado al día siguiente.
12. Al día siguiente, prepare los tampones de lavado como se detalla en la Tabla 2. Llene cada plato a tres cuartas partes de su búfer correspondiente. Cada tampón de lavado es bueno para hasta 4-5 diapositivas.
13. Después de exactamente 17 h de hibridación, obtenga una cámara de hibridación y desmonte en el banco de laboratorio forrado con papel libre de pelusas como se detalla en la publicación anterior².
    1. PASO CRITICO: Transfiera el sándwich de microarray al Plato 1. Asegúrese de que el código de barras del microarray esté mirando hacia arriba en una posición eslazada y evite sumergir toda la diapositiva en el búfer. Manipule cada diapositiva de microarray desde sus extremos y evite tocar el lado activo de la diapositiva.
    2. Separe los dos portaobjetos de vidrio con un fórceps². Deje que la junta se deslice suavemente en la parte inferior del plato 1, mientras que al mismo tiempo asegurarse de que la diapositiva de microarray se mantiene firmemente para el siguiente paso.
14. PASO CRITICO: Levante lentamente las correderas de microarray hacia los lados y transfiera inmediatamente al bastidor de microarray en Dish 2 como se detalla en la publicación anterior². Es fundamental que las correderas de microarray estén mínimamente expuestas al aire.
    1. Repita los pasos 4.13 y 4.14 hasta que las ocho diapositivas estén en el bastidor. Distribuya las diapositivas de microarray uniformemente a lo largo del bastidor. Este paso puede ser realizado por un operador sin asistencia para hasta 4 diapositivas. Fije el soporte del bastidor y transfiera toda la configuración del plato 2 al primer agitador magnético. Revuelva suavemente durante exactamente 1 min.
15. Mientras se agita durante 1 min (Paso 4.14), transfiera el plato 3 de la mini incubadora de 37 oC y colóquelo encima del segundo agitador magnético. Coloque suavemente Wash Buffer 2 (desde el baño de agua de 37oC) en el plato 3. Evite la formación de burbujas mientras vierte.
    1. Después de 1 min de agitación se realiza (Paso 4.14), levante suavemente y lentamente la rejilla deslizante del plato 2 y transfiera al plato 3. Retire el soporte del bastidor y revuelva durante exactamente 1 min.
16. Levante lentamente y suavemente la rejilla deslizante del plato 3. Asegúrese de evitar la formación de gotas tampón². Seque los lados de cada diapositiva tocando suavemente el papel sin pelusas. Coloque cada diapositiva seca en una caja deslizante y repita el paso 4.16 hasta que todas las diapositivas de microarray estén en la caja de diapositivas. Secar durante aproximadamente 15 min.
    PUNTO DE PARADA OPCIONAL
17. Coloque cada diapositiva de microarray en un portaobjetos, asegurándose de que el código de barras esté mirando hacia arriba.
    NOTA: Los niveles de ozono dentro de la sala de microarrays deben ser de 50 ppb (100 g/m³⁾o menos. Esto es puramente opcional, pero es muy recomendable: utilice una cubierta deslizante de barrera de ozono para evitar la degradación inducida por ozono de los colorantes cianinos.
18. Coloque los portaobjetos montados en el carrusel de escaneado. Cargue las muestras en secuencia, en función del número de código de barras. Escanee las diapositivas inmediatamente utilizando un escáner de microarray (véase Tabla de materiales), como se detalla en la publicación anterior².
19. Después de la ejecución, someta los datos a la extracción de características y validación de control de calidad, como se detalla en la publicación anterior².

Resultados

Este método está optimizado para extraer muestras de semillas de cereales que contienen cantidades significativas de almidón o azúcares contaminantes. Está diseñado para extraer el ARN total de 24 muestras de semillas por día. Debe llevarse a cabo continuamente en un día, pero los puntos de parada y pausa opcionales se identifican a lo largo del protocolo. Alternativamente, el lector puede utilizar sus kits de extracción de ARN preferidos o el método de extracción química manual. Sin embargo, en base a nuestra experiencia previa, los kits de extracción de ARN vegetal disponibles comercialmente no son adecuados para semillas debido a cantidades significativas de contaminación por almidón, proteínas, azúcar y/o lípidos. En el método descrito, una extracción química de ARN crudo es seguida por la purificación de columnas utilizando un kit de extracción de ARN comercial. Por lo general, esto proporciona ARN con mayor calidad y rendimiento. La Figura 1 muestra el resultado de una ejecución de BioAnalyzer para probar la calidad de la extracción de ARN utilizando el método descrito aquí. Se presentan resultados para hojas de cebada (muestras 1 y 2 que representan muestras de bajo contenido de almidón) y semillas de cebada (muestras 3 y 4 que representan muestras de alto contenido de almidón). El valor de integridad del ARN (RIN) para todas las muestras es 10.

La Figura 1 muestra un gel representativo del extracto de ARN purificado, donde la calidad se probó utilizando un bioanalizador. Las muestras 1 y 2 son resultados típicos de muestras de bajo contenido de almidón, como hojas de cebada, donde las bandas adicionales de ARNm de los cloroplastos son evidentes. Las muestras 3 y 4 son resultados representativos de muestras de alto contenido de almidón, como semillas de cebada, que muestran 18S y 28S rRNA. Tenga en cuenta que no se puede calcular ningún valor de RIN automatizado para los tejidos vegetales verdes, como las muestras de hojas, debido al rRNA de cloroplasto. Sin embargo, la integridad y la alta calidad se pueden determinar visualmente con la ausencia de cualquier producto de degradación, que normalmente aparece como un frotis molecular bajo. El valor De RIN para muestras de semillas de alto almidón, como las semillas de cebada, suele ser 10 utilizando el protocolo descrito en este artículo.

Además, también presentamos aquí un dato representativo de un experimento de curso de tiempo de dos líneas endogámicas de cebada de élite (Sofiara y Victoriana) utilizadas para el análisis de la calidad de malteado¹⁹. Durante el proceso de malteado, el almidón se convierte en azúcar. Por lo tanto, las muestras representan tejidos con diferentes proporciones de almidón y contenido de azúcar. Como el proceso de malteado industrial es similar al proceso de germinación, se analizaron los transcriptomas de dos líneas de cebada, diferenciándose en su calidad de malteado. Los ARN se extrajeron de las semillas germinantes a 2, 24, 48, 72, 120, 144 y 196 h después de la imbibición en triplicados biológicos. La preparación e hibridación del ARN al chip de microarray de cebada personalizado se realizaron como se describió anteriormente. La Figura 2 indica la cuadrícula normalizada leída de la hibridación de microarrays indicada en el informe de control de calidad (QC)(Figura 3)y la gráfica del histograma para las señales detectadas. La cuadrícula ofrece el ejemplo de señales derivadas de cada esquina del chip, incluidos los puntos de lectura de fondo y spike-in utilizados para la calibración. El histograma indica la desviación de los puntos detectables con las intensidades de señal respectivas. Una hibridación exitosa proporciona una amplia curva en forma de Gaussiana con solo valores atípicos menores como se muestra en la figura. Las hibridaciones fallidas pueden resultar en un fuerte cambio hacia un lado ("monstruos verdes").

Por último, en la columna 4 de la Figura 3se muestra un resultado representativo de los valores aceptables. Para indicar la fiabilidad de los experimentos realizados, los resultados se evalúan con el software GeneSpring. Los datos recopilados se presentan como análisis de componentes principales (PCA). El PCA integra los valores de los puntos seleccionados (genes) como vector. El número de puntos evaluados que se utilizan puede variar de varios cientos a todo el chip y depende del software utilizado. Cada chip (muestra) da como resultado un valor (vector) que resultó de las intensidades de señal integradas para los puntos analizados. Por lo tanto, la posición relativa en el gráfico (PCA) indica la similitud de las muestras entre sí. Cuanto más cerca están las muestras, más similares son. Las réplicas técnicas deben estar más juntas que las biológicas, y las réplicas biológicas de una muestra deben agruparse más juntas, que las muestras de diferentes puntos de tiempo, tejidos o condiciones.

Figura 1: Resumen de ejecución del archivo de electroforesis obtenido después de comprobar la calidad del ARN con Bioanalyzer. Las muestras 1 y 2 son tejido de hoja de cebada, según lo indicado, por bandas ribosomales adicionales de cloroplastos. Las muestras 3 y 4 son tejido de semilla de cebada con bandas de ARNm de 18S y 28S. Un factor RIN no siempre se calcula para tejidos verdes como la hoja, pero según el gel, la calidad del ARN es muy buena. El valor RIN para las muestras 3 y 4 es 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Informe de control de calidad de la hibridación exitosa de microarray de cebada. A + indica las señales detectadas en la red desde todas las esquinas del chip. El histograma muestra el número de señales categorizadas según la intensidad de la señal (fluorescencia) como laritmo después de la resta de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resumen del control de calidad (QC) después de la hibridación y el escaneo. Los valores de la diapositiva hibridada se indican en la columna 2 (valor) y el rango de valores aceptables se muestra en la columna 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensamblaje de la cámara de lavado	Contenido y etiqueta	Propósito
Plato 1	Vacío, déjalo en el banco de laboratorio hasta el día siguiente	Llene con Wash Buffer 1 al día siguiente, utilizado para desmontar las diapositivas de microarray
Plato 2	Agregue un portaobjetos de microarray y una pequeña barra de agitación magnética; etiqueta con "Wash Buffer 1", dejar en el banco de laboratorio hasta el día siguiente	Se utiliza para lavar los portaobjetos de microarray con Wash Buffer 1 al día siguiente
Plato 3	Agregue una pequeña barra de agitación magnética, etiquete con "Wash Buffer 2" y colóquela en una mini incubadora de 37oC.	Se utiliza para lavar los portaobjetos de microarray con Wash Buffer 2 al día siguiente dentro de la mini incubadora de 37oC

Tabla 1: Preparación de los conjuntos de la cámara de lavado.

Pasos	Plato	Búfer de lavado	Temperatura	Hora
Desmontaje	1	1	Ambiente	Lo más rápido posible
(Paso 4.13)
Primer lavado	2	1	Ambiente	1 min
(Paso 4.14)
Segundo lavado	3	2	37 oC	1 min
(Paso 4.15)

Tabla 2: Temperatura de incubación y tiempo para conjuntos de cámaras de lavado.

Discusión

El método descrito proporciona resultados altamente reproducibles para extractos de ARN de alto rendimiento y alta calidad(Figura 1). Basándonos en nuestra experiencia, recomendamos tres réplicas biológicas para un genotipo, etapa o condición para el análisis. Para poder detectar diferencias estadísticamente significativas, se debe considerar la abundancia general de ARNm. Tenga en cuenta, sin embargo, que se requiere una cantidad inicial de 200 mg de muestras de tejido en los triplicados para el paso de extracción de ARN. Por lo tanto, para los experimentos que tienen una cantidad limitada de muestras, como materiales vegetales modificados genéticamente, este método puede no ser apropiado.

Durante la hibridación de microarrays, los siguientes pasos son los más críticos: (1) cargar las muestras en la corredera de junta (Paso 4.7) y (2) lavar las matrices después de la hibridación (pasos 4.13 y 4.14). La carga de la muestra debe hacerse con mucho cuidado para evitar la formación de burbujas y el derrame de líquidos. Es necesario tener precaución al colocar la corredera de microarray en la corredera de la junta que contiene las muestras cargadas: el lado del ADN (con sondas manchadas) debe estar mirando hacia abajo para permitir la hibridación. Para el lavado de los microarrays, el segundo paso de lavado es especialmente crítico: aquí, la eliminación de los portaobjetos del tampón de lavado 2 debe realizarse muy lentamente (10 s) para evitar artefactos tampón en las diapositivas, lo que puede interferir con la adquisición y análisis de datos.

Para recibir los resultados del experimento de hibridación que son elegibles para el análisis bioinformático descendente, uno debe seguir algunos criterios importantes. El informe de control de calidad, que se genera después del rendimiento del protocolo anterior, da una buena idea de lo que se debe mejorar y qué datos están en una condición utilizable(Figura 3). La primera información recibida es la cuadrícula visualizada(Figura 2). Aquí, se puede ver directamente si todas las áreas para la lectura de la fluorescencia están correctamente alineadas. Si hay un cambio visualmente detectable, esto influirá en todos los demás valores (fondo, intensidad de la señal, etc.) y no se puede utilizar la lectura de este chip. En el resumen (Distribución espacial de todos los valores atípicos), se puede detectar fácilmente cualquier contaminación (por ejemplo, polvo o cabello), lo que afectó el resultado. La suciedad se puede eliminar soplando suavemente y escaneando el chip. El histograma de la gráfica de señal como se mencionó anteriormente debe dar lugar a una amplia curva en forma de Gauss, con sólo valores atípicos menores (Figura 2). Dependiendo del tejido analizado(Figura 1),esta curva puede verse diferente y puede parecer que tiene dos picos, o un pico predominante con un hombro. Esto no influirá en la calidad de los datos. Sólo un pico fuerte desplazado, o señales altas en los bordes indican problemas, tales como "monstruos verdes" (intensidades de fluorescencia demasiado altas), que no se pueden eliminar mediante el lavado y deben ser reportados al fabricante de chips. Además, el "gráfico de distribución espacial para señales medianas" debe variar alrededor de un valor común. Esto debe estar en el rango entre 40 y 100, dependiendo de la lectura de intensidad general del chip analizado. Otro control de calidad importante es la evaluación del pico de datos: El gráfico de registro para el pico de señales debe dar lugar a una línea lineal y regular. Por último, la tabla de "métricas de evaluación" ofrece una buena y fiable visión de los resultados recibidos. Aquí el fabricante proporciona una gama de valores que se pueden clasificar como Excelentes, Buenos y Evaluar(Figura 3). Según nuestra experiencia, algunos de los valores no siempre se pueden aplicar para todas las fichas. En el caso de las virutas personalizadas de arroz, el "valor no control" estaba frecuentemente fuera del rango, pero no afecta significativamente al procesamiento de datos adicional. Además, el rango de "NegControl" podría extenderse, basado en tejido, organismo y salida general del chip a <80. El rango de evaluación para el cv de e1 med valor podría ampliarse a <9, en lugar de <8 según nuestra experiencia. Después de esto, es posible una evaluación adecuada de todos los datos de lectura de chip. En general, uno siempre debe tener en cuenta que las réplicas biológicas independientes siempre dan el resultado más confiable.

La ventaja de esta técnica en comparación con otros métodos radica en el hecho de que representa un método rentable y de alto rendimiento para la generación de perfiles transcripcionales. Además, la canalización de análisis de datos posterior es más fácil y más establecida. A pesar de las ventajas, hay ciertas limitaciones de esta técnica, como el número de genes que se pueden analizar. El microarray sólo puede facilitar el análisis de genes previamente detectados sondas en la matriz. Por lo tanto, esta técnica sólo es aplicable a especies vegetales con genomas secuenciados y genes completamente anotados. Prevemos que la transcriptomica basada en microarrays seguirá siendo muy útil y relevante no sólo para la elaboración de perfiles de expresión génica, sino también para otras canalizaciones bioinformáticas posteriores, como los análisis de redes reguladoras de genes y el estudio de asociación de todo el transcriptoma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ß-mercaptoetanol	Roth	4227.3	Agregue 300 ul a 20 mL de tampón de extracción de ARN inmediatamente antes de usar
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies		Para determinar la calidad y cantidad de extracto de ARN Máquina de
hielo picado Varias	marcas		Para mantener las muestras en hielo durante el procesamiento de muestras
Matraz Dewar	Varias marcas		Utilizado como contenedor de nitrógeno líquido
Etanol, absoluto	Roth	9065.1
Kit de hibridación de expresión génica	Agilent Technologies	5188-5242	Componentes del kit: 2X Tampón de hibridación de altas revoluciones Tampón de fragmentación 25X 10X Agente de bloqueo de la expresión génica
Kit de tampón de lavado de expresión génica	Agilent Technologies	5188-5325	Componentes del kit: Tampón de lavado de expresión génica 1 Tampón de lavado de expresión génica 2 Triton X-102
Bloque de calor	Varias marcas		Se recomienda tener al menos un bloque de calor para tubos de 1,5 ml y otro para tubos de 2,0 ml Horno de
hibridación	Agilent	G2545A	Horno de acero inoxidable diseñado para la hibridación de microarrays De Sheldon Manufacturing, utilizado para hibridar la muestra en microarrays durante la noche.
Kit de corredera de junta de hibridación	Agilent	G2534-60014
		aire iQAir	Para garantizar que el experimento se lleve a cabo en un área con bajo contenido de ozono
Isopropanol	Roth	9866.5
Papel sin pelusa, Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit	Agilent Technologies	5190-2305	Componentes del kit: T7 Primer 5x First Strand Buffer 0.1M DTT 10 mM dNTP Mix AffinityScript RNAse Block Mix 5x Transcription Buffer NTP Mix T7 RNA Polymerasa Blend Agua sin nucleasas Cyanine 3-CTP
Espátula metálica, pequeño			Asegúrese de que la pequeña espátula de metal pueda caber en los tubos de microfuga para garantizar una fácil recogida de las muestras.
Escáner de microarrays	Agilent Technologies		Se recomienda el escáner de microarrays Agilent SureScan o Agilent C
Tubos de microfuga, sin nucleasas	Varias marcas		Volumen de 2,0 mL y 1,5 mL
Microcentrífuga	Eppendorf	5810 R	Se recomienda tener al menos un microfófuga a temperatura ambiente y fría con rotores que puedan contener 24 tubos
de microfuga de 1,5 ml y 2,0 mlMini incubadora	Labnet	I5110-230V	Cualquier incubadora pequeña servirá.
Mortero y maja			Cualquier mortero pequeño de cerámica o mármol que pueda soportar la molienda criogénica con nitrógeno líquido.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Nanodrop 1000	Peqlab / Thermofisher
Agua libre de nucleasas	Biozym	351900302
Kit de espiga de ARN de un solo color	Agilent	5188-5282	Componentes del kit: Kit
	de cubierta deslizante de barrera de ozono de un solo color RNA Spike-Mix Agilent	G2505-60550 Tubo de	opcional pero muy recomendable
, 0,2 mL, libre de RNasa	Estratogene	Z376426
fenol:cloroformo:mezcla de isoamilo (25:24:1)	Roth	A156.2
Puntas de pipeta, sin nucleasa, puntas de filtro	Varias marcas		Para acomodar volúmenes de 2, 20, 20, 100, 200 y 1000 ul
Juego de pipetas	Varias marcas		Para volúmenes de 2, 20, 20, 100, 200 y 1000 ul
Tampón de extracción de ARN 10	mM Tri-HCl pH 8,0 150 mM LiCl 50 mM EDTA 1,5% EDTA 15 ul/mL β-mercaptoetanol		Utilizamos habitualmente productos químicos Roth o Sigma; Añadir β-mercaptoetanol fresco diario
Juego de DNasa libre de RNasa	Qiagen	79254
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Kit componentes: RNeasy mini columna de centrifugado (rosa) Tubos de recolección de 1,5 ml Tubos de recolección de 2 ml Tampón RLT Tampón RW Tampón RPE Agua sin nucleasas
Mini kit de planta RNeasy	Qiagen	74904	Componentes del kit: Mini columna de centrifugado RNeasy (rosa) QIAshredder columna de centrifugación (púrpura) Tubos de recolección de 1,5 ml Tubos de recolección de 2 ml Tampón RLT Tampón RLC Tampón RW1 Tampón RPE Agua sin nucleasas
Soportes para portaobjetos para escáner de microarrays de ADN	Agilent	G2505-60525
Plato de tinción deslizante con rejilla extraíble	DWK Life Sciences 900200	Fisher Scientific 08-812	Recomendamos DWK Life Sciences Wheaton™ Plato de tinción de vidrio de 20 portaobjetos con rejilla extraíble (completo con plato, cubierta y rejilla deslizante de vidrio)
Cloruro de sodio	Roth	P029.1
Congelador de temperatura ultrabaja	Varias marcas		Capaz de almacenar muestras a -80 & grados; C
Mezclador de vórtice	Varias marcas		Al menos uno para el mezclador de vórtice de un solo tubo y otro para que pueda mezclar en vórtice varios tubos