Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Erhålla högkvalitativa transkriptom data från spannmål frön av en modifierad metod för genuttryck profilering

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/60602
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

ERRATUM NOTICE

Summary

En metod för transkriptom profilering av spannmål presenteras. Den mikroarraybaserade genuttrycksprofileringen börjar med isolering av högkvalitativt totalt RNA från spannmål och fortsätter med genereringen av cDNA. Efter cRNA-märkning och mikroarrayhybridisering ges rekommendationer för signaldetektering och kvalitetskontroll.

Abstract

Karakteriseringen av genuttryck är beroende av RNA-kvalitet. Vid groning, utveckling och mogna spannmålsfrön hindras utvinning av högkvalitativt RNA ofta av hög stärkelse- och sockerhalt. Dessa föreningar kan minska både avkastningen och kvaliteten på den extraherade totala RNA. Försämringen av kvantiteten och kvaliteten på det totala RNA-systemet kan därefter ha en betydande inverkan på transkriptomanalyserna nedströms, vilket kanske inte korrekt återspeglar den rumsliga och/eller tidsmässiga variationen i genuttrycksprofilen för de prover som testas. I detta protokoll beskriver vi en optimerad metod för extraktion av totalt RNA med tillräcklig kvantitet och kvalitet som ska användas för hela transkriptomanalys av spannmål. Den beskrivna metoden är lämplig för flera nedströmsapplikationer som används för transkriptomprofilering av utvecklings-, gronings- och mogna spannmålsfrön. Metoden för transkriptom profilering med hjälp av en microarray plattform visas. Denna metod är speciellt utformad för genuttrycksprofilering av spannmål med beskrivna genomsekvenser. Det detaljerade förfarandet från microarray hantering till slutlig kvalitetskontroll beskrivs. Detta inkluderar cDNA-syntes, cRNA-märkning, mikroarrayhybridisering, glidskanning, funktionsextrahering och validering av datakvalitet. De data som genereras av denna metod kan användas för att karakterisera transkriptom av spannmål under grobarhet, i olika stadier av spannmålsutveckling, eller vid olika biotiska eller abiotiska stressförhållanden. De resultat som presenteras här exemplifierar högkvalitativa transkriptomdata som kan tillämpas för bioinformatikanalyser nedströms, såsom bestämning av differentiellt uttryckta gener (DEGs), karakterisering av genregleringsnätverk och genomförande av transkriptomomfattande associationsstudie (TWAS).

Introduction

Transkriptom representerar den fullständiga uppsättningen av avskrifter av ribonukleic acid (RNA) uttryckt av en organisms arvsmassa vid en viss tidpunkt och i synnerhet miljö- och tillväxtförhållanden. Varje cell har sin individuella transkriptom, vilket återspeglar dess nuvarande fysiologiska och metaboliska tillstånd. En samling celler som härrör från en liknande vävnad eller organ används i en typisk transkriptom studie, men encelliga och rumsligt löst transkriptomik blir populär1. Transkriptomiska analyser börjar med extraktion av det totala RNA från en vald vävnad vid en viss tidpunkt och under definierade tillväxtförhållanden. För detta ändamål rekommenderar vi användning av en nyutvecklad metod för utvinning av totalt RNA från prover med hög stärkelse- eller sockerhalt, såsom spannmålsfrön2. Jämförelsen av transkriptomer mellan olika prover resulterar i identifiering av RNA-molekyler med olika överflöd. Dessa RNA-molekyler anses vara differentiellt uttryckta gener (DEGs). Överflödet av transkriptioner som härrör från specifika markörgener kan sedan användas för att uppskatta utvecklingsstatus eller bestämma en organisms reaktion på miljöfluktuationer. Gener utan påvisbara förändringar i sin avskrift överflöd över utvecklingstidpunkter under studie används ofta som referens eller hushållning gener.

RNA är vanligtvis upptäcks och kvantifieras med olika metoder, såsom norra blotting och kvantitativa omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (qRT-PCR), men nuvarande hög genomströmning transkriptomik metoder är starkt beroende av nukleinsyra hybridisering med microarray teknik samt RNA sekvensering (RNA-Seq). RNA-Seq är mycket populär för närvarande eftersom det ger flera fördelar för hög genomströmning transkriptom applikationer som granskats någon annanstans3,4. Även om en äldre teknik, genuttryck profilering med microarray chips används fortfarande i stor utsträckning eftersom det är en mer etablerad teknik, som kräver mindre av en bakgrund i bioinformatik. Jämfört med RNA-Seq är de datamängder som genereras från mikroarrayexperiment mindre och lättare att analysera. Dessutom är det mer kostnadseffektivt, särskilt om det handlar om stora urvalsnummer. I vårt laboratorium använder vi rutinmässigt transkriptomanalyser med hjälp av mikroarrayteknik för att avgöra vilken roll centrala regleringsnav som styr de molekylära nätverk och vägar som är involverade i tillväxt, utveckling och metabolism av spannmål5,,6,,7,,8,9. Vi använder den också rutinmässigt för att genomföra genomomfattande studier av genuttrycksprofilering för att få en mekanistisk förståelse av spannmålskornens reaktion på abiotiska påfrestningar10,samt i genomförandet av transkriptomomfattande associationsstudier (TWAS) och sammanlänkningskartläggningsstudier för att identifiera gener som ansvarar för spannmålskornskvalitet och näring11,12. Andra grupper har också använt microarray-tekniken för att tillhandahålla utvecklingsspecifik genuttrycksatlas i korn13, ris14,15,16, sorghum17och vete18.

Syftet med denna publikation är att ge en kort textsammanfattning och en detaljerad visuell beskrivning av den metod vi för närvarande använder i vårt laboratorium för transkriptomisk profilering av spannmål med hjälp av en Agilent microarray plattform. Observera att andra microarray-plattformar finns tillgängliga, men kommer inte att omfattas av denna metod. Vi börjar protokollet genom att presentera en detaljerad beskrivning av RNA utvinning från att utveckla eller gro spannmål frön. Baserat på vår erfarenhet, att få en hög kvalitet och hög mängd transkriptom mottagliga för nedströms transkriptomiska analyser är ofta flaskhalsen vid användning av spannmålsfrö vävnader. Vi har provat flera kommersiellt tillgängliga RNA-extraktionssatser, men ingen har gett tillfredsställande resultat. Därför utvecklade vi ett kemiskt extraktionsprotokoll för att få ett grovt RNA-extrakt som sedan utsätts för kolonnrening med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit. Med denna metod får vi rutinmässigt och reproducerbart högkvalitativt RNA2 (figur 1), som kan användas för olika nedströmsapplikationer för att generera en transkriptomprofil.

Protocol

1. Total RNA-extraktion och rening

OBS: Arbeta alltid under rökhuven eftersom denna metod innebär användning av skadliga flyktiga organiska lösningsmedel. Förvärm ett mikrobränslerör av nukleasfritt vatten i 50 °C värmeblock innan du påbörjar experimentet. Detta nukleasfria vatten kommer att användas för att eluera det totala RNA från spinnkolonnen i steg 1.8.

  1. Separat malde proverna, var och en med minst tre biologiska replikat, till ett fint pulver med hjälp av en steriliserad mortel och mortelstöt som är förkyld i flytande kväve.
    1. Skopa de pulveriserade proverna med hjälp av en liten metallspatel doppad i flytande kväve och placera de pulveriserade proverna i 2,0 ml nukleasfria mikrobränslerör, även fördoppade i flytande kväve. Förvara proverna omedelbart i frys med ultralåg temperatur (-80 °C) tills den dag som avsatts för satsextraktion (STOP POINT).
      OBS: Fröprover kan malas till fint pulver med eller utan dehusking. För ris slipar vi rutinmässigt proverna utan att dehusking eftersom skalet innehåller kiseldioxid som kan hjälpa under malningsprocessen.
      VARNING: Detta steg måste göras snabbt och under strikt kryogena förhållanden. Ett alternativ för automatisering är att slipa proverna med hjälp av en kryogen kulkvarn för att minimera RNA-nedbrytning och kvalitetsförsämring.
  2. Få ett råt RNA-extrakt med cirka 200 mg av det ursprungliga pulverprovet. Tillsätt varje prov individuellt i ett nukleafritt mikrobränslerör som innehåller 750 μl RNA-extraktionsbuffert (100 mM Tris, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoetanol) och 500 μL fenol:kloroform:isoamyl (25:24:1).
    1. Blanda alla prover samtidigt i 5 min vid rumstemperatur med hjälp av en flerrörsvirvelblandare inställd på hög hastighet. Håll omedelbart alla rör på is i två minuter.
      VARNING: Arbeta alltid inuti rökhuven, särskilt för alla steg som involverar fenol, kloroform och andra organiska lösningsmedel. Använd helst en bred rökhuva som rymmer en centrifug, virvelblandare, virvelverv och roterande mixer med flera rör.
  3. Separera det råa RNA-extraktet från skräpet genom centrifugering vid 14 000 x g i 10 min. Gör alla centrifugeringssteg i samma inställningar för det här avsnittet.
    1. Överför cirka 800 μl supernatant till ett nytt 2,0 ml mikrobränslerör som innehåller 400 μL 1,2 M NaCl och 700 μl isopropanol. Blanda lösningen försiktigt genom inversion 5x.
    2. Fäll ut RNA genom inkubering i en vanlig (-20 °C) eller frys med ultralåg temperatur (-80 °C), i minst 1 timme (eller över natten).
      STOPP- eller PAUSpunkt: håll bara proverna i vanlig -20 °C-frys för att stanna i några timmar. För natten eller en längre stopppunkt, förvara proverna i frys med ultralåg temperatur (-80 °C).
  4. Få en rå RNA pellet genom centrifugering vid 18.800 x g i 15 min. När du har kasserat supernatanten, rena den råa RNA-pelleten efter kolonnrening med hjälp av en minisats (tabell över material).
    1. Lös upp pelleten i nyberedd 450 μL RLT-buffert (före användning tillsätt 100 μl β-mercaptoetanol per 100 ml RLT-buffert, beredd färsk dagligen). Förbättra upplösningen av alla pellets genom att blanda alla rör vid rumstemperatur i en flerrörsvirvelblandare i minst 5 min.
  5. Rena den upplösta RNA-pelleten genom att passera genom den lila minispinnen med ett 2 ml-uppsamlingsrör. Centrifugera i rumstemperatur i 1 min vid 9000 x g och kasta den lila minispinnen.
    1. Tillsätt 0,5 volym absolut etanol (~225 μL) till den rensade lysate i 2 ml-uppsamlingsröret. Blanda lösningen med samma plastspets genom att pipettera upp och ner några gånger.
  6. Samla upp det renade RNA genom att omedelbart överföra lösningen till en rosa minispinkolonn med ett 2 ml-uppsamlingsrör. Centrifugera vid 9 000 x g i 15 s för att samla in RNA på kiseldioxidmembranet i den rosa minspinkolonnen. Kasta flödet genom och tvätta RNA med 350 μL buffert RW1 genom centrifugering vid 9 000 x g i 15 s.
  7. Avlägsna förorenande genomiskt DNA genom att tillsätta 80 μl utspädd DNase 1 (50 μl fryst DNase-bestånd + 350 μl RDD med hjälp av DNase-setet) direkt på membranet och smälta genom att ruva i rumstemperatur i minst 15 min (PAUSE POINT).
    1. Tvätta av DNase 1 genom att tillsätta 350 μL RW1 och snurra ner vid 9 000 x g i 15 s. Upprepa två gånger, men tvätta den här gången med 500 μl buffert-RPE. Överför till ett nytt 2 ml-uppsamlingsrör och snurra på 9 000 x g i 2 min för att torka.
  8. Överför den torkade spinnkolonnen till ett nytt 1,5 ml nukleasfritt uppsamlingsrör. Påbörja elueringsprocessen för det renade RNA-extraktet genom att tillsätta 50 μl nukleasfritt vatten (förvärvat vid 50 °C) och inkubera i 3 min vid 50 °C värmeblock.
    1. Efter inkubation, eluera det totala RNA-extraktet genom centrifugering vid 9000 x g i 1 min. Placera omedelbart alla prover på is.
  9. Bestäm kvantiteten och kvaliteten på det totala RNA-extraktet genom att köra lämpliga utspädningar (vanligtvis 1:10) i Nanodrop och BioAnalyzer med hjälp av sina respektive tillverkarprotokoll. RNA-extrakt bör åtminstone ha ett RIN-värde på 8,0 och en koncentration på 50 ng/μL. Figur 1 visar ett typiskt resultat för RNA-extrakt från kornblad och frön.
    STOPPPUNKT: Förvara proverna i -80 °C tills de används.

2. cDNA-syntes följt av cRNA-transkription och märkning

OBS: Detta steg är lämpligt för bearbetning av 24 prover samtidigt. Det föreslås att hela steget genomförs kontinuerligt på en dag, men valfria stopp- och pauspunkter identifieras. Var noga med att förvärma tre mikrobränslerörsvärmeblock vid 80 °C, 65 °C och 37 °C innan stegen nedan påbörjas. Dessa temperaturinställningar ändras enligt stegen nedan. Till exempel kommer 37 °C-värmeblocket att ställas in på 40 °C efter att Spike Mix har förberetts (eller om den redan har förberetts tidigare). Förbered enfärgs Spike Mix, T7 Promoter Mix och cDNA-mästermix med hjälp av Quick Amp-märkningssatsen för låg ingångsgentryck (se Tabell över material)baserat på tillverkarens instruktioner. Detta preparat är beroende av mängden start-RNA-extrakt, som vanligtvis sträcker sig från 10 till 200 ng för totalt RNA eller 5 ng för PolyA RNA. Vi använder rutinmässigt 50 ng totalt RNA som utgångsmaterial för microarray hybridisering2 och för den metod som kommer att beskrivas nedan. Vid utarbetandet av en master mix för 24 prover, tillsätt 2 extra reaktioner för att ta hänsyn till pipettering variationer. Använd alltid nukleasfria mikrobränslerör och nukleasfritt vatten i detta steg.

  1. På grund av hög avkastning, späd vanligtvis RNA-extraktet 100-faldigt för att passa inom 50-100 ng-området. Baserat på RNA-kvantifieringsresultaten i steg 1.9, gör en 1:100-utspädning genom att tillsätta 1 μl renat RNA-extrakt till 99 μl nukleasfritt vatten i ett 1,5 ml mikrobränslerör. Bestäm den faktiska koncentrationen av denna utspädning med hjälp av en nanodroppe.
    1. Gör en andra utspädning av varje totalt RNA-prov i 1,5 ml mikrobränslerör för att göra 50 ng av det totala RNA i en slutlig volym på 1,5 μL. Förvara alla prover på is.
  2. Förbered Spike Mix från baserat på tillverkarens instruktioner. Detta steg sammanfattas också i Püffeld et al. 20192. Använd ett 37 °C värmeblock för detta. Förvara den första och andra utspädningen av enfärgsspikblandningen positiva kontroller i en ultralåg temperaturfrys (-80 °C) och gå bara igenom åtta upprepade frys-/töcykler.
    1. Förbered den tredje och fjärde utspädningen färsk dagligen. Tina och förvara den tredje och fjärde utspädningen av spikblandningen på is före användning.
      OBS: Omvandla temperaturen på värmeblocket 37 °C till 40 °C när Spike Mix hade beretts (eller om den tidigare har beretts).
  3. Förbered T7 Promoter Mix och förvara på is före användning. Följande är tillräckligt för 24 prover:
    20,8 μL T7 promotor primer
    + 26,0 μl nukleasfritt vatten
    = 46,8 μl total volym T7 Promoter Mix
  4. Tillsätt 1,8 μl T7 Promoter Primer Mix (steg 2.3) i varje mikrobränslerör som innehåller 1,5 μl 50 ng RNA-prov från steg 2.1. Blanda komponenterna ordentligt genom pipettering flera gånger. Denaturera RNA-mall-primer mix genom inkubering i 65 °C värmeblock i 10 min. Placera omedelbart mikrobränslerören på is som förberedelse för nästa steg.
  5. Vid denaturering av mallprimerblandningen (steg 2.4), förvärma 5x första strandbufferten vid 80 °C i minst 4 min. Förbered snabbt cDNA-syntesen Master Mix från Quick Amp-märkningssatsen med låg ingång (se Tabell över material) baserat på tillverkarens anvisningar. Följande är tillräckligt för 24 reaktioner:
    52,0 μl förvärmd buffert för första delen (steg 2.5)
    + 26,0 μl av 0.1M DTT
    + 13,0 μL 10 mM dNTP-blandning
    + 31,2 μL RNase Block Mix
    = 122,2 μL total volym cDNA-syntes Master Mix
    1. Tina varje komponent på is. Blanda varje komponent genom skonsam pipettering. Förvara Master Mix i rumstemperatur före användning.
      VARNING: RNase Block Mix ska omedelbart placeras tillbaka i frysen -20 °C efter användning.
  6. Ta bort RNA-mall-primerblandningen på is (steg 2.4) och centrifugera en kort stund vid rumstemperatur för att snurra ner allt innehåll till botten av mikrobränsleröret. Fördela 4,7 μl av cDNA Master Mix (steg 2.5) till varje rör, blanda försiktigt genom pipettering upp och ner. Den totala volymen när alla komponenter tillsätts bör vara 8,0 μL.
    1. Syntetisera cDNA för 2 h i 40 °C värmeblock. Under inkubationen på 2 timmar, flytta temperaturen på 65 °C värmeblocket till 70 °C som förberedelse för värmeinaktivering (steg 2.7).
      VALFRI PAUSPUNKT: Förvara proverna vid -80 °C över natten. Experimentet kan fortsätta nästa dag efter värme inaktivering (steg 2.7).
  7. Inkubera varje rör i 70 °C värmeblock i 15 min för att värma upp RNase Block Mix. Överför rören på is omedelbart och inkubera i minst 5 min.
  8. Medan proverna är på is i 5 min (steg 2.7), snabbt förbereda transkription Master Mix. Alla komponenter kan kombineras i rumstemperatur men tina komponenter på is. Följande är tillräckligt för 24 prover:
    19,5 μl nukleasfritt vatten
    + 83,2 μL 5x transkriptionsbuffert
    + 15,6 μL av 0.1M DTT
    + 26,0 μl NTP-blandning
    + 5,5 μl T7 RNA Polymeras blandning
    + 6,2 μl cyanin 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 μL av den totala volymen Transkription Master Mix
    VARNING: T7 RNA Polymeras Blend ska förvaras i frysen -20 °C och placeras tillbaka omedelbart efter användning. Dessutom är Cy3 ljuskänslig. Därför bör blandning (steg 2.9) och dispensering (steg 2.10) ske i svagt ljus. För detta brukar vi stänga av något ljus direkt ovanför labbbänken.
  9. Eftersom rören utsattes för plötslig uppvärmning och kylning (steg 2.7), snurra kort ner innehållet i varje prov med hjälp av en mikrocentrifug för att samla in all vätska längst ner i varje mikrobränslerör. Tillsätt 6 μl transkriptions mastermix (steg 2.8) genom att försiktigt pipettera upp och ner. Den totala volymen av denna reaktion bör vara 16 μL i detta skede. Inkubera rören vid 40 °C i 2 timmar för att generera det Cy3-märkta cRNA-systemet.
    TILLVALSSTOPPPUNKT: Rören kan förvaras vid -80 °C efter transkription.
  10. När du genererar cRNA (steg 2.9) ställer du in värmeblockets temperatur på 55 °C. Tillsätt minst ett mikrobränslerör av nukleasfritt vatten i värmeblocket. Detta nukleasfria vatten kommer att användas för eluering av renat cRNA.
  11. Efter cRNA-transkription och märkning, rena det märkta cRNA med hjälp av ett RNeasy Mini Kit enligt steg 3.

3. cRNA-rening

  1. Rena det märkta cRNA med hjälp av ett RNeasy Mini Kit (se Tabell över material). Förbered buffertarna baserat på tillverkarens anvisningar. Till exempel levereras BufferT RPE i satsen i koncentrerad form. Före användning, tillsätt 4 volymer av molekylärbiologi klass absolut etanol (96-100%).
  2. Tillsätt 84 μl nukleasfritt vatten till varje prov för att justera den totala volymen till 100 μL. Tillsätt sedan 350 μl buffert RLT och 250 μl absolut etanol till varje rör. Blanda noggrant genom pipettering.
  3. Överför 700 μL av varje blandning till en minispinkolonn med ett 2 ml uppsamlingsrör. Samla upp det märkta cRNA-membranet på membranet genom centrifugering vid 4 °C i 30 s vid 7 534 x g. Kassera den genomströmningsvätskan.
  4. Tvätta varje prov i 500 μl buffert-RPE. Centrifugera och kasta genomströmning som i föregående steg. Upprepa det här steget en gång och gå sedan vidare till nästa steg.
  5. Överför minispinkolumnen till ett nytt insamlingsrör. Torka proverna genom centrifugering som i steg 3.3.
  6. Överför minispinkolonnen till ett nukleasfritt 1,5 ml mikrobränslerör som medföljer satsen. Förringa varje märkt cRNA-prov genom att tillsätta 30 μl nukleasfritt vatten (förvärmt vid 55 °C) direkt i membranfiltret. Förbättra elueringen genom att inkubera i 55 °C värmeblock i 60 s.
  7. Samla upp det märkta cRNA-systemet genom centrifugering i rumstemperatur i 30 s vid 7 535 x g. Kasta spinnkolonnen och stäng varje mikrobränslerör. Placera omedelbart varje rör på is.
    VALFRI STOPPPUNKT: Proverna kan förvaras vid -80 °C efter eluering.
  8. Kvantifiera cRNA med Nanodrop med hjälp av microarray-funktionen. Ställ in provet på RNA-40. Erhålla följande värden och registrera i ett kalkylblad: cyanin 3 färgämne koncentration (pmol/μL), RNA absorbansförhållande (260 nm/280 nm) och cRNA-koncentration (ng/μL).
    STOPPPUNKT: Förvara omedelbart cRNA-proverna vid -80 °C efter avläsning.
  9. Beräkna cRNA-avkastningen och den specifika aktiviteten enligt Püffeld et al. 20192.

4. Microarray hybridisering och skanning

OBS: Detta steg tar bara 3-4 h och därmed hybridisering av 24 prover kan startas efter lunch. En operatör kan bekvämt köra upp till 4 bilder (32 prover). Morgonen följande dag tilldelas för tvätt och skanning av mikroarray diabilder. Ytterligare körningar kan sedan utföras på eftermiddagen den andra dagen. Det här steget upprepas tills alla prover hybridiseras och genomsöks. Det rekommenderas starkt att använda färgfria, pulverfria latexhandskar för hantering och bearbetning av diabilderna för att säkerställa att proverna inte är förorenade med färgade pigment som kan störa mikroarrayanalyserna. Förutom kommersiellt tillgängliga mikroarrayer, följande anpassade matriser är utformade av vår grupp och tillgängliga för beställning från Agilent: Orderkod 028827 för korn (Hordeumvulgare), 054269 för ris(Oryzasativa subs. Japonica), 054270 för ris (Oryzasativa subs. Indica) och 048923 för vete (Triticumaestivum).

  1. Utför mikroarrayhybridisering med hjälp av Gene Expression Hybridization Kit (se Tabell över material). Förbered 10x blockerande medel enligt tillverkarens specifikation2. Aliquot 10x blockerande medel i 200 μL portioner och förvara på -20 °C tills användning. Varje alikvot räcker till upp till 40 hybridiseringar och är stabil upp till 2 månader.
  2. På dagen tilldelas för microarray hybridisering, tina en 200 μL alikvot av 10x blockerande agent på is. Dessutom förvärma hybridiseringsugnen till 65 °C och förvärma ett värmeblock till 60 °C för användning under cRNA-fragmentering.
  3. Förbered fragmenteringsmixen för varje prov enligttillverkarens anvisningar 2. I vårt labb använder vi rutinmässigt 600 ng linjärt förstärkt Cy3-märkta cRNA för hybridisering i en 8-pack mikroarray. I det här fallet sammanfattar listan nedan komponenterna i fragmenteringsmixen per prov:
    600 ng linjärt förstärkt cRNA, cyanin 3-märkt
    + 5 μL 10x blockerande medel
    Justera volymen till 24 μL med nukleasfritt vatten
    + 1 μL 25x fragmenteringsbuffert
    = 25 μL av den totala volymen Fragmentering Mix
    1. Blanda proverna försiktigt med hjälp av en virvelblandare. Snurra alla prover kort med hjälp av en mikrocentrifug.
  4. Inkubera alla prover i 60 °C värmeblocket i exakt 30 min. Kyl omedelbart varje rör på is i en minut och fortsätt snabbt till nästa steg.
  5. Om du vill stoppa fragmenteringsreaktionen helt och hållet lägger du till 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM till varje rör. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner, var noga med att inte införa några bubblor under blandning. Vi använder rutinmässigt 25 μl hybridiseringsbuffert för att stoppa fragmenteringsreaktionen för 8-pack mikroarrayformatet.
  6. Centrifugera alla rör i 1 min vid 15 750 x g i rumstemperatur. Placera snabbt alla rör på is och ladda varje prov så fort som möjligt.
  7. Innan du lämnar labbet för 17 h natten inkubation, förbereda hybridisering montering2 som beskrivs i videon.
    1. KRITISKT STEG: Överför varje hybridiseringsblandning och fördela långsamt i mitten av varje packning väl, observera stor omsorg att inte införa några bubblor under dispensering. Vi använder rutinmässigt 44 μL hybridiseringsmix för 8-pack microarray-formatet. Placera även 44 μL 1x hybridiseringsbuffert i oanvända brunnar.
    2. Sätt omedelbart mikroarraybilden med rätt orientering ovanpå packningsbilden. Detta måste göras mycket noggrant för att inte spilla någon vätska. Stäng hybridiseringsenheten ordentligt och rotera den för att kontrollera om inga permanenta luftbubblor har införts. Alla bubblor ska röra sig inom packningsbilden.
  8. Sätt hybridiseringskammaren montering i hybridisering ugnen rotator. Om du använder 2x GEx Hybridization Buffer, ställ in rotationshastigheten på 10 rpm och hybridisera vid 65 °C för exakt 17 timmar.
  9. Tvätta hybridiserade mikroarrayer med hjälp av Gene Expression Wash Buffer Kit (se Tabell över material). Förbered genuttryckstvättbuffertarna 1 och 2 baserat på tillverkarens anvisningar2. Lägg till 2 ml 10% Triton X-102 till båda buffertarna (rent valfritt men rekommenderas starkt för att minska förekomsten av microarray tvätt artefakter)2.
  10. Förbered tre tvättkammaresenheter enligt beskrivningen i föregående publikation2. Uppgifter om varje tvättkammare är tabulerade nedan (tabell 1).
  11. Aliquot 500 ml tvättbuffert 1 i en 1 L reagensflaska och låt stå i rumstemperatur. Förbered en extra 1 L reagensflaska och etikett med "Wash Buffer 1 Reuse" för att spara tvättbufferten från den första kammaren. Dessutom alikvot 500 ml tvättbuffert 2 i en reagensflaska och inkubera i ett 37 °C vattenbad över natten.
    Lämna inte labbet utan att förbereda steg 4.9 till 4.11. De är nödvändiga för tvättsteg nästa dag.
  12. Nästa dag ska tvättbuffertarna förberedas enligt tabell 2. Fyll varje maträtt till tre fjärdedelar av motsvarande buffert. Varje tvättbuffert är bra för upp till 4-5 diabilder.
  13. Efter exakt 17 h av hybridisering, få en hybridisering kammare och demontera på labbbänken fodrad med luddfritt papper som beskrivs i den tidigare publikationen2.
    1. KRITISKT STEG: Överför microarray smörgås till skålen 1. Se till att streckkoden för mikroarray är vänd uppåt i ett lutande läge och undvik att sänka ned hela bilden i bufferten. Hantera varje mikroarray-bild från ändarna och undvik att vidröra den aktiva sidan av bilden.
    2. Separera de två glasrutschbanorna med hjälp av en pincett2. Låt packningen glida försiktigt ner i botten av skål 1, samtidigt som du ser till att mikroarraybilden hålls stadigt för nästa steg.
  14. KRITISKT STEG: Lyft långsamt mikroarrayrukan i sidled och överför omedelbart till mikroarraystället i skål 2 enligt beskrivningen i föregående publikation2. Det är viktigt att mikroarrayrutschbanorna är minimalt utsatta för luft.
    1. Upprepa steg 4.13 och 4.14 tills de åtta bilderna sitter i racket. Fördela mikroarray diabilder jämnt längs racket. Det här steget kan göras av en operator utan hjälp för upp till 4 bilder. Fäst rackhållaren och överför hela Skål 2-inställningen till den första magnetiska omröraren. Rör om försiktigt i exakt 1 min.
  15. Under omrörning i 1 min (steg 4.14), överför skålen 3 från mini 37 °C-inkubatorn och placera ovanpå den andra magnetomröraren. Placera försiktigt tvättbuffert 2 (från vattenbadet 37 °C) på skålen 3. Undvik bubbelbildning medan du häller.
    1. Efter 1 min omrörning är klar (steg 4.14), försiktigt och långsamt lyfta skjutstället från skål 2 och överför till skål 3. Ta bort rackhållaren och rör om i exakt 1 min.
  16. Lyft långsamt och försiktigt skjutstället från skål 3. Var noga med att undvika bildandet av buffertdroppar2. Torka sidorna på varje bild genom att försiktigt röra vid luddfritt papper. Placera varje fläckig bild i en skjutruta och upprepa steg 4.16 tills alla mikroarrayglassar i skjutrutan. Torka i ca 15 min.
    VALFRI STOPPPUNKT
  17. Placera varje mikroarraybild i en bildhållare och se till att streckkoden är vänd uppåt.
    OBS: Ozonnivåerna i mikroarrayrummet bör vara 50 ppb (100 μg/m3) eller mindre. Detta är helt frivilligt men rekommenderas starkt: använd ett ozonbarriärsruklock för att undvika ozoninducerad nedbrytning av cyaninfärgämnen.
  18. Placera de monterade glidhållarna i skanningskarusellen. Läs in proverna i följd, baserat på streckkodsnummer. Skanna bilderna omedelbart med hjälp av en mikroarrayskanner (se Tabell över material),enligt beskrivningen i föregående publikation2.
  19. Efter körningen, ämnes data till funktionen extrahering och QC validering, som beskrivs i den tidigare publikationen2.

Representative Results

Denna metod är optimerad för utvinning av prover av utsäde av spannmål som innehåller betydande mängder förorenande stärkelse eller socker. Den är utformad för att extrahera totalt RNA från 24 fröprover per dag. Det bör utföras kontinuerligt på en dag, men valfria stopp- och pauspunkter identifieras i hela protokollet. Alternativt kan läsaren använda sina föredragna RNA extraktionssatser eller manuell kemisk extraktionsmetod. Men baserat på vår tidigare erfarenhet, kommersiellt tillgängliga växt RNA extraktion kit är inte lämpliga för frön på grund av betydande mängder stärkelse, proteiner, socker och / eller lipid kontaminering. I den beskrivna metoden följs en kemisk extraktion av rå RNA av kolonnrening med hjälp av en kommersiell RNA-extraktionssats. Detta ger vanligtvis RNA med högre kvalitet och avkastning. Figur 1 visar resultatet av en BioAnalyzer-körning för att testa kvaliteten på RNA-extraktion med den metod som beskrivs här. Resultaten presenteras för kornblad (proverna 1 och 2 som representerar prover med låg stärkelsehalt) och kornfrön (proverna 3 och 4 som representerar prover med hög stärkelse). RNA-värdet (RIN) för alla prover är 10.

Figur 1 visar en representativ gel av det renade RNA-extraktet, där kvaliteten testades med hjälp av en Bioanalyzer. Prov 1 och 2 är typiska resultat för prover med låg stärkelsehalt, t.ex. Proverna 3 och 4 är representativa resultat för prover med hög stärkelsehalt, såsom kornfrön, som visar 18S och 28S rRNA. Observera att inget automatiserat RIN-värde kan beräknas för gröna växtvävnader som bladprover, på grund av kloroplast rRNA. Integritet och hög kvalitet kan dock visuellt fastställas genom att avsaknaden av nedbrytningsprodukter, som vanligtvis visas som låg molekylär utstryk. RIN-värdet för prover med högstärkelsefrön, såsom kornfrön, är vanligtvis 10 med hjälp av det protokoll som beskrivs i detta dokument.

Dessutom presenterar vi här också en representativ data av en tid kurs experiment av två elit korn inavlade linjer (Sofiara och Victoriana) som används för analys av maltkvalitet19. Under maltprocessen omvandlas stärkelse till socker. Därför representerar proverna vävnader med varierande proportioner av stärkelse och sockerinnehåll. Eftersom den industriella maltprocessen liknar grobarhetsprocessen analyserades transkriptomerna av två kornlinjer, som skiljer sig åt i sin maltkvalitet. RNA extraherades från groning frön vid 2, 24, 48, 72, 120, 144 och 196 h efter imbibition i biologiska tre exemplar. RNA-beredningen och hybridiseringen till det anpassade kornmikroarraychipet utfördes enligt beskrivningen ovan. Figur 2 anger det normaliserade rutnätet som avlästs från mikroarrayhybridiseringen i rapporten (QC)(bild 3)och histogramområdet för upptäckta signaler. Rutnätet ger exempel på härledda signaler från varje hörn av chipet, inklusive bakgrund och spike-in avläsning punkter som används för kalibrering. Histogrammet indikerar avvikelsen av detekterbara prickar med respektive signalintensiteter. En lyckad hybridisering ger en bred Gaussisk-formad kurva med endast mindre extremvärden som visas i figuren. Misslyckade hybridiseringar kan resultera i en stark förskjutning mot ena sidan ("gröna monster").

Slutligen visas ett representativt resultat av godtagbara värden i kolumn 4 i figur 3. För att ange tillförlitligheten i de utförda experimenten utvärderas resultaten ytterligare med hjälp av GeneSpring-programvaran. De insamlade uppgifterna presenteras som huvudkomponentanalys (PCA). Pca integrerar värdena för utvalda punkter (gener) som vektor. Antalet utvärderade punkter som används kan variera från flera hundra till hela chipet och är beroende av den programvara som används. Varje chip (prov) resulterar i ett värde (vektor) som härrör från de integrerade signalintensiteterna för de analyserade punkterna. Den relativa positionen i diagrammet (PCA) anger därför att proverna är likheten med varandra. Ju närmare proverna är, desto mer lika är de. Tekniska replikat bör ligga närmare varandra än biologiska, och biologiska replikat av ett prov bör samlas närmare varandra än prover från olika tidpunkter, vävnader eller tillstånd.

Figure 1
Figur 1: Electrophoresis filkörning sammanfattning erhålls efter kontroll av kvaliteten på RNA med Bioanalyzer. Proverna 1 och 2 är kornbladsvävnad enligt vad som indikeras av ytterligare ribosomala band från kloroplaster. Proverna 3 och 4 är kornfrövävnad med 18S och 28S rRNA-band. En RIN-faktor beräknas inte alltid för gröna vävnader som blad, men enligt gelen är kvaliteten på RNA mycket god. RIN-värdet för proverna 3 och 4 är 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: QC Rapport från framgångsrika korn microarray hybridisering. A + indikerar detekterade signaler på rutnätet från alla hörn av chipet. Histogrammet visar antalet signaler kategoriseras enligt signalintensitet (fluorescens) som logaritm efter bakgrund subtraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Sammanfattning av kvalitetskontroll (QC) efter hybridisering och skanning. Värdena för den hybridiserade bilden anges i kolumn 2 (värde) och intervallet med godtagbara värden visas i kolumn 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tvättkammare Montering Innehåll och etikett Syfte
Maträtt 1 Tom, lämna på labbbänken tills nästa dag Fyll med tvättbuffert 1 nästa dag, som används för att demontera mikroarrayrutschbanorna
Maträtt 2 Lägg till en microarray slide rack och en liten magnetisk omrörning bar; etikett med "Tvättbuffert 1", lämna på labbbänken till nästa dag Används för att tvätta microarray diabilder med TvättBuffert 1 nästa dag
Maträtt 3 Tillsätt en liten magnetisk omrörstång, etikett med "Wash Buffer 2" och placera i en 37 °C mini inkubator. Används för att tvätta mikroarrayrutschbanorna med tvättbuffert 2 nästa dag inuti 37 °C miniinkubatorn

Tabell 1: Beredning av tvättkammarens sammansättningar.

Steg Maträtt Tvätta buffert Temperatur Tid
Demontering 1 1 Omgivande Så fort som möjligt
(Steg 4.13)
Tvätta först 2 1 Omgivande 1 min
(Steg 4.14)
Andra tvätt 3 2 37 °C 1 min
(Steg 4.15)

Tabell 2: Inkubationstemperatur och tid för tvättkammares sammansättningar.

Discussion

Den beskrivna metoden ger mycket reproducerbara resultat för rna-extrakt av hög avkastning och hög kvalitet (figur 1). Baserat på vår erfarenhet rekommenderar vi tre biologiska replikat för en genotyp, stadium eller tillstånd för analys. För att kunna upptäcka statistiskt meningsfulla skillnader måste det allmänna överflödet av mRNA beaktas. Observera dock att en startmängd på 200 mg vävnadsprover krävs i tre exemplar för RNA-extraktionssteget. För experiment som har en begränsad mängd prover, såsom genetiskt modifierade växtmaterial, kan denna metod därför inte vara lämplig.

Under mikroarrayhybridisering är följande steg mest kritiska: (1) att ladda proverna till packningsbilden (steg 4.7) och (2) tvätta matriserna efter hybridisering (steg 4.13 och 4.14). Provlastning måste göras mycket noggrant för att undvika bubbelbildning och vätskespill. Försiktighet är nödvändigt när mikroarraybilden läggs på packningsbilden som innehåller de laddade proverna: DNA-sidan (med fläckiga sonder) ska vara vänd nedåt för att möjliggöra hybridisering. För att tvätta mikroarrayerna är det andra tvättsteget särskilt kritiskt: här måste du ta bort bilderna från tvättbufferten 2 mycket långsamt (10 s) för att undvika buffertartefakter på bilderna, vilket kan störa datainsamling och analyser.

För att få resultat från hybridiseringsexperimentet som är berättigade till nedströms bioinformatikanalys bör man följa några viktiga kriterier. QC-rapporten, som genereras efter protokollets prestanda ovan, ger en god uppfattning om vad som bör förbättras och vilka data som är i användbart skick (figur 3). Den första information som tas emot är det visualiserade rutnätet (figur 2). Här kan man direkt se om alla områden för fluorescensavläsning är korrekt anpassade. Om det finns en visuellt detekterbar förskjutning, kommer detta att påverka alla andra värden (Bakgrund, signalintensitet, etc.) och avläsningen av detta chip kan inte användas. På överblicken (Rumslig fördelning allra Avvikare), en kan lätt fläcka någon förorening (e.g., damma av eller hår), som påverkade resultatet. Smuts kan avlägsnas genom att mjukt blåsa och skanna chippet. Histogrammet av signalområdet som nämnts ovan bör resultera i en bred Gauss-formad kurva, med endast mindre extremvärden (figur 2). Beroende på vävnaden analyseras (figur 1), denna kurva kan se annorlunda ut och kan tyckas ha två toppar, eller en dominerande topp med en axel. Detta kommer inte att påverka uppgifternas kvalitet. Endast en stark förskjuten topp, eller höga signaler på kanterna indikerar problem, såsom "gröna monster" (för hög fluorescensintensiteter), som inte kan tas bort genom tvätt och bör rapporteras till chiptillverkaren. Dessutom bör "Spatial Distribution graph for Median Signals" variera kring ett gemensamt värde. Detta bör vara i intervallet mellan 40 och 100, beroende på den allmänna intensiteten avläsning av chip analyseras. En annan viktig kvalitetskontroll är utvärderingen av topp i data: Loggdiagrammet för topp i signaler bör resultera i en linjär och regelbunden linje. Slutligen ger tabellen över "utvärderingsmått" en bra och tillförlitlig bild av de mottagna resultaten. Här tillhandahåller tillverkaren en rad värden som kan klassificeras som utmärkta, bra och utvärdera(figur 3). Enligt vår erfarenhet kan vissa värden inte alltid tillämpas för alla marker. För ris anpassade marker, "nonControl värde" var ofta utom räckhåll men påverkar inte signifikant ytterligare databehandling. Dessutom kan intervallet för "NegControl" utökas, baserat på vävnad, organism och allmän produktion av Chip till <80. Intervallet för utvärdering av värde E1 med CV kan utökas till <9, istället för <8 enligt vår erfarenhet. Efter detta är en korrekt utvärdering av alla chip avläsa data möjligt. I allmänhet bör man alltid komma ihåg att oberoende biologiska replikat alltid ger det mest tillförlitliga resultatet.

Fördelen med denna teknik jämfört med andra metoder ligger i det faktum att det representerar en kostnadseffektiv, hög genomströmning metod för transkriptionell profilering. Dessutom är dataanalyspipelinen i efterföljande led lättare och mer etablerad. Trots fördelar finns det vissa begränsningar av denna teknik, såsom antalet gener som kan analyseras. Mikroarrayen kan bara underlätta analysen av gener som tidigare upptäckta sonder på matrisen. Därför är denna teknik endast tillämplig på växtarter med sekvenserade genom och helt kommenterade gener. Vi föreställer oss att de mikroarraybaserade transkriptomikerna kommer att fortsätta att vara mycket användbara och relevanta inte bara för genuttrycksprofilering utan även för andra nedströms bioinformatikpipelpipelar som genreglerande nätverksanalyser och transkriptomomfattande associationsstudie.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har fått stöd inom det tematiska området CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stresstolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, och IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Tyskland. Vi tackar Mandy Püffeld för hennes utmärkta tekniska hjälp och Dr Isabel Maria Mora-Ramirez för att dela information och erfarenhet med vete chip. Vi tackar Dr Rhonda Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Tyskland) för kommentarer och kritiskt läsa manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol		 We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
  3. Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
  4. Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  5. Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
  6. Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
  7. Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
  8. Butardo, V. M. Jr, et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
  9. de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854 (2017).
  10. Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
  11. Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  12. Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4 (2009).
  13. Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
  14. Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
  15. Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
  16. Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
  17. Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35 (2014).
  18. Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
  19. Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106 (2018).

Tags

Biokemi Nummer 159 cDNA-syntes cRNA-märkning mikroarray nukleinsyrahybridisering total RNA-extraktion transkriptom

Erratum

Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 06/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Erhålla högkvalitativa transkriptom data från spannmål frön av en modifierad metod för genuttryck profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Butardo Jr., V. M., Seiler, C.,… More

Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter