Aquí presentamos un método de cribado para inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana (de Thermotoga maritima)basado en la reacción azul de molibdeno en un formato de placa de 96 pocillos.
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Artículo de método
Detección de inhibidores de la pirofosfatasa ligadas a la membrana Thermotoga maritima
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las pirofosfasiasas ligadas a la membrana (mPPases) son enzimas dimericas que se producen en bacterias, arqueas, plantas y parásitos protistas. Estas proteínas clan el pirofosfato en dos moléculas de ortofosfato, que se combina con el bombeo de protones y/o iones de sodio a través de la membrana. Dado que no se producen proteínas homólogas en animales y humanos, los mPPases son buenos candidatos en el diseño de posibles objetivos farmacológicos. Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar inhibidores de mPPase utilizando la reacción azul de molibdeno en un sistema de placa de pozo 96. Utilizamos mPPase de la bacteria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como enzima modelo. Este protocolo es simple y económico, produciendo un resultado consistente y robusto. La medición de la absorbancia tarda sólo una hora en completar el protocolo de ensayo de actividad desde el inicio del ensayo hasta la medición de absorción. Dado que el color azul producido en este ensayo es estable durante un largo período de tiempo, los ensayos posteriores se pueden realizar inmediatamente después del lote anterior, y la absorbancia se puede medir más tarde para todos los lotes a la vez. El inconveniente de este protocolo es que se hace manualmente y por lo tanto puede ser agotador, así como requerir buenas habilidades de pipeteo y mantenimiento del tiempo. Además, la solución de arsénito-citrato utilizada en este ensayo contiene arsnito sódico, que es tóxico y debe tratarse con las precauciones necesarias.
Introducción
Aproximadamente el 25% del total de proteínas celulares son proteínas de membrana y alrededor del 60% de ellas son dianas de fármacos1,2. Uno de los fármacos potenciales se dirige a3, pirofosfatasas ligadas a la membrana (mPPases), son las enzimas dimericas que bombean protones y/o iones de sodio a través de la membrana por hidrólisis de pirofosfato en dos ortofosfatos4. mPPases se pueden encontrar en varios organismos5 tales como bacterias, arqueas, plantas, y parásitos protistas, con la excepción de los seres humanos y animales
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Protocolo
1. Preparación de proteínas
NOTA: La expresión y purificación de TmPPase se ha descrito en otros lugares13.
- Preparar 10 ml de la solución tampón de reactivación que contiene 20 mM 2-(N-morpholino)ácido etanosulfónico (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) glicerol, ditiothreitol de 2 mM (TDT) y 0,05% de dodecil maltoside (DDM).
- Preparar 10 ml de la mezcla de reacción que contiene 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2, 333 mM KCl, y 67 mM NaCl.
NOTA: Se requiere Mg2+ para quelar el pirofosfato ya que el sustrato de mPPase, K+ es necesario para aumentar la actividad enzi....
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Resultados
En este protocolo, se probaron ocho compuestos (1-8)(Figura 2A)junto con IDP, un inhibidor común de las pirofosfalasas, como un control positivo. Cada compuesto se probó a tres concentraciones diferentes (1 M, 5 m y 20 m) en triplicado. El flujo de trabajo del cribado se muestra en la Figura 1,a partir de la preparación de muestras y reactivos hasta la medición de absorbancia a 860 nm.
Al final de este protocolo, tras la adición de la.......
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Discusión
Aquí informamos de un protocolo detallado para el cribado simple de inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana de T. maritima en un formato de placa de 96 pozos basado en Vidilaseris et al.14. Este protocolo es barato y se basa en ácido 12-fosfomolíbódico, que se forma a partir de ortofosfato y molibdato en condiciones ácidas y reducido a especies de fosfomolibdeno con un color azul distintivo12. Este método es preferido sobre otros protocolos, como el en.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Jane y Aatos Erkko y la BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, la Academia de Finlandia (no 308105) a Keni Vidilaseris, (no 310297) a Henri Xhaard, y (no 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, y los Fondos de Investigación de la Universidad de Helsinki a Gustav Boije af Genns. Los autores agradecen a Bernadette Gehl por su ayuda técnica durante el proyecto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lámina de sellado adhesiva | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Heptamolibdato de amonio tetrahidratado | Merck | F1412481 636 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific 130188 | ||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| Tiras de tubo de PCR de 8 pocillos de 0,2 ml sin tapones (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecil maltósido (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Etanol | Merck | 1009901001 | |
| Ácido acético glacial | Merck 1000631011 | ||
| Ácido clorhídrico | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodifosfato sódico sal | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-fosfatidilcolina de lecitina de soja | Sigma | 429415-100GM | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich 8147330500 | ||
| Multiplaca Placas de PCR de 96 pocillos | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan | Go Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Tipo 750) | Labsystems | ||
| Placa de Petri de poliestireno (tamaño 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Cloruro de potasio | Merck | 104936 | |
| Prisma 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Bloque calefactor | Grant Instruments | ||
| Meta-arsenito de sodio | Fisher Chemical | ||
| Fosfato de sodio dibásico (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Pirofosfato de sodio dibásico | Fluka | 71501-100G | |
| Citrato trisódico dihidratado | Fluka | 71404-1KG |
Referencias
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
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Reimpresiones y permisos
